Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Este manuscrito descreve um procedimento experimental de fácil e rápido para determinar interações da proteína-proteína, baseadas na medição da atividade de luciferase.

O objetivo geral deste procedimento é detectar quantitativamente interações proteína-proteína em um sistema de expressão transitória. Essa medida pode ajudar a responder a perguntas-chave em campos de transação de sinal de quan, como monitorar quantitativamente nossas direções de proteína após um tratamento químico ou ambiental. A principal vantagem desta técnica é que ela usa um luminômetro ou uma câmera CCD para detectar a atividade lucífera, que representa a intensidade da direção da proteína para que os resultados sejam mais precisos.

Para iniciar este procedimento, adicione um mililitro de uma solução contendo cinco por cento de hipoclorito de sódio e zero vírgula um por cento de tritão x cem a um tubo de microcentrífuga de um vírgula e cinco mililitros contendo sementes. Deixe a solução descansar por cinco minutos para esterilizar as sementes. Em seguida, lave as sementes com água estéril cinco vezes.

Suspenda as sementes lavadas em duzentos microlitros de água estéril. Usando pontas finas, coloque cuidadosamente as sementes individuais na superfície do meio de ágar MS revestido. Armazene as placas a quatro graus Celsius por três dias para sincronizar a germinação.

Depois disso, mantenha as placas médias em condições normais de crescimento por dez dias. Transfira as mudas em germinação para o solo, tomando cuidado para não danificar as raízes. Cubra a bandeja com uma tampa de plástico transparente durante a noite para manter a umidade.

Cultive as plantas em uma sala de crescimento controlado por sete semanas, quando estarão prontas para a infiltração de agrobacterium tumefaciens. Para começar, entregue cento e cinquenta nanogramas de plasmídeos na cepa GV3101 de células competentes para a-tumefaciens. Coloque os tubos contendo a cultura a-tumefaciens em um shaker e incube por quatro horas.

Usando uma haste de vidro, transfira a cultura dos tubos para os meios LB. Cultivar a-tumefaciens e meio de ágar LB a 28 graus Celsius por quatro dias. Em seguida, prepare-se para inocular uma única colônia de a-tumefaciens de cada placa em seu próprio tubo contendo três mililitros de meio líquido LB.

Agitar a 280 RBM a 28 graus Celsius durante 24 horas para propagar a cultura. Em seguida, transfira 75 microlitros da cultura bacteriana para 15 mililitros de meio líquido LB fresco contendo 15 microgramas por mililitro de canamicina e 50 microgramas por mililitro de rifampicina. Cultive as bactérias a 220 RPM a 30 graus Celsius por aproximadamente 8 horas até que o OD600 esteja entre 0,5 e 1.

Depois disso, transfira a cultura para tubos de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugue a 4000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 15 minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender a palete em 15 mililitros de solução de transformação.

Centrifugue a 4000 vezes a gravidade e 4 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, repita a etapa de suspensão e centrifugação mais uma vez. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender a palete em 5 mililitros de solução de transformação.

Deixe o palete ressuspenso descansar por duas horas em temperatura ambiente em condições escuras. Em seguida, adicione a solução de transformação no OD600 é 0,5 ou combine duas amostras com volume igual para testar interações de proteínas emparelhadas. Usando uma agulha de um mililitro de seringa, infiltre as células suspensas na quarta a sétima folhas.

Depois disso, cubra imediatamente as plantas com uma capa de plástico preta por 12 horas. Em primeiro lugar, as plantas devem ser muito saudáveis para garantir o sucesso. Em segundo lugar, certifique-se de não danificar nenhuma folha durante o processo de infiltração.

Mantenha a bandeja na escuridão por 12 horas. Em seguida, cultive as plantas em condições normais por 2 a 4 dias antes de detectar a atividade da luciferase. Para iniciar o método de imagem, desprenda uma folha infiltrada.

Coloque todo o folheto em um prato de meio de ágar MS. Usando um frasco de spray de 50 mililitros, borrife o tampão de trabalho do luciferon no lado adaxial das folhas. Em seguida, mantenha no escuro por 5 minutos para extinguir a autofluorescência da clorofila.

Use um aparelho de imagem CCD refrigerado com luz mais baixa resfriado a 30 graus Celsius negativos para capturar imagens com um tempo de exposição preenchido com luz de 50 milissegundos e tempo de detecção de luminescência de 1 minuto. Depois disso, corte fragmentos de folhas da área de infiltração das folhas de N-benthamiana. Mergulhe os fragmentos em 100 microlitros de água deionizada nos poços de placa branca de 96 poços.

Adicione dez microlitros de tampão de trabalho de luciferon. Deixe o prato descansar por 5 minutos. Em seguida, execute qualquer tratamento específico desejado para estudar a dinâmica da interação da proteína e meça a luminescência diretamente com um luminômetro comercial.

Aqui é mostrada a demonstração da atividade lucífera para representar as interações COP 1 SPA 1. A atividade lucífera, que é detectada por luminescência, é fotografada pela câmera CCD. As interações COP 1 SPA 1 resultam em mutação de cobre da luciferase funcional.

A atividade da luciferase sob tratamento com Jasmim 8 ao longo do tempo é então determinada. As interações COP 1 SPA 1 representadas pela atividade da luciferase diminuem gradualmente na escuridão. O tratamento com Jasmine 8 reduz ainda mais essas interações.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em 1 semana, depois que as plantas estiverem prontas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as plantas saudáveis. Infiltre as folhas com cuidado e inclua os controles corretamente.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para que pesquisadores na área de transações de sinal explorem a dinâmica da interação proteína-proteína de maneira rápida. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar plantas de tabaco, infiltrar agrobactérias nas folhas de tabaco e detectar atividades lucíferas.