Name: Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprenda a detectar interações proteína-proteína quantitativamente em folhas de Nicotiana benthamiana usando o ensaio de complementação de luciferase. Este método rápido permite monitorar dinamicamente vias de sinalização celular.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação ciência Natural da província Jiangsu (BK20140919), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (31470375), a prioridade acadêmica programa desenvolvimento de Jiangsu instituições de ensino superior e projeto de Lan Qing.

1. preparação de plantas (8 semanas)
<ol><li>Colocar 50 sementes de Nicotiana benthamiana em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo 1 mL de 5% NaClO e solução de 0,1% Triton X-100 (V/V) e deixar por 5 min esterilizar as sementes.</li>
	<li>Lave as sementes com água esterilizada 5 vezes e suspender as sementes em 200 µ l de água estéril.</li>
	<li>Cuidadosamente o lugar individual sementes na superfície do MS-ágar-ágar (1 l: 1 x Murashige & Skoog sais, 10 g de sacarose, pH 5,8 (KOH), 1% de ágar) com dicas bem e loja médio chapas em 4 ° C por 3 dias para sincronizar a germinação. Nota: Para evitar a contaminação de micróbio, execute esta etapa sobre uma bancada limpa. Não é necessário apertar o tubo durante a esterilização.</li>
	<li>Coloque placas médias em condições normais de crescimento (22 ° C, 80-90 µmolm-2s-1 branco intensidade de luz) por 10 dias e depois transferir as mudas germinadas em solo. Nota: Certifique-se de inserir as raízes das mudas no solo e não danificam as raízes. Cubra a bandeja com uma tampa de plástico transparente durante a noite para manter a umidade.</li>
	<li>Cultivar plantas em uma sala de crescimento controlado em uma umidade de ciclo e 70% de luz/escuro h 16/8 h. 7 semanas de idade N. benthamiana plantas estão prontas para a infiltração Agrobacteriumtumefaciens (Figura 1A). Nota: Regar as plantas e controlar pragas como necessário para manter as plantas saudáveis.</li>
</ol>2. expressão transiente em folhas de S. Benthamiana (7-10 dias)
<ol><li>Entregar 150 ng de plasmídeos (plasmídeo controle pEGAD-HA-LUC, vetor vazio e plasmídeo construído para LCI do ensaio, neste caso usamos Nluc-pCAMBIA1300 e pCAMBIA1300-Cluc para construção de plasmídeo) em células competentes da . tumefaciens estirpe GV3101 com um método padrão de eletroporação.</li>
	<li>Cultura a. tumefaciens em Luria-Bertani (LB) ágar médio (1 l: 10 g de NaCl, extrato de levedura 5 g, 10 g triptona, 1,5% de ágar) contendo 50 µ g/mL de canamicina e 50 µ g/mL de rifampicina a 28 ° C, durante 4 dias. Nota: A escolha de antibióticos depende do vetor e a cepa da . tumefaciens usado.</li>
	<li>Inocular uma única colônia da . tumefaciens de cada prato em 3 mL de meio líquido LB, contendo 50 µ g/mL de canamicina e 50 µ g/mL de rifampicina e agitar a 220 rpm a 28 ° C por 24 h propagar a cultura de células.</li>
	<li>Transferência de 75 µ l de cultura bacteriana em 15 mL fresco LB meio líquido contendo 50 µ g/mL de canamicina e 50 µ g/mL de rifampicina, diluindo-a por um fator de 200. Cultura de bactérias em 220 rpm a 30 ° C, durante cerca de 8 h, até OD600 é entre 0,5 a 1,0.</li>
	<li>Transferir a cultura líquida da . tumefaciens em tubos de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 4.000 x g e 4 ° C por 15 min. descartar o sobrenadante e suspender o sedimento em 15 mL de solução de transformação para lavar o sedimento.</li>
	<li>Girar o tubo a 4.000 x g e 4 ° C por 15 min e descartar o sobrenadante. Repita a etapa de lavagem mais uma vez.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 5 mL de solução de transformação e manter por 2 h à temperatura ambiente. Ajuste a densidade de células da . tumefaciens pelota com solução de transformação até a concentração final de OD600 é 0,5, ou mistura duas amostras com igual volume para testes interações proteína emparelhados.</li>
	<li>Infiltrarem células suspensas 4th para 7th folhas com uma seringa de 1 mL auto-injeções (Figura 1B-C). Após a infiltração, cobrir as plantas imediatamente com uma cobertura de plástico preta e coloque o tabuleiro no escuro por 12h. Depois disso, cultivar plantas, como de costume para 2 a 4 dias antes de detectar atividades LUC. Nota: Escolha folhas saudáveis de tamanho similar. A infiltração de quatro zonas diferentes em uma folha está bem.</li>
</ol>3. detecção de atividade de Luciferase (um dia)
Nota: Existem duas maneiras de monitorar a atividade do luciferase. Um é baseado na imagem, e o outro é para medir quantitativamente a atividade de luciferase.
<ol><li>
Método de imagem
	<ol>
<li>Separe uma folha infiltrada e colocar todo o folheto em MS-ágar-ágar.</li>
		<li>Pulverize o buffer de trabalho luciferina na superfície adaxial da folha com um frasco de spray 50 mL. Manter os materiais no escuro por 5 min saciar a autofluorescência da clorofila.</li>
		<li>Use um CCD de refrigeração de pouca luz (resfriados a-30 ° C) de aparelhos de imagem para capturar imagens (Figura 2). O tempo de exposição de luz-arquivado é de 50 ms e tempo de detecção de luminescência é 1 min. Nota: Ajuste os parâmetros de acordo com o manual da máquina. Temperaturas mais baixas irão melhorar a relação sinal-ruído para melhorar a qualidade de imagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativamente, medir a luminescência diretamente com um comercial luminómetro.<ol>
<li>Cuidadosamente corte fragmentos de folhas (cerca de 0,25 cm2) da área de infiltração das folhas N. benthamiana e imergir o disco de folha em 100 µ l de água deionizada em um prato branco de 96 poços (Figura 3).</li>
		<li>Adicionar 10 µ l de tampão de trabalho luciferina e deixar por 5 min. Em seguida, execute tratamentos específicos para estudar a dinâmica da interação da proteína. Nota: Detecta a luminescência com um luminómetro em pontos de tempo diferentes para obter a dinâmica de actividade de luciferase, que representam a cinética de interações da proteína-proteína sob determinados tratamentos. Este método tem vantagens para testar um grande número de pares de proteína simultaneamente. Para aqueles sem um comercial luminómetro, examinar as abundâncias de proteína luciferase pelo borrão ocidental, portanto, referir-se a LUC atividade quantitativamente. Se a luz não é necessariamente obrigatório, apenas manter a placa no luminómetro e medir a luminescência em pontos diferentes do tempo. Caso contrário, mova a placa em uma câmara de crescimento durante a abertura da deteção. Para obter resultados estatisticamente significativos, use pelo menos três repetições biológicas. Embora atividades LUC de zonas de infiltração diferentes irão variar, seus padrões de mudanças são consistentes após a normalização.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thines, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAZ+repressor+proteins+are+targets+of+the+SCF%28COI1%29+complex+during+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 661-665 (2007).</li>
<li>Chini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAZ+family+of+repressors+is+the+missing+link+in+jasmonate+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling.</a> Nature. 448, 666-671 (2007).</li>
<li>Jones, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Border+control--a+membrane-linked+interactome+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis.</a> Science. 344, 711-716 (2014).</li>
<li>Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+network+evolution+in+an+Arabidopsis+interactome+map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map.</a> Science. 333, 601-607 (2011).</li>
<li>Yazaki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+transcription+factor+interactome+networks+using+HaloTag+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).</li>
<li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li>
<li>Walter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40, 428-438 (2004).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+complementation+imaging+assay+for+protein-protein+interactions+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants.</a> Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+protein-protein+interactions+by+thermal+stability+shift+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis.</a> Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).</li>
<li>Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+determination+of+binding+affinity+and+kinetics+using+surface+plasmon+resonance+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors.</a> Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).</li>
<li>Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+repression+of+photomorphogenesis%3A+role+switching+of+COP%2FDET%2FFUS+in+light+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+plant+biology%22%5BJournal%5D)">Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling.</a> Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).</li>
<li>Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+cryptochrome+1+interacts+with+SPA1+to+suppress+COP1+activity+in+response+to+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light.</a> Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).</li>
<li>Lian, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-light-dependent+interaction+of+cryptochrome+1+with+SPA1+defines+a+dynamic+signaling+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism.</a> Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).</li>
<li>Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light-dependent+interaction+of+CRY2+with+SPA1+regulates+COP1+activity+and+floral+initiation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 21, 841-847 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo descrito aqui é simples e reproduzíveis para estudar na vivo interações da proteína-proteína e particularmente adequado para a detecção dinâmica da interação da proteína sob tratamento exógeno. A etapa chave neste ensaio é infiltração N. benthamiana . Para garantir o sucesso de infiltração, as plantas devem ser muito saudáveis. Outro fator crítico é quando verificar a actividade do luciferase após infiltração. Não há nenhuma resposta correta para esta questão. Os investigadores são incentiva...

A fim de coordenar o crescimento com seu ambiente, as plantas evoluíram elegantes vias de sinalização para sentir, transduce e responder a sinais de sinalização. Como os corredores em uma corrida de revezamento, as proteínas são necessários jogadores na transdução de sinal da planta. Foi amplamente reconhecido que a interação da proteína-proteína (PPI) desempenha um papel importante para a comunicação celular. Degradação, acetilação e fosforilação de proteínas são todos dependentes da interação física entre uma proteína do alvo e suas enzimas modificando. Por exemplo, Jasmonate ZIM-domínio da proteína (JAZ) família proteínas interage com um factor de transcrição MYC2... e suprimir sua atividade transcricional1,2. Dada a importância do PPI, proteínas em grande escala interactomes em plantas têm sido recentemente exploraram3,4,5. Estes resultados interactome mais revelam a complexa rede de regulamentação que coordena diversas funções celulares.
Existem algumas abordagens estabelecidas para o monitoramento de PPI. O fermento dois híbridos (Y2H) é o método mais utilizado para a deteção de PPI. Y2H é fácil de executar e apropriado para um teste rápido examinar interações da proteína. Y2H é também amplamente utilizado para a seleção de parceiros de interação desconhecida para o proteína de interesse específico. No entanto, porque Y2H é inteiramente realizado em fermento, ele não pode refletir o cenário real em planta células e traz altas taxas de falsas positivas. Outra estratégia semelhante é o ensaio de suspenso. Em geral, duas proteínas são expressas e purificadas de células de Escherichia coli misturadas e imobilizadas para detectar interações da proteína. Embora este método não é demorado, isso não é possível obter na vivo resultados de interação também. Para fins de interação na vivo , co-imunoprecipitação (co-IP) é o ensaio mais popular, que exige o anticorpo de alta qualidade para immunoprecipitate o proteína de interesse e não pode excluir a possibilidade de IPP indireta. Além disso, devido os procedimentos experimentais complicados em co-IP, os resultados geralmente variam com a experiência individual.
Ensaios de reconstituição do repórter baseado grandemente avançam a detecção de na vivo PPI. Estes métodos incluem fluorescência ressonância energia transferência (FRET)6, fluorescência bimolecular complementação (BiFC)7e a complementação de luciferase de vaga-lume de imagem (ICM) ensaio8. Embora essas três abordagens são melhor do que co-IP para refletir o direto na vivo PPI, FRET e BiFC precisam de microscópios específicos para detectar sinais de fluorescência e facilmente não podem quantificar a intensidade de interação. Em contraste, a LCI tira proveito da luciferase de vaga-lume, que irá brilhar após reagir com sua Luciferina de substrato. Mais importante, intensidade PPI pode ser determinada do valor da atividade de luciferase. Assim, a LCI não só indica se duas proteínas interagem ou não, mas também fornece informações sobre a dinâmica de interação com o tratamento. Embora existam alguns métodos estabelecidos para monitorar a interação dinâmica (baseada em turnos de ressonância ou thermo-estabilidade de plasmon de superfície)9,10, essas abordagens requerem instrumentos delicados ou rotulagem específica. Em contraste, a LCI é mais fácil de executar e detectar.
O princípio para a LCI é que as metades amino-terminal e carboxila-terminal de luciferase (chamado N-Luc ou C-Luc, respectivamente) foram fundidos com a proteína A e B e estes dois fusion proteínas simultaneamente foram expressos em células vegetais. Se A proteína interage com a proteína B, então, as duas metades da luciferase vão ser reconstituídas para ser uma enzima luciferase ativo. Atividade do luciferase pode ser detectada com um luminómetro ou CCD da câmera. Não é necessário obter transformants estável para LCI; expressão transiente é suficiente para obter um resultado de interação de alta qualidade.
ANEL-tipo E3 ubiquitina ligase constitutiva photomorphogenic 1 (COP1) interage com uma miríade de fatores de transcrição e promove sua degradação através do Proteassoma 26S11. Alguns desses fatores de transcrição COP1-alvo são os reguladores positivos para Fotomorfogénese. No escuro, COP1 interage com supressor de fitocromo A-105 1 (SPA1), que aumenta a atividade de E3 COP18. Após a percepção de luz, fotorreceptores irão revogar a interação COP1-SPA1 para inibir a atividade COP1 e depois estabilizar COP1 substratos12,13,14. Este exemplo ilustra a importância biológica da PPI a estudar e determinar a dinâmica do PPI.

<table><tbody><tr><td><forte>Solução de transformação</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Ácido morfolineetanossulfônico</td><td>VETEC</td><td>V900336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>27,8 mM Glicose</td><td>VETEC</td><td>V900392</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl2&times; 6H2O</td><td>VETEC</td><td>V900020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>150 &mu; M Acetosiringona</td><td>ALDRICH</td><td>D134406&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pH 5.7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luciferina funcionando tampão</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM Sal de Luciferina Potássio</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>0.025% Triton X-100</td><td>VETEC</td><td>V900502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>H2O a 10 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

luciferase complementação imaging ensaio em folhas de nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Interações da proteína-proteína são mecanismos fundamentais para a retransmissão de transdução de sinal em processos mais celulares; Portanto, a identificação dos pares de interação da proteína-proteína do romance e monitoração dinâmica da interação da proteína são de particular interesse por revelar como as plantas respondem a fatores ambientais e/ou sinais do desenvolvimento. Uma infinidade de abordagens foram desenvolvidas para examinar as interações da proteína-proteína, seja in vitro ou em vivo. Entre eles, a complementação de luciferase recentemente estabelecida de imagem (ICM) ensaio é o método mais simples e mais rápido para demonstrar na vivo interações da proteína-proteína. Neste ensaio, proteína ou proteína B está fundida com a metade de amino-terminal ou carboxila-terminal de luciferase, respectivamente. Quando a proteína A interage com a proteína B, as duas metades da luciferase vão ser reconstituídas para formar uma enzima luciferase funcional e activa. Atividade do luciferase pode ser gravada com um luminómetro ou CCD da câmera. Em comparação com outras abordagens, o ensaio LCI mostra interações da proteína-proteína, tanto qualitativa como quantitativamente. Infiltração de Agrobacterium em folhas de Nicotiana benthamiana é um sistema amplamente utilizado na expressão de proteínas transitória. Com a combinação de LCI e expressão transiente, essas abordagens mostram que a interação física entre COP1 e SPA1 foi gradualmente reduzida após o tratamento jasmonate.

Três etapas principais podem ser apontadas no presente protocolo de complementação do luciferase para o estudo da proteína-proteína interações na vivo, incluindo o crescimento das plantas, infiltração de tabaco e o ensaio de luciferase. A etapa mais crucial neste protocolo está infiltrando líquido a. tumefaciens em folhas de s. benthamiana (Figura 1).
Aqui está um exemplo ...

Este manuscrito descreve um procedimento experimental de fácil e rápido para determinar interações da proteína-proteína, baseadas na medição da atividade de luciferase.

Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar quantitativamente interações proteína-proteína em um sistema de expressão transitória. Essa medida pode ajudar a responder a perguntas-chave em campos de transação de sinal de quan, como monitorar quantitativamente nossas direções de proteína após um tratamento químico ou ambiental. A principal vantagem desta técnica é que ela usa um luminômetro ou uma câmera CCD para detectar a atividade lucífera, que representa a intensidade da direção da proteína para que os resultados sejam mais precisos.Para iniciar este procedimento, adicione um mililitro de uma solução contendo cinco por cento de hipoclorito de sódio e zero vírgula um por cento de tritão x cem a um tubo de microcentrífuga de um vírgula e cinco mililitros contendo sementes. Deixe a solução descansar por cinco minutos para esterilizar as sementes. Em seguida, lave as sementes com água estéril cinco vezes.Suspenda as sementes lavadas em duzentos microlitros de água estéril. Usando pontas finas, coloque cuidadosamente as sementes individuais na superfície do meio de ágar MS revestido. Armazene as placas a quatro graus Celsius por três dias para sincronizar a germinação.Depois disso, mantenha as placas médias em condições normais de crescimento por dez dias. Transfira as mudas em germinação para o solo, tomando cuidado para não danificar as raízes. Cubra a bandeja com uma tampa de plástico transparente durante a noite para manter a umidade.Cultive as plantas em uma sala de crescimento controlado por sete semanas, quando estarão prontas para a infiltração de agrobacterium tumefaciens. Para começar, entregue cento e cinquenta nanogramas de plasmídeos na cepa GV3101 de células competentes para a-tumefaciens. Coloque os tubos contendo a cultura a-tumefaciens em um shaker e incube por quatro horas.Usando uma haste de vidro, transfira a cultura dos tubos para os meios LB. Cultivar a-tumefaciens e meio de ágar LB a 28 graus Celsius por quatro dias. Em seguida, prepare-se para inocular uma única colônia de a-tumefaciens de cada placa em seu próprio tubo contendo três mililitros de meio líquido LB.Agitar a 280 RBM a 28 graus Celsius durante 24 horas para propagar a cultura. Em seguida, transfira 75 microlitros da cultura bacteriana para 15 mililitros de meio líquido LB fresco contendo 15 microgramas por mililitro de canamicina e 50 microgramas por mililitro de rifampicina. Cultive as bactérias a 220 RPM a 30 graus Celsius por aproximadamente 8 horas até que o OD600 esteja entre 0,5 e 1.Depois disso, transfira a cultura para tubos de centrífuga de 15 mililitros. Centrifugue a 4000 vezes a gravidade e quatro graus Celsius por 15 minutos. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender a palete em 15 mililitros de solução de transformação.Centrifugue a 4000 vezes a gravidade e 4 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, repita a etapa de suspensão e centrifugação mais uma vez. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender a palete em 5 mililitros de solução de transformação.Deixe o palete ressuspenso descansar por duas horas em temperatura ambiente em condições escuras. Em seguida, adicione a solução de transformação no OD600 é 0,5 ou combine duas amostras com volume igual para testar interações de proteínas emparelhadas. Usando uma agulha de um mililitro de seringa, infiltre as células suspensas na quarta a sétima folhas.Depois disso, cubra imediatamente as plantas com uma capa de plástico preta por 12 horas. Em primeiro lugar, as plantas devem ser muito saudáveis para garantir o sucesso. Em segundo lugar, certifique-se de não danificar nenhuma folha durante o processo de infiltração.Mantenha a bandeja na escuridão por 12 horas. Em seguida, cultive as plantas em condições normais por 2 a 4 dias antes de detectar a atividade da luciferase. Para iniciar o método de imagem, desprenda uma folha infiltrada.Coloque todo o folheto em um prato de meio de ágar MS. Usando um frasco de spray de 50 mililitros, borrife o tampão de trabalho do luciferon no lado adaxial das folhas. Em seguida, mantenha no escuro por 5 minutos para extinguir a autofluorescência da clorofila.Use um aparelho de imagem CCD refrigerado com luz mais baixa resfriado a 30 graus Celsius negativos para capturar imagens com um tempo de exposição preenchido com luz de 50 milissegundos e tempo de detecção de luminescência de 1 minuto. Depois disso, corte fragmentos de folhas da área de infiltração das folhas de N-benthamiana. Mergulhe os fragmentos em 100 microlitros de água deionizada nos poços de placa branca de 96 poços.Adicione dez microlitros de tampão de trabalho de luciferon. Deixe o prato descansar por 5 minutos. Em seguida, execute qualquer tratamento específico desejado para estudar a dinâmica da interação da proteína e meça a luminescência diretamente com um luminômetro comercial.Aqui é mostrada a demonstração da atividade lucífera para representar as interações COP 1 SPA 1. A atividade lucífera, que é detectada por luminescência, é fotografada pela câmera CCD. As interações COP 1 SPA 1 resultam em mutação de cobre da luciferase funcional.A atividade da luciferase sob tratamento com Jasmim 8 ao longo do tempo é então determinada. As interações COP 1 SPA 1 representadas pela atividade da luciferase diminuem gradualmente na escuridão. O tratamento com Jasmine 8 reduz ainda mais essas interações.Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em 1 semana, depois que as plantas estiverem prontas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as plantas saudáveis. Infiltre as folhas com cuidado e inclua os controles corretamente.Após seu desenvolvimento, essa técnica abre caminho para que pesquisadores na área de transações de sinal explorem a dinâmica da interação proteína-proteína de maneira rápida. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar plantas de tabaco, infiltrar agrobactérias nas folhas de tabaco e detectar atividades lucíferas.

luciferase-complementation-imaging-assay-nicotiana-benthamiana-leaves

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este artigo ilustra como usar corretamente o BioRad Helios Gene Gun para introduzir DNA plasmidial em células epidérmicas de cebola e como testar para interações proteína-proteína em células de cebola com base no princípio de Complementação de fluorescência Bimolecular...

Bimolecular de fluorescência de Complementação Assay (BiFC) para Interação Proteína-Proteína em células de cebola Utilizando o Gene Gun Helios

Nós desenvolvemos uma técnica para testar interações proteína-proteína na planta. A proteína fluorescente amarela (YFP) é dividido em dois fragmentos não-sobrepostas. Cada fragmento é clonado em-frame de um gene de interesse através do sistema Gateway, permitindo a expressão de proteínas de fusão. Reconstituição do sinal YFP só ocorre quando as proteínas interagem inquérito.

Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

Este vídeo demonstra o ensaio de complementação de luciferase dividida para detectar interações proteína-proteína. Neste ensaio, as proteínas de interesse são marcadas em pequenos e grandes fragmentos da enzima luciferase. Quando as proteínas interagem, os fragmentos grandes e pequenos se combinam para formar um complexo enzimático ativo, que na presença de um substrato específico, libera luminescência brilhante que pode ser medida.

Ensaio de complementação de luciferase dividida para identificar interações proteína-proteína específicas

Produção de proteína transiente em plantas de Nicotiana baseado na infiltração de vácuo com Agrobacterium levando vetores de lançamento (Tobacco mosaic vírus-base) é uma abordagem rápida e econômica para a produção de antígenos vacinais e proteínas terapêuticas. Nós simplificamos o processo e melhorado acumulação alvo, otimizando as condições de cultivo de bactérias, a seleção de espécies hospedeiras, e co-introdução de RNA silenciar supressores.

Otimização e Utilização de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada produção de proteína transiente em<em&gt; Nicotiana</em

A formação de complexos de proteína in vivo, podem ser visualizados por fluorescência bimolecular complementação. Parceiros de interacção são fundidas com as peças complementares de marcas fluorescentes e transitoriamente expressa em folhas de tabaco, resultando num sinal fluorescente reconstituído na estreita proximidade das duas proteínas.

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

No nível subcelular, os eventos de sinalização são modulados dinamicamente por pistas ambientais e de desenvolvimento. Aqui descrevemos um protocolo que emprega o sistema de expressão transitória do tabaco para monitorar a interação dinâmica proteína-proteína e revelar a organização espacial da transdução de sinal em células vegetais.

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

O protocolo aqui apresentado destina-se a demonstrar a ocorrência de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi com n- e/ou C-termini expostos citoplasma em células de mamíferos vivos usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida.

Demonstração de Complexos Heterologos formados por Proteínas de Membrana Tipo III de Golgi-Residente usando Ensaio de Complementação de Luciferase Dividida

Descrevemos aqui um método simples de expressão, extração e purificação de IgG humano recombinante fundido ao GFP em Nicotiana benthamiana. Este protocolo pode ser estendido à purificação e visualização de inúmeras proteínas que utilizam cromatografia de coluna. Além disso, o protocolo é adaptável ao laboratório de ensino presencial e virtual universitário, proporcionando exploração baseada em projetos.

Produção de Proteínas IgG Fusion Transitóriamente Expressa em Nicotiana benthamiana

Aqui apresentamos, um método para visualizar a formação do complexo ternário entre três parceiros proteicos usando proteínas com marca fluorescente pelo ensaio FRET-FLIM baseado em BiFC. Este método é valioso para estudar complexos de interação proteína-proteína in vivo.

Determinação da interação tripartite entre dois monômeros de um fator de transcrição da caixa MADS e uma proteína de sensor de cálcio por Ensaio BiFC-FRET-FLIM

A transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) é uma técnica de imagem para detectar interações proteicas em células vivas. Aqui, um protocolo FRET é apresentado para estudar a associação de enzimas modificadoras de histona com fatores de transcrição que as recrutam para os promotores alvo da regulação epigenética da expressão gênica em tecidos vegetais.

Investigando interações entre enzimas modificadoras de histonas e fatores de transcrição in vivo por transferência de energia de ressonância de fluorescência

Este protocolo descreve a seleção de marcadores plasmodésmicos ideais para análises baseadas em microscopia confocal de direcionamento de proteínas para plasmodesmos durante interações vírus-plasmodesmos ou transporte plasmodesmal.

Análise por microscopia confocal da classificação de proteínas para plasmodesmos em Nicotiana benthamiana

Aprenda a detectar interações proteína-proteína quantitativamente em folhas de Nicotiana benthamiana usando o ensaio de complementação de luciferase. Este método rápido permite monitorar dinamicamente vias de sinalização celular.

Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína (Vídeo) | JoVE Journal

Luciferase complementação Imaging ensaio em folhas de Nicotiana benthamiana de transitoriamente determinação dinâmica da interação da proteína-proteína

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