Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids

Apresentamos os protocolos para isolamento de estruturas 3D intestinais do tecido em vivo e em vitro matriz de porão embutido organoids e fixação de diferentes detalhes e protocolos otimizados para imuno-rotulagem dos microtúbulos, de coloração proteínas centrosomal e juncionais, bem como célula marcadores incluindo a proteína de células-tronco Lgr5.

O objetivo geral deste procedimento é isolar organoides intestinais incorporados na matriz basal 3D in vitro e, posteriormente, fixar e imunomarcar os microtúbulos e os organoides centrossômicos proteins. 3D in vitro são modelos ideais para estudar questões biológicas importantes em biologia celular e do desenvolvimento. Mas a localização de proteínas e estruturas endógenas em modelos 3D é mais complexa do que em culturas 2D.

É importante ressaltar que o fixador precisa preservar a delicada arquitetura 3D e, ao mesmo tempo, preservar a antigenicidade do anticorpo. Os métodos apresentados incluem isolamento, fixação e imunomarcação de organoides intestinais 3D in vitro. Mas os protocolos de fixação e imunomarcação também podem ser usados em tecidos isolados ex vivo.

A principal vantagem do protocolo de fixação de formaldeído e metanol apresentado é que ele preserva as estruturas 3D ao mesmo tempo em que preserva a antigenicidade. Ele permite uma boa penetração e depuração de anticorpos tevel pós-fixados para uma marcação eficaz de microtúbulos, filamentos de actina e proteínas de ligação e várias proteínas centrossomais, incluindo ninein. Demonstrando o procedimento estarão a doutora Deborah Goldspink, uma pós-doutoranda formal em meu laboratório, e a doutora Zoe Matthews, coautora.

Após o isolamento das criptas intestinais e vilosidades, estruturas epiteliais isoladas podem ser fixadas para imunocoloração. As criptas isoladas podem ser assentadas alternadamente em cúpulas de matriz que formarão organoides. Após aproximadamente cinco a sete dias de incubação, os organoides terão se formado.

Use 500 microlitros de RT-PBS para lavar os poços que contêm as cúpulas da matriz do embasamento com organoides. Em seguida, adicione 250 microlitros de solução de recuperação de células frias a cada poço. Em seguida, usando uma micropipeta P1000, raspe as cúpulas da matriz do embasamento e pipete cuidadosamente para cima e para baixo em todo o poço para quebrar e remover a matriz do porão do plástico.

Certifique-se de que a solução de recuperação esteja fria para ajudar a quebrar a matriz. Ao raspar, use apenas uma micropipeta P1000 para não quebrar os organoides e que eles permaneçam intactos. Colete o sobrenadante em tubos de microcentrífuga de baixa ligação de 1,5 mililitro.

Em seguida, inverta o tubo várias vezes e verifique ao microscópio às vezes com ampliação de 50 graus se os organoides foram isolados, estão se movendo livremente e não estão em aglomerados. Pulverizar os organoides por centrifugação a 1 000 g e à temperatura ambiente durante cinco minutos. Em seguida, remova o reagente de recuperação e prossiga imediatamente para a fixação.

Para fixar organoides previamente isolados com formaldeído e metanol, ressuspenda os organoides em solução fixadora de metanol de formaldeído a 20 graus Celsius negativos. Incube os organoides a menos 20 graus Celsius em um freezer por 15 minutos, invertendo o tubo a cada cinco minutos. Em seguida, peletizar os organoides por centrifugação a 1.000 g durante cinco minutos.

Remova o fixador e adicione a solução de lavagem consistindo de PBS com soro de 1% de espécies de anticorpos secundários ou PBS com 0,1% de detergente e 1% de soro. Depois de peletizar a amostra como antes, remova a solução de lavagem e ressuspenda a amostra em solução de lavagem fresca. Use um rotador de tubo para lavar as células por um total de uma hora, peletizando os organoides por centrifugação a cada 15 minutos e substituindo a solução de lavagem.

Para bloquear as amostras de organoides intestinais, adicione 10% de soro de espécies de anticorpos secundários ao PBS. Esfolar os organoides a 1 000 g durante cinco minutos e remover o sobrenadante. Adicionar um mililitro de solução de bloqueio a cada amostra a ser incubada nos diferentes anticorpos.

Em seguida, incube as amostras e a solução de bloqueio em um rotador de tubo à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, dilua os anticorpos primários em PBS contendo 10% de soro e 0,1% de detergente. Em seguida, depois de girar as amostras e remover a solução de bloqueio, use a solução de anticorpo primário para ressuspender o pellet organoide.

Gire os tubos a 20 RPM e quatro graus Celsius durante a noite para manter os organoides em suspensão. No dia seguinte, traga as amostras de volta à temperatura ambiente no rotador do tubo por uma hora. Depois de girar a amostra, remova a solução primária de anticorpos, adicione um mililitro de solução de lavagem a cada tubo e ressuspenda os grânulos organoides.

Em seguida, remova imediatamente a solução por centrifugação. Adicione um mililitro de solução de lavagem fresca e misture as células em um rotador de tubo a 20 RPM por duas horas. Em seguida, dilua os anticorpos secundários em PBS com 1% de soro e 0,1% de detergente.

Em seguida, após a peletização do tecido, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de solução de anticorpo secundário. Incube os tubos em um rotador de tubos em temperatura ambiente por uma hora. Depois de girar e remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet em solução de lavagem e centrifugue imediatamente as amostras para granular os organoides.

Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de solução de lavagem fresca. Misture as amostras em um rotador de tubo em temperatura ambiente por 1,5 a duas horas, trocando a solução de lavagem a cada 20 a 30 minutos, conforme descrito anteriormente. Para montar os organoides, depois de girar e remover toda a solução de lavagem, adicione duas gotas de meio de montagem de secagem dura com reagente antidesbotamento ao pellet.

Corte a extremidade de uma micropipeta P200 e ressuspenda cuidadosamente o pellet no meio de montagem. Ao ressuspender organoides fixos e manchados no meio de montagem, tome cuidado para não introduzir bolhas. Se houver bolhas, deixe-as flutuar para a superfície e evite transferi-las para a lâmina.

Use a micropipeta para dispensar os organoides com meio de montagem em uma linha ao longo do centro de uma lâmina de microscópio. Em seguida, coloque cuidadosamente uma tampa de vidro por cima e evite gerar bolhas. Coloque a lâmina de vidro em um livro de slides e guarde na geladeira durante a noite para que o meio de montagem endureça antes de analisar em um microscópio confocal.

Aqui são mostradas imagens da fração dois do tecido isolado do intestino delgado contendo vilosidades e criptas e uma amostra da fração três contendo principalmente criptas. Como visto nessas imagens, uma boa preservação e marcação de microtúbulos e actina em vilosidades e criptas foi alcançada com o protocolo de fixação e imunomarcação de formaldeído metanol descrito neste vídeo. Os organoides do intestino delgado foram gerados e cultivados na matriz basal por três semanas ou mais, depois isolados conforme demonstrado neste vídeo.

As células diferenciadas dentro dos domínios das vilosidades organoides contêm microtúbulos apicobasais estáveis que foram bem marcados na maioria dos casos. EB1 também pode ser visto ao longo da rede dos microtúbulos. Aqui é mostrado um organoide no estágio de cisto e em um estágio inicial de desenvolvimento de criptas.

Ambas as amostras foram fixadas em metanol de formaldeído e imunomarcadas para microtúbulos e ninein, o que demonstra boa preservação e marcação dos microtúbulos em centros organizadores de microtúbulos apicais não centrossômicos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada com várias amostras e ao longo de dois dias. Ao tentar este procedimento, é importante raspar cuidadosamente os poços ao coletar organoides para evitar interromper sua estrutura 3D.

Além disso, tenha cuidado ao adicionar ou remover soluções para evitar a perda de organoides durante o procedimento de coloração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como consertar, imunomarcar e montar organoides isolados e outras estruturas epiteliais, como criptas intestinais. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes fixadores neste procedimento pode ser extremamente perigoso.

Avaliações de risco deste procedimento devem ser realizadas e medidas de contenção apropriadas e EPI devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.