Name: Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a isolar e fixar organoides intestinais 3D para imunomarcação de microtúbulos e proteínas centrosomais. Este protocolo preserva a arquitetura tridimensional e a antigenicidade para estudos em biologia celular.

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Os autores graças a Paul Thomas para assistência e conselhos de microscópio. Este trabalho envolvido aqui foi apoiado pelo BBSRC (conceder n. BB/J009040/1 M.M.M. e TW).

<ol><li>Bacallao, R., Antony, C., Dotti, C., Karsenti, E., Stelzer, E. H., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+during+the+formation+of+a+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of Madin-Darby canine kidney cells during the formation of a polarized epithelium.</a> J Cell Biol. 109 (6 Pt 1), 2817-2832 (1989).</li>
<li>Bellett, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+and+minus-end+capture+at+adherens+junctions+is+involved+in+the+assembly+of+apico-basal+arrays+in+polarised+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end and minus-end capture at adherens junctions is involved in the assembly of apico-basal arrays in polarised epithelial cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 893-908 (2009).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Mackie, J. B., Prescott, A. R., Nathke, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adenomatous+polyposis+coli+protein+unambiguously+localizes+to+microtubule+plus+ends+and+is+involved+in+establishing+parallel+arrays+of+microtubule+bundles+in+highly+polarized+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in establishing parallel arrays of microtubule bundles in highly polarized epithelial cells.</a> J Cell Biol. 157 (6), 1041-1048 (2002).</li>
<li>Mogensen, M. M., Tucker, J. B., Stebbings, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polarities+indicate+that+nucleation+and+capture+of+microtubules+occurs+at+cell+surfaces+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polarities indicate that nucleation and capture of microtubules occurs at cell surfaces in Drosophila.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1445-1452 (1989).</li>
<li>Sanchez, A. D., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-organizing+centers%3A+from+the+centrosome+to+non-centrosomal+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-organizing centers: from the centrosome to non-centrosomal sites.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ninein+is+essential+for+apico-basal+microtubule+formation+and+CLIP-170+facilitates+its+redeployment+to+non-centrosomal+microtubule+organizing+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Ninein is essential for apico-basal microtubule formation and CLIP-170 facilitates its redeployment to non-centrosomal microtubule organizing centres.</a> Open Biol. 7 (2), (2017).</li>
<li>Verissimo, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mutant+RAS+in+patient-derived+colorectal+cancer+organoids+by+combinatorial+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting mutant RAS in patient-derived colorectal cancer organoids by combinatorial drug screening.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Young, M., Reed, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+a+Model+for+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Colorectal+Cancer+Rep%22%5BJournal%5D)">Organoids as a Model for Colorectal Cancer.</a> Curr Colorectal Cancer Rep. 12 (5), 281-287 (2016).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+conditional+and+reversible+gene+knockouts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step generation of conditional and reversible gene knockouts.</a> Nat Methods. 14 (3), 287-289 (2017).</li>
<li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR%2FCas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li>
<li>Goldspink, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+end-binding+protein+EB2+is+a+central+regulator+of+microtubule+reorganisation+in+apico-basal+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The microtubule end-binding protein EB2 is a central regulator of microtubule reorganisation in apico-basal epithelial differentiation.</a> Journal of Cell Science. 126 (17), 4000-4014 (2013).</li>
<li>Yoneda, M., Molinolo, A. A., Ward, J. M., Kimura, S., Goodlad, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Device+to+Rapidly+Prepare+Whole+Mounts+of+the+Mouse+Intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine.</a> J Vis Exp. (105), e53042(2015).</li>
<li>Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+of+retroviral+infection+in+primary+intestinal+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture.</a> J Vis Exp. (90), e51765(2014).</li>
<li>Coquelle, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIS1%2C+CLIP-170%27s+key+to+the+dynein%2Fdynactin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway.</a> Mol Cell Biol. 22 (9), 3089-3102 (2002).</li>
<li>Belshaw, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+methylation+in+individual+colonic+crypts+reveal+aging+and+cancer-related+field+defects+in+the+morphologically+normal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA methylation in individual colonic crypts reveal aging and cancer-related field defects in the morphologically normal mucosa.</a> Carcinogenesis. 31 (6), 1158-1163 (2010).</li>
<li>Whitehead, R. H., VanEeden, P. E., Noble, M. D., Ataliotis, P., Jat, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditionally+immortalized+epithelial+cell+lines+from+both+colon+and+small+intestine+of+adult+H-2Kb-tsA58+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditionally immortalized epithelial cell lines from both colon and small intestine of adult H-2Kb-tsA58 transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (2), 587-591 (1993).</li>
<li>Hamilton, K. L., Butt, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transport+into+everted+sacs+of+the+small+intestine+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Physiol+Educ%22%5BJournal%5D)">Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice.</a> Adv Physiol Educ. 37 (4), 415-426 (2013).</li>
<li>Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+EB1+is+important+for+proper+assembly%2C+dynamics%2C+and+positioning+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle.</a> J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).</li>
</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Isolamento do tecido intestinal Isolamento de pequenas criptas intestinais e vilosidades e criptas do cólon envolve expor a superfície da mucosa, o tratamento com solução de EDTA para afrouxar a centrifugação, fracionamento (agitação) e contatos do celular. O protocolo de isolamento apresentado vilosidades intestinais/cripta foi modificado de Belshaw et al e Whitehead et al. 17 , 18
Expondo a superfície da mucosa Nós já experimentou uma série de abordagens para expor a superfície da mucosa do tracto intestinal no desenvolvimento deste procedimento. É uma abordagem clássica para evert (volta de dentro para fora) o tubo, geralmente em segmentos de cerca de 100 mm de comprimento, usar uma haste de metal que é pego em uma dobra do tecido em uma extremidade e, em seguida, o tubo restante deslizou sobre o tubo19. Para o tecido do mouse, uma haste de metal (2,4 mm de diâmetro) com extremidades arredondadas é ideal. Esta abordagem tem a vantagem de expandir a superfície da mucosa, permitindo melhor acesso a PBS e EDTA. Nós inicialmente usado esta abordagem, mas mudou-se para cortar o tubo em comprimentos curtos (cerca de 5 cm) e abertura de cada seção com tesoura de dissecação, como isto revelou-se mais fácil. Esta abordagem é apropriada, se apenas alguns intestinos são necessários; Mas se fossem mais animais para ser usado em um experimento então um dispositivo desenvolvido especificamente para cortar o tubo no sentido longitudinal, como descrito por Yoneda et al 14 seria mais eficiente.
Destacamento de vilosidades e criptas da camada muscular Inicialmente usamos 3 mM EDTA em PBS e tempos de incubação relativamente longo de até 60 min. para soltar a superfície da mucosa do tecido subjacente17,18. Nessa concentração de EDTA, encontramos que um tempo de incubação de 30 minutos foi suficiente para soltar as criptas do cólon de rato. No entanto, para o isolamento de cripta/das vilosidades do intestino delgado, tentámos usando EDTA mais concentrado para um tempo mais curto, o que provou para ser uma abordagem eficiente. Todo o trabalho posterior foi realizado com tecido extraído usando a técnica de 30 mM EDTA gerando fracções relevantes para vilosidades ou criptas. Para criptas, normalmente juntássemos frações 3-5 antes da fixação, mas é importante verificar se estas são as frações apropriadas como os timings vão depender de uma série de fatores tais como a posição ao longo do trato intestinal, idade do rato, a inflamação, a dieta anterior , etc. da mesma forma, o comprimento de tempo que o tecido precisa ser abalada após o tratamento de EDTA para ser eficaz pode variar em diferentes condições. O resultado é frações isoladas de tecido contendo uma mistura de vilosidades e criptas ou principalmente vilosidades ou criptas (Figura 2). Como não há nenhum vilosidades no cólon, a extração de cripta pode ser realizável em uma única etapa agitando o tecido no tubo por 30 s. Estas frações podem ser fixadas e processadas para imuno-rotulagem.
Isolamento de organoids intestinal de matriz de porão Isolamento de organoids de porão cúpulas de matriz pode ser conseguido usando solução de recuperação celular. A solução funciona por depolymerizing a matriz de porão gelificada, mas a temperatura deve ser de 2-8 ° C. Uma nota de cautela é que microtúbulos dinâmicos não podem ser preservados. Assim, por imuno-rotulagem dos microtubules dinâmicos e + dicas de como a célula de EBs, recuperação de matrix porão antes da fixação não é recomendada. No entanto, a maioria dos microtúbulos nas células de diferenciação organoides é relativamente estável e estes foram preservados (Figura 6). Também funcionou bem para imuno-rotulagem de proteínas centrosomal e juncionais, bem como marcadores de célula.
Protocolos de fixação Formaldeído (acabado de PFA) é um fixador de ação relativamente rápida que forma reversível ligações cruzadas e 4% PFA funciona bem, por exemplo, em microtúbulos imuno-rotulagem e gama-tubulina e coloração filamentos de actina com faloidina. Mais diluir soluções PFA como 1% trabalhado bem para imuno-rotulagem, por exemplo, com o marcador de célula de marcadores Lgr5 e Paneth células estaminais CD24 dentro do nicho de células-tronco da cripta, enquanto altas concentrações de PFA não funcionou.
A adição de glutaraldeído dá melhor preservação de microtúbulos e a fixação de PHEMO chamada, que consiste de uma mistura de 3,7% PFA, glutaraldeído 0,05% e 0,5% de detergente na PHEMO buffer (tubos de 68 mM, 25mm HEPES, 15mm EGTA e 3 milímetros de MgCl2)2 Dá excelente preservação dos microtúbulos sem comprometer a antigenicidade. Também funciona bem para imuno-rotulagem gama-tubulina, β-catenina e E-caderina e coloração filamentos de actina com faloidina. No entanto, em tecido 3D e organoides culturas, a fixação de PHEMO produzido resultados inconsistentes e, portanto, não foi usada.
O metanol é um coagulante fixador que dá relativamente boa penetração e tende a preservar a antigenicidade. Fixação com metanol 100% (-20 ° C) introduz um encolhimento, dá a preservação da morfologia moderada e trabalha para os microtúbulos, + dicas e muitos anticorpos centrosomal incluindo 8h30 em culturas de células 2D. No entanto, alguns organoids entrou em colapso quando usando este método de fixação. Além disso, penetração de anticorpos através de toda criptas, vilosidades ou organoids inicialmente era um problema, mas a adição de 0,1% de detergente para a solução de lavagem e lavagem prolongada alcançado resultados melhores.
Uma combinação de formol e metanol anteriormente tinha sido usada por Rogers et al . 20 a EB1 imuno-rótulo em drosófila. Um protocolo de fixação com base em uma mistura de formol e metanol, portanto, foi desenvolvida para tecido intestinal e organoids com base em 3% formol e 97% de metanol refrigerados a-20 ° C, mas omitindo o carbonato de sódio 5 mM da mistura que foi usado por Rogers et al. 20 além disso, as amostras foram fixadas em freezer a-20 ° C. Isto trabalhou particularmente bem para imuno-etiquetar + dicas, como CLIP-170 e o EBs, mas também se mostrou excelente para fixação e imuno-rotulagem microtúbulos e actina no tecido e 3D organoids. Muito boa preservação estrutural era evidente e antigenicidade foi preservada para várias proteínas do citoesqueleto e associadas, bem como centrosomal proteínas tais como a gama-tubulina e 8h30, apesar de rotulagem para 8h30 trabalhou mais consistentemente com metanol fixação.

Formação de epitélios com polaridade ápico-basal é um processo fundamental no desenvolvimento e envolve uma reorganização dramática dos microtúbulos e proteínas centrosomal. Uma matriz radial do microtubule emanando de um localização central microtubule centrosomal organizando o centro (MTOC) é proeminente em muitas células animais e isso é bem adequado para células relativamente planas. Em contraste, as células epiteliais colunares, como as do intestino, montam matrizes de microtubule transcellular não-radial que suportam melhor a forma e funções especializadas dessas células. Esta reorganização dramática dos microtúbulos é conseguida a centrossoma movendo-se para o ápice e apicais MTOCs não-centrosomal (n-MTOCs), formando-se, que se torna responsável pela fixação dos microtúbulos transcellular1,2 , 3 , 4 , 5.
Muito do nosso conhecimento de diferenciação epitelial e a reorganização do microtubule associado vem de investigações de 2D em vitro camadas celulares que não exibem a arquitetura do tecido na vivo . Desenvolvimento de culturas em 3D em vitro organoides, precurssores Clevers e colegas de trabalho6, representa um grande avanço tecnológico, como eles imitam na vivo arquitetura e desenvolvimento. Uma hierarquia de diferenciação epitelial é evidente no intestino; células-tronco na parte inferior da criptas originar trânsito imaturo, amplificando as células que se proliferam e se diferenciam gradualmente como eles migram até a cripta para o pequena vilosidades intestinais ou a superfície do cólon, onde eles se tornam totalmente diferenciados antes de ser galpão para o lúmen,7. Importante, isto é replicado no organoids intestinal, onde as células desde o nicho de células-tronco se proliferam formando cistos que posteriormente geram cripta, como botões com células-tronco na parte inferior e a diferenciação que gradualmente progredindo em relação à região de cisto, que se torna, como vilosidades8. Os organoides intestinal, portanto, representa um poderoso modelo para estudar não só microtubule e reorganização centrosomal durante a diferenciação epitelial, mas inúmeras outras proteínas, bem como fornecendo uma plataforma ideal para a seleção de medicamentos e alimentos compostos de potencial terapêutico beneficia9,10.
Organoids são bem adaptados para viver-imagens de proteínas fluorescentes-etiquetadas ambos TOC- e em organoids de mata-mata pode ser gerado usando CRISPR/Cas9 gene edição11,12. No entanto, estabelecer a expressão e a localização das proteínas endógenas a ser estudado é importante, especialmente para verificar o comportamento das proteínas marcados. Organoids 3D imuno-rotulagem cultivados em matriz de porão ou ex vivo isolado tecido é mais complexo do que as células cultivadas em pratos de cultura em 2D. O protocolo de fixação precisa preservar a arquitetura 3D delicada de organoids, ainda preservando a antigenicidade de anticorpo (ou seja, os epítopos para anticorpos de ligação). Por exemplo, paraformaldeído 4% (PFA) é comumente usado como um fixador mas enquanto é um fixador agindo de forma relativamente rápida e dá boa preservação morfológica, em nossa experiência frequentemente resulta em perda de antigenicidade e não é adequado para muitos anticorpos centrosomal. A capacidade do fixador e anticorpos de penetrar tecidos e estruturas 3D também deve ser considerada. Para este fim, modificamos e protocolos desenvolvidos para isolamento de tecido e indireta imuno-rotulagem de organoids 3D em vitro e ex vivo isolaram tecido intestinal. Descrevemos como isolar pequenas criptas intestinais e villi e tecido do cólon e incluem um protocolo para a isolação de organoids 3D como uma alternativa para fixação e imuno-rotulagem dentro da matriz do porão. Apresentamos três protocolos alternativos de fixação para imuno-rotulagem de microtúbulos e proteínas centrosomal, tais como 8h30 e microtubule proteínas de rastreamento plus-final (+ dicas), como as proteínas do EB e CLIP-170 (Veja também referências8, 13). Também discutimos os prós e contras associados com cada protocolo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Fosfato tampolado com solução salina (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td>lavagem e</td></tr><tr><td>solução de recuperação de células</td> PFA <td>Corning</td><td>354253</td><td>isolado organoides</td></tr><tr><td>lobind tubos de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>30108116</td><td>evitar que as células grudem</td></tr><tr><td>0,5 M Solução EDTA, pH 8,0</td><td>Sigma</td><td>03690-100ML Isolamento de</td><td>cripta</td></tr><tr><td>70 &mu; filtro de células m</td><td>Fisher Scientific</td><td>11517532</td><td>Isolate criptas de vilosidades</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>detergente</td></tr><tr><td>soro de cabra</td><td>Sigma</td><td>G6767</td><td>agente bloqueador</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td> <td>Sigma</td><td></td><td>usado como agente antiaderente</td></tr><tr><td>Paraformaldeído, 4% em PBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61899</td><td>fixador</td></tr><tr><td>Solução de formaldeído (36.5&ndash; 38% em H2O)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>usado como fixador</td></tr><tr><td>Metanol 99,9% Grau analítico</td><td>Fisher</td><td>M/4000/17</td><td>usado como fixador</td></tr><tr><td>MaxFluor Mouse on Mouse Kit de Detecção de Imunofluorescência</td><td>Maxvision Biosciences</td><td>MF01-S</td><td>kit de imunofluorescência comercial; para reduzir a marcação não específica</td></tr><tr><td>Rotator SB2 ou SB3</td><td>Stuart</td><td></td><td>rotador de tubo de microcentrífuga</td></tr><tr><td>Recuperação de antígeno</td><td>de citrato</td><td></td><td></td> de sódio</tr><tr><td>Hydromount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-106</td><td>mountant</td></tr><tr><td>DABCO - 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octanagem</td><td>Sigma</td><td>D27802</td><td>agente anti-desbotamento</td></tr><tr><td>Permanente Carregado Positivo, Pré-Lavado, 90 Graus Bordas do Solo</td><td>Clareza</td><td>N/C366</td><td>slides</td></tr><tr><td>Lamínula de vidro - espessura nº 1, 22 x 50 mm</td><td>Clarity</td><td>NQS13/2250</td><td>lamínulas</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Matriz de porão para cultura de organoides 3D</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>para processamento de tecidos/organoides</td></tr><tr><td>Tubos cônicos de 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td>para processamento de tecidos/organoides</td></tr><tr><td>Tubos LoBind de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td>para organoides isolados</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal anti-E-caderina</td><td>de camundongo BD Biosciences</td><td>610181</td><td>anticorpo primário 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal anti-tubulina YL1/2 de rato</td><td>Abcam</td><td>ab6160</td><td>anticorpo primário 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo alfa-tubulina de coelho</td><td>Abcam</td><td>ab15246</td><td>anticorpo primário 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-beta-actina de coelho</td><td>Abcam</td><td>ab8227</td><td>anticorpo primário 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de rato anti-p150 Colado</td><td>BD Bioscience</td><td>610473/4</td><td>anticorpo primário 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal de EB3KT36 de rato</td><td>Abcam</td><td>ab53360</td><td>anticorpo primário 1:200</td></tr><tr><td>Monoclonal de camundongo EB1 anticorpo</td> BD <td>Bioscience</td><td>610535</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Lgr5 de coelho</td><td>Abgent</td><td>AP2745d</td><td>anticorpo primário 1:100</td></tr><tr><td>Dylight anti-rato 488</td><td>Jackson</td><td>112545167</td><td>anticorpo secundário 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-camundongo 488</td><td>Jackson</td><td>ST115545166</td><td>anticorpo secundário 1:400</td></tr><tr><td>Dylight anti-coelho 647</td><td>Jackson</td><td>111605144</td><td>secundário anticorpo 1:400</td></tr></tbody></table>

imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas centrosomal em tecido intestinal ex vivo e 3d em vitro intestinal organoids

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

O advento do 3D em vitro organoids que imitam a arquitetura de tecido na vivo e morfogênese avançou grandemente a capacidade de estudar questões biológicas centrais da biologia celular e do desenvolvimento. Além disso, organoids juntamente com os recentes avanços técnicos no gene edição e entrega do gene viral promete avançar a pesquisa médica e desenvolvimento de novos medicamentos para tratamento de doenças. Organoids crescida em vitro na matriz de porão fornecer sistemas poderoso modelo para estudar o comportamento e a função de várias proteínas e são bem adaptados para viver-imagens de proteínas fluorescentes-etiquetadas. No entanto, estabelecer a expressão e a localização das proteínas endógenas no tecido ex vivo e in vitro organoids é importante para verificar o comportamento das proteínas marcados. Para este fim temos desenvolvido e modificado o isolamento do tecido, fixação e imuno-rotulagem protocolos para localização de microtúbulos, centrosomal e associado as proteínas no tecido intestinal ex vivo e em vitro organoids intestinal. O objetivo foi para o fixador preservar a arquitetura 3D do organoids/tecido ao mesmo tempo preservar a antigenicidade do anticorpo e permitindo boa penetração e apuramento de fixador e anticorpos. Exposição ao frio depolymerizes todos, mas os microtúbulos estáveis e isto foi um fator chave ao modificar os diversos protocolos. Nós achamos que aumentar a ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) concentração do ácido de 3 mM a 30 mM deu descolamento eficiente das vilosidades e criptas no intestino delgado, enquanto 3 mM EDTA foi suficiente para criptas do cólon. O protocolo de fixação de formaldeído/metanol desenvolvidos deu muito boa preservação estrutural, preservando também a antigenicidade para rotulagem eficaz de actina, microtúbulos e proteínas (EB) a fim. Também trabalhou para a proteína centrosomal 8h30 embora o protocolo de metanol mais consistentemente trabalhado. Estabelecemos ainda mais que a fixação e imuno-rotulagem de microtúbulos e proteínas associadas poderiam ser alcançadas com organoids isolado do ou permanecendo dentro da matriz do porão.

Apresentamos os protocolos para isolamento de estruturas 3D intestinais do tecido em vivo e em vitro matriz de porão embutido organoids e fixação de diferentes detalhes e protocolos otimizados para imuno-rotulagem dos microtúbulos, de coloração proteínas centrosomal e juncionais, bem como célula marcadores incluindo a proteína de células-tronco Lgr5.

Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar organoides intestinais incorporados na matriz basal 3D in vitro e, posteriormente, fixar e imunomarcar os microtúbulos e os organoides centrossômicos proteins. 3D in vitro são modelos ideais para estudar questões biológicas importantes em biologia celular e do desenvolvimento. Mas a localização de proteínas e estruturas endógenas em modelos 3D é mais complexa do que em culturas 2D.É importante ressaltar que o fixador precisa preservar a delicada arquitetura 3D e, ao mesmo tempo, preservar a antigenicidade do anticorpo. Os métodos apresentados incluem isolamento, fixação e imunomarcação de organoides intestinais 3D in vitro. Mas os protocolos de fixação e imunomarcação também podem ser usados em tecidos isolados ex vivo.A principal vantagem do protocolo de fixação de formaldeído e metanol apresentado é que ele preserva as estruturas 3D ao mesmo tempo em que preserva a antigenicidade. Ele permite uma boa penetração e depuração de anticorpos tevel pós-fixados para uma marcação eficaz de microtúbulos, filamentos de actina e proteínas de ligação e várias proteínas centrossomais, incluindo ninein. Demonstrando o procedimento estarão a doutora Deborah Goldspink, uma pós-doutoranda formal em meu laboratório, e a doutora Zoe Matthews, coautora.Após o isolamento das criptas intestinais e vilosidades, estruturas epiteliais isoladas podem ser fixadas para imunocoloração. As criptas isoladas podem ser assentadas alternadamente em cúpulas de matriz que formarão organoides. Após aproximadamente cinco a sete dias de incubação, os organoides terão se formado.Use 500 microlitros de RT-PBS para lavar os poços que contêm as cúpulas da matriz do embasamento com organoides. Em seguida, adicione 250 microlitros de solução de recuperação de células frias a cada poço. Em seguida, usando uma micropipeta P1000, raspe as cúpulas da matriz do embasamento e pipete cuidadosamente para cima e para baixo em todo o poço para quebrar e remover a matriz do porão do plástico.Certifique-se de que a solução de recuperação esteja fria para ajudar a quebrar a matriz. Ao raspar, use apenas uma micropipeta P1000 para não quebrar os organoides e que eles permaneçam intactos. Colete o sobrenadante em tubos de microcentrífuga de baixa ligação de 1,5 mililitro.Em seguida, inverta o tubo várias vezes e verifique ao microscópio às vezes com ampliação de 50 graus se os organoides foram isolados, estão se movendo livremente e não estão em aglomerados. Pulverizar os organoides por centrifugação a 1 000 g e à temperatura ambiente durante cinco minutos. Em seguida, remova o reagente de recuperação e prossiga imediatamente para a fixação.Para fixar organoides previamente isolados com formaldeído e metanol, ressuspenda os organoides em solução fixadora de metanol de formaldeído a 20 graus Celsius negativos. Incube os organoides a menos 20 graus Celsius em um freezer por 15 minutos, invertendo o tubo a cada cinco minutos. Em seguida, peletizar os organoides por centrifugação a 1.000 g durante cinco minutos.Remova o fixador e adicione a solução de lavagem consistindo de PBS com soro de 1% de espécies de anticorpos secundários ou PBS com 0,1% de detergente e 1% de soro. Depois de peletizar a amostra como antes, remova a solução de lavagem e ressuspenda a amostra em solução de lavagem fresca. Use um rotador de tubo para lavar as células por um total de uma hora, peletizando os organoides por centrifugação a cada 15 minutos e substituindo a solução de lavagem.Para bloquear as amostras de organoides intestinais, adicione 10% de soro de espécies de anticorpos secundários ao PBS. Esfolar os organoides a 1 000 g durante cinco minutos e remover o sobrenadante. Adicionar um mililitro de solução de bloqueio a cada amostra a ser incubada nos diferentes anticorpos.Em seguida, incube as amostras e a solução de bloqueio em um rotador de tubo à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, dilua os anticorpos primários em PBS contendo 10% de soro e 0,1% de detergente. Em seguida, depois de girar as amostras e remover a solução de bloqueio, use a solução de anticorpo primário para ressuspender o pellet organoide.Gire os tubos a 20 RPM e quatro graus Celsius durante a noite para manter os organoides em suspensão. No dia seguinte, traga as amostras de volta à temperatura ambiente no rotador do tubo por uma hora. Depois de girar a amostra, remova a solução primária de anticorpos, adicione um mililitro de solução de lavagem a cada tubo e ressuspenda os grânulos organoides.Em seguida, remova imediatamente a solução por centrifugação. Adicione um mililitro de solução de lavagem fresca e misture as células em um rotador de tubo a 20 RPM por duas horas. Em seguida, dilua os anticorpos secundários em PBS com 1% de soro e 0,1% de detergente.Em seguida, após a peletização do tecido, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de solução de anticorpo secundário. Incube os tubos em um rotador de tubos em temperatura ambiente por uma hora. Depois de girar e remover o sobrenadante, ressuspenda o pellet em solução de lavagem e centrifugue imediatamente as amostras para granular os organoides.Em seguida, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de solução de lavagem fresca. Misture as amostras em um rotador de tubo em temperatura ambiente por 1,5 a duas horas, trocando a solução de lavagem a cada 20 a 30 minutos, conforme descrito anteriormente. Para montar os organoides, depois de girar e remover toda a solução de lavagem, adicione duas gotas de meio de montagem de secagem dura com reagente antidesbotamento ao pellet.Corte a extremidade de uma micropipeta P200 e ressuspenda cuidadosamente o pellet no meio de montagem. Ao ressuspender organoides fixos e manchados no meio de montagem, tome cuidado para não introduzir bolhas. Se houver bolhas, deixe-as flutuar para a superfície e evite transferi-las para a lâmina.Use a micropipeta para dispensar os organoides com meio de montagem em uma linha ao longo do centro de uma lâmina de microscópio. Em seguida, coloque cuidadosamente uma tampa de vidro por cima e evite gerar bolhas. Coloque a lâmina de vidro em um livro de slides e guarde na geladeira durante a noite para que o meio de montagem endureça antes de analisar em um microscópio confocal.Aqui são mostradas imagens da fração dois do tecido isolado do intestino delgado contendo vilosidades e criptas e uma amostra da fração três contendo principalmente criptas. Como visto nessas imagens, uma boa preservação e marcação de microtúbulos e actina em vilosidades e criptas foi alcançada com o protocolo de fixação e imunomarcação de formaldeído metanol descrito neste vídeo. Os organoides do intestino delgado foram gerados e cultivados na matriz basal por três semanas ou mais, depois isolados conforme demonstrado neste vídeo.As células diferenciadas dentro dos domínios das vilosidades organoides contêm microtúbulos apicobasais estáveis que foram bem marcados na maioria dos casos. EB1 também pode ser visto ao longo da rede dos microtúbulos. Aqui é mostrado um organoide no estágio de cisto e em um estágio inicial de desenvolvimento de criptas.Ambas as amostras foram fixadas em metanol de formaldeído e imunomarcadas para microtúbulos e ninein, o que demonstra boa preservação e marcação dos microtúbulos em centros organizadores de microtúbulos apicais não centrossômicos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada com várias amostras e ao longo de dois dias. Ao tentar este procedimento, é importante raspar cuidadosamente os poços ao coletar organoides para evitar interromper sua estrutura 3D.Além disso, tenha cuidado ao adicionar ou remover soluções para evitar a perda de organoides durante o procedimento de coloração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como consertar, imunomarcar e montar organoides isolados e outras estruturas epiteliais, como criptas intestinais. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes fixadores neste procedimento pode ser extremamente perigoso.Avaliações de risco deste procedimento devem ser realizadas e medidas de contenção apropriadas e EPI devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

immuno-fluorescent-labeling-microtubules-centrosomal-proteins-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo descreve a técnica de coloração imunofluorescente de organoides intactos de câncer de próstata e sua imagem por microscopia confocal de montagem total. Esta técnica tem como objetivo avaliar a capacidade de diferenciação ex vivo de células epiteliais basais e luminais da próstata.

Imagem de imunofluorescência de montagem total: uma técnica de fixação e coloração para avaliar organoides intactos

Este vídeo ilustra um método baseado em imunofluorescência para visualizar células de tufo intestinal em criossecções de jejuno de camundongo flutuantes. Dentro das vilosidades intestinais, a co-localização da fluorescência verde na ponta luminal com uma massa radicular vermelha estendida indica a presença de células de tufo.

Um método baseado em imunofluorescência para visualização de células de tufo em criosseções de jejuno

A tecnologia de imagem aprimorada está permitindo imagens tridimensionais de órgãos durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos todo um sistema de cultura de órgãos que permite imagens ao vivo das vilosidades em desenvolvimento no intestino fetal de camundongo.

Rato Fetal Whole Intestino Sistema de Cultura para Ex Vivo Manipulação de vias de sinalização e tridimensional Imagens ao vivo de Desenvolvimento Villus

O sistema nervoso entérico (ENS) é uma rede de neurônios e glia localizada na parede intestinal que controla os reflexos intestinais. Este protocolo descreve métodos para registrar a atividade de neurônios entéricos e glia em preparações vivas de ENS usando imagens de Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imagem do Sistema Nervoso Entérico

O transparente c. elegans intestino pode servir como uma"em vivo câmara de tecido" para estudar a biogênese de membrana e lúmen apicobasal nível unicelular e subcellular durante tubulogenesis multicelulares. Este protocolo descreve como combinar padrão de rotulagem, genética/perda--função de RNAi e abordagens microscópicas para dissecar esses processos em um nível molecular.

O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

Este protocolo descreve a medição da permeabilidade da barreira epitelial em tempo real seguir tratamento farmacológico em organoids intestinal humana, usando microscopia fluorescente e vive microscopia de célula.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Kuga et al descobriram que anticorpos específicos de fosforilação-estatuto contra a ligação actina proteína girdin fosforilado em tirosina 1798 (pY1798) podem ser usados para rotular o topete células (TCs). Este protocolo permite visualização robusta de SCT usando coloração imunofluorescente de jejuno flutuantes cryosections com anticorpos pY1798.

Uso de anticorpos Antifosfo-girdin Visualizar células intestinais topete no Mouse flutuante Jejunum Cryosections

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

Aqui, apresentamos um protocolo para microscopia óptica-eletrônica correlativa otimizada em secção baseada em marcação endógena fluorescente como uma ferramenta para investigar a localização de proteínas raras em relação à ultraestrutura celular. O poder desta abordagem é demonstrado pela localização ultraestrutural da CL3 endógena em células famintas sem tratamento com Bafilomicina.

Localização ultraestrutural da CL3 endógena por microscopia óptica-eletrônica correlativa em seção

Aqui descrevemos a construção de um sistema básico de linhagem celular intestinal tridimensional (3D) e um protocolo de inclusão em parafina para avaliação microscópica de luz de equivalentes intestinais fixos. A coloração de proteínas selecionadas permite a análise de múltiplos parâmetros visuais de um único experimento para uso potencial em estudos pré-clínicos de triagem de drogas.

Sistema Modelo Intestinal Tridimensional Básico (3D) com um Componente Imunológico

Apresentamos um protocolo passo a passo para imagens tridimensionais de alta resolução, sem rótulos e tridimensionais usando holotomografia de baixa coerência. Este protocolo detalha a preparação da cultura de organoides, aquisição de imagens e análise computacional de imagens, permitindo a visualização em tempo real da dinâmica estrutural e respostas a medicamentos em organoides vivos.

Imagens 3D de alta resolução e sem rótulos e análise de aprendizado de máquina de organoides intestinais por meio de holotomografia de baixa coerência

Aprenda a isolar e fixar organoides intestinais 3D para imunomarcação de microtúbulos e proteínas centrosomais. Este protocolo preserva a arquitetura tridimensional e a antigenicidade para estudos em biologia celular.

Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids (Vídeo) | JoVE Journal

Imuno-fluorescente rotulagem de microtúbulos e proteínas Centrosomal em tecido Intestinal Ex Vivo e 3D em Vitro Intestinal Organoids

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