Investigando os prejudiciais efeitos de baixa pressão Plasma esterilização na sobrevivência de esporos de Bacillus subtilis usando Live celular microscopia

O objetivo geral deste conjunto de métodos consecutivos é visualizar e monitorar os parâmetros de vitalidade no reparo do DNA na reanimação de esporos de Bacillus subtilis após o tratamento com plasma de baixa pressão usando microscopia de fluorescência confocal resolvida no tempo e microscopia eletrônica de varredura. Nosso método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da Inativação e Esterilização Microbiana. Isso nos ajuda a analisar o efeito prejudicial do tratamento com plasma de baixa pressão em indicadores biológicos, como esporos de Bacillus subtilis.

A principal vantagem de nossa técnica é que combinamos vários métodos de determinação de visualização, microscopia eletrônica de varredura e monitoramento do reparo do DNA usando microscopia de fluorescência de resultado de tempo para verificar o efeito prejudicial do tratamento com plasma de baixa pressão. Para realizar a produção de esporos, transfira uma cultura noturna de cinco mililitros da respectiva cepa de B. subtilis suplementada com antibióticos apropriados para 200 mililitros de meio de esporulação de shafer líquido de dupla força e cultive-a com aeração vigorosa a 37 graus Celsius por pelo menos 72 horas ou mais até que mais de 95% da cultura tenha sido esporulada. Colha os esporos em tubos de 15 mililitros por centrifugação a 3000 G durante 15 minutos e purifique as amostras utilizando H2O destilado estéril em repetidas etapas de lavagem.

Verifique a pureza e o status de germinação por miscroscopia de contraste facial e certifique-se de que as suspensões de esporos consistem em mais de 99% dos esporos brilhantes de fase e estão livres de células vegetativas, esporos germinados e detritos celulares, caso contrário, outros experimentos de microscopia podem ser perturbados. Determine o título de esporos plaqueando 50 microlitros de diluições seriais de dez vezes em ágar LB para calcular as UFCs e incubar as placas a 37 graus Celsius durante a noite. Após a determinação da UFC, ajustar a amostra para 10 elevado ao 9º esporos por mililitro, concentrando ou utilizando água estéril para diluir as amostras.

Coloque um transportador de amostra na forma de lâminas microscópicas esterilizadas ou lamínulas redondas de 25 milímetros dentro da unidade de pulverização de aerossol operada eletricamente em alinhamento com o bico. Transfira a cultura de esporos para a entrada do fluido do bico e inicie a pulverização em 0,15 segundos com uma pressão de 1,3 bar. A suspensão de esporos pulverizada forma uma película fina na lâmina microscópica que seca rapidamente em segundos para formar uma monocamada de esporos uniformemente distribuída.

Armazenar os suportes de amostras tratados num recipiente estéril à temperatura ambiente. Para limpar e aquecer todas as superfícies do sistema de plasma, inicie o sistema a cinco Pascals com plasma de argônio a 500 watts por cinco minutos. O pré-tratamento reduz a aderência de moléculas do ar ambiente, como nitrogênio, oxigênio e água, durante a ventilação da câmara.

Depois de ventilar a câmara, coloque cuidadosamente as amostras em prateleiras de vidro no centro do vaso do reator. Feche a câmara e evacue-a. Em seguida, use o gás de processo desejado para encher a câmara e regular a pressão no sistema para cinco Pascals.

Em seguida, inicie o processo de plasma. Após o tempo de processo definido, desligue o fornecimento de energia e gás e ventile cuidadosamente o sistema para evitar que as amostras sejam sopradas do porta-amostras. Após a ventilação, remova as amostras e guarde-as em um recipiente estéril.

Para controles não tratados com plasma, exponha as amostras ao vácuo apenas na presença do gás de processo equivalente ao tempo de plasma aplicado mais longo. Prepare uma solução de acetato de polivinila a 10% ou PVA autoclavado e use 500 microlitros para cobrir cuidadosamente os suportes de amostra. Depois de deixá-los secar ao ar por quatro horas, use uma pinça estéril para remover a camada de PVA seca que agora contém a amostra de esporos e transferi-la para um tubo de reação de 2 mililitros.

Adicione um mililitro de água estéril ao tubo e faça um vórtice para dissolver a camada de PVA para recuperar mais de 95% dos esporos capazes de germinar. Use água estéril para diluir em série a amostra de um a 10 em uma placa de 96 poços. Depois de plaquear 50 microlitros de cada diluição em ágar LB e incubar a 37 graus Celsius durante a noite, conte o número de colônias e determine as UFCs por mililitro.

Para experimentos de germinação, prepare uma almofada de ágar de 1,5 LB de um milímetro de espessura fervendo 700 microlitros de meio e pipete-a em um petrídico de microscopia estéril. Após 10 minutos, use um bisturi estéril para cortar uma almofada de ágar LB de oito milímetros por oito milímetros por um milímetro e transfira cuidadosamente o ágar sobre as monocamadas de esporos que estão apoiadas em lamínulas de vidro de 25 milímetros já montadas em uma câmara de imagem. O método de colocação em ágar combina duas funções específicas.

Ele estabiliza as amostras no plano óptico durante a microscopia a laser e restringe o movimento lateral das células. Além de usá-lo para ensaios de germinação, este método pode ser aplicado a outros microrganismos, bem como a células eucarióticas. Depois de cobrir a amostra com ágar, transfira rapidamente a lamínula de vidro para uma câmara de imagem.

Mantenha a amostra a 37 graus Celsius em um estágio aquecido durante todo o processo de imagem. Use pelo menos três réplicas biológicas para cada condição. Após a imagem das amostras por varredura a laser confocal automatizada e microscopia de campo claro, registre séries de lapso de tempo com uma potência de laser de 2,6% e defina a abertura confocal para cinco unidades aer e uma frequência de amostragem de um quadro por 30 segundos de zero a cinco horas, dependendo do experimento.

A aplicação de altas doses de luz monocromática pode inibir completamente a germinação de esporos durante a microscopia a laser. Portanto, use a intensidade do laser e intervalos mais longos obtendo quadros únicos. Em caso de agregação de esporos, distribuição de esporos em várias camadas ou contaminação por partículas de poeira, pode ocorrer bloqueio do tratamento com plasma ou sombreamento e permitir a germinação de esporos sombreados.

Para realizar a microscopia eletrônica de varredura, uma vez que as monocamadas de esporos tenham sido codificadas com paládio de ouro, crie imagens das amostras com o SEM de emissão de campo operado a uma tensão de aceleração de cinco quilovolts, incluindo um detector de elétrons secundário interno para revelar o contraste da topografia. Conforme mostrado neste gráfico, o tratamento plasmático dos esporos de B. subtilis resulta em uma diminuição na sobrevida com o aumento da duração do tratamento plasmático. Essas imagens de MEV revelam estruturas longitudinais características semelhantes a cristas, que são constantemente visíveis em todos os esporos tratados e não tratados.

O tratamento com plasma por até 30 segundos não induz alterações significativas da morfologia da superfície dos esporos em comparação com os controles. O aumento da duração do tratamento com plasma leva a uma superfície mais granular e pequenas rachaduras e fissuras podem ser observadas nos esporos tratados por 120 ou 240 segundos. Nesses experimentos de microscopia confocal de varredura a laser resolvidos no tempo, quase todos os esporos tratados com vácuo como controle germinam e desenvolvem uma morfologia celular em forma de bastonete com um comprimento bastante uniforme de células individuais.

Em contraste, os esporos tratados por 15 segundos com plasma já mostram uma capacidade de germinação reduzida de menos de 75 mais ou menos quatro por cento. Além disso, as células crescem em bastonetes extensivamente longos ou permanecem pequenas e grudam no revestimento do esporos. Após 30 segundos de tratamento com plasma, apenas 25 mais ou menos seis por cento dos esporos germinam e as células vegetativas são notavelmente atrasadas no crescimento e variam em comprimento.

Ao tentar este procedimento, é importante confirmar a qualidade das monocamadas de esporos usando microscopia de contraste de fase para garantir que não haja esporos sobrepostos ou germinados. Após seu desenvolvimento, o método de almofada de ágar para estabilização de imagem abriu caminho para pesquisadores em esterilização por plasma e microscopia de células vivas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma melhor compreensão de como preparar monocamadas de esporos em lâminas de vidro, determinação de uso usando tratamentos de plasma para inativação de esporos e realizar microscopia eletrônica de varredura e células vivas.

Em contraste com outros métodos de descontaminação, por exemplo, óxido de etileno ou radiação gama, a esterilização por plasma é uma abordagem eficiente e segura para reduzir uma série de microrganismos indesejados em quase qualquer tipo de superfície.