Uso de hibridização in situ de fluorescência (FISH) para monitorar o estado da coesão do braço em oócitos de Drosophila na prometáfase e na metáfase I

O objetivo geral deste procedimento é gerar sondas FISH e visualizar o estado da coesão do braço meiótico em oócitos de drosófila durante a prometáfase um e a metáfase um. A principal vantagem desta técnica é que ela permite testar o estado de coesão do braço em oócitos de drosófila presos em prometáfase e metáfase um. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da meiose da drosófila, como quais condições levam à perda prematura da coesão do braço?

Essa técnica tem o potencial de expandir nossa compreensão do efeito da idade materna em humanos, que ocorre, pelo menos em parte, porque a coesão meiótica se deteriora à medida que os oócitos envelhecem. Comece este protocolo com a geração da sonda de braço para FISH, bem como a dissecção e fixação de oócitos conforme detalhado no protocolo de texto. Para separar os oócitos em estágio avançado, primeiro adicione um mililitro de PBSBTX a uma placa de dissecação rasa.

Em seguida, use um P-200 com uma ponta revestida com BSA para transferir ovários fixos para o prato raso. Pipete os ovários para cima e para baixo com a ponta da pipeta revestida com BSA para desalojar os oócitos maduros dos oócitos menos maduros. Quando os oócitos em estágio avançado estiverem suficientemente separados, transfira todo o tecido para um tubo de microcentrífuga de 500 mililitros.

Remova o excesso de líquido com uma pipeta Pasteur puxada, deixando cerca de 150 a 200 microlitros no tubo. Para se preparar para o enrolamento do oócito, umedeça previamente um prato de poço fundo com 200 microlitros de PBSBTX. Cubra o prato e reserve.

Obtenha três lâminas de vidro fosco e coloque a lâmina três de lado. Em seguida, esfregue suavemente as regiões de vidro fosco das lâminas um e dois. Enxágue-os em água deionizada para remover quaisquer cacos de vidro e seque com um lenço descartável.

Cubra as regiões foscas das lâminas um e dois com PBSBTX adicionando 50 microlitros de PBSBTX a uma lâmina e esfregando essa região com a outra lâmina. Remova o líquido com um lenço descartável e coloque as lâminas sob um microscópio de dissecação. Mantenha as regiões foscas das lâminas um e dois em contato, com a lâmina três apoiando a lâmina dois.

Para enrolar os oócitos, primeiro umedeça previamente uma ponta de pipeta P-200 em PBSBTX e disperse os oócitos no tubo de microcentrífuga pipetando para cima e para baixo. Transfira 50 microlitros de líquido contendo os oócitos para o centro da parte de vidro fosco da lâmina um. Levante o slide dois para fazer isso.

Abaixe lentamente o slide dois até que a tensão superficial do líquido crie uma vedação entre as duas regiões de vidro fosco. Deve haver líquido suficiente para cobrir a área fosca, mas nenhum deve vazar. Em seguida, segure o slide inferior um no lugar com uma mão e use a outra mão para mover o slide superior dois para frente e para trás na direção horizontal, mantendo o slide dois nivelado e apoiado no slide três.

Execute sob um microscópio para facilitar a visualização dos movimentos e progresso dos oócitos. Depois de alguns movimentos na direção horizontal, mude ligeiramente o ângulo de movimento. Em vários incrementos, aumente gradualmente esse ângulo para 90 graus até que o movimento do slide superior dois seja perpendicular à direção inicial.

Observe que os córions vazios serão visíveis no líquido e os oócitos sem córions parecerão mais longos e mais finos. Ao rolar os ovócitos, certifique-se de que a direção do rolamento seja sempre em linha reta e nunca em movimento circular. Repita o rolamento cerca de sete a 10 vezes até que a solução fique ligeiramente turva.

Pare de rolar quando a maioria dos oócitos parecer ter perdido suas membranas vitelinas. Levante suavemente a lâmina superior dois, arrastando um de seus cantos para o centro da região fosca da lâmina inferior, de modo que os oócitos enrolados se acumulem no centro da região fosca. Lave os oócitos de ambas as lâminas com PBSBTX na placa de poço fundo contendo PBSBTX.

Limpe as lâminas um e dois com água ultrapura. Seque com um lenço descartável e reinicie. Repita essas etapas até que todos os oócitos do mesmo genótipo tenham sido enrolados.

Isso geralmente requer três a quatro rodadas de rolagem por genótipo. Para remover detritos após a laminação, adicione um mililitro de PBSBTX a um tubo cônico de 15 mililitros. Agite o líquido para revestir as laterais do tubo.

Usando uma ponta de pipeta P-1, 000 revestida com PBSBTX, transfira os oócitos enrolados da placa de poço profundo para o tubo cônico contendo um mililitro de PBSBTX. Adicione mais dois mililitros de PBSBTX ao tubo cônico que contém os oócitos. Segure o tubo cônico contra um fundo escuro para ver os oócitos opacos enquanto eles afundam.

Depois de deixar os oócitos assentarem no fundo, use um P-1.000 para remover os dois mililitros superiores da solução contendo detritos e descarte. Depois de repetir a etapa para um total de três rodadas de remoção de detritos, use uma ponta de pipeta P-1, 000 revestida com PBSBTX para transferir os oócitos de volta para o tubo de microcentrífuga original de 500 microlitros. 20 a 25 fêmeas devem produzir aproximadamente 50 microlitros de oócitos maduros enrolados.

Repita esse processo para os genótipos restantes usando lâminas frescas congeladas, um prato limpo e um novo tubo cônico para cada genótipo. Enxágue os oócitos com 500 microlitros de PBS contendo 1%Triton X-100. Remova o líquido e adicione 500 microlitros de tampão de extração.

Incubar a amostra no nutador à temperatura ambiente durante duas horas. Depois de realizar lavagens de pré-hibridização conforme descrito no protocolo de texto, execute a desnaturação e a hibridização. Primeiro, use uma ponta de pipeta P-200 revestida com BSA para transferir os oócitos para um tubo de PCR de 200 microlitros.

Mantenha as amostras a 37 graus Celsius e deixe os oócitos assentarem no fundo. É importante ter paciência ao trocar as soluções para que os oócitos não se percam no processo. Assim que os oócitos se acomodarem, use uma pipeta Pasteur puxada para remover o máximo de líquido possível.

Em seguida, adicione 40 microlitros de solução de hibridização contendo sonda aos oócitos. Coloque o tubo de PCR contendo os oócitos na máquina de PCR e incube conforme listado no protocolo de texto. Depois que a sonda for adicionada aos oócitos, mantenha-os no escuro o máximo possível.

Para lavagens pós-hibridização, pré-aqueça o SSCT 2X mais 50% de formamida a 37 graus Celsius e mantenha-o na incubadora de hibridização. Com uma ponta de pipeta P-200 revestida com BSA, adicione 100 microlitros de SSCT 2X a 37 graus Celsius mais 50% de formamida ao tubo de PCR com os oócitos e transfira os oócitos para um novo tubo de microcentrífuga de 500 microlitros. Depois de adicionar mais 400 microlitros de SSCT 2X a 37 graus Celsius mais 50% de formamida ao mesmo tubo, deixe os oócitos assentarem a 37 graus Celsius na incubadora.

A acomodação geralmente leva mais tempo nesta etapa. Não é incomum levar 15 minutos ou mais. A falta de paciência resultará em uma perda significativa de oócitos.

Depois de permitir que os oócitos assentem, remova o líquido com uma pipeta de Pasteur puxada. Adicione 500 microlitros de SSCT 2X a 37 graus Celsius mais 50% de formamida a 37 graus Celsius e lave os oócitos com rotação. Após cada etapa de rotação da barra de lavagem, mantenha os oócitos a 37 graus Celsius enquanto eles se acomodam.

Após lavagens adicionais à temperatura ambiente, corar com DAPI lavando os oócitos por 20 minutos em 500 microlitros de solução de DAPI de um micrograma por mililitro em 2X SSCT no nutador. Após enxaguar os ovócitos três vezes em 500 microlitros de 2X SSCT, lave os ovócitos duas vezes por 10 minutos cada em 500 microlitros de 2X SSCT no nutador. As amostras podem ser armazenadas por até quatro horas em temperatura ambiente no escuro até que estejam prontas para serem montadas nas lamínulas.

Com uma ponta de pipeta P-200 revestida com BSA, pipete para cima e para baixo para dispersar os oócitos por toda a solução. Em seguida, transfira 40 microlitros da solução de oócito para uma lamínula revestida com poli-L-lisina. Remova um pouco do líquido da lamínula usando uma pipeta Pasteur puxada até que os oócitos grudem na lamínula, mas ainda estejam cercados por líquido.

Com uma pinça, segure a lamínula de um lado e use uma agulha de tungstênio para dissociar suavemente aglomerados de oócitos, movendo-os para obter uma única camada de oócitos não sobrepostos. Remova o restante do líquido ao redor dos oócitos com uma pipeta Pasteur puxada. Em seguida, abaixe lentamente o slide em direção à lamínula com a mídia de montagem voltada para a amostra até que a mídia toque a amostra.

Depois de deixar as lâminas secarem por três a cinco dias no escuro, adquira imagens confocais de varredura a laser usando uma objetiva de óleo de alta abertura numérica de 40 vezes com zoom digital de seis vezes, conforme detalhado no protocolo de texto. Um pacote de software que permita visualizar imagens e pontuar defeitos de coesão em três dimensões é imperativo. Isso permite percorrer a série Z para visualizar os pontos FISH e contar com precisão o número de sinais de braço individuais.

As projeções de intensidade máxima da série Z confocal são mostradas para oócitos com coesão do braço intacta e rompida. Nessas figuras, o sinal da sonda do braço é amarelo e o sinal da sonda pericêntrica é vermelho. Dois pontos de sonda de braço indicam que as cromátides irmãs estão juntas e a coesão do braço está intacta.

Três pontos de sonda de braço indicam que um par de cromátides irmãs perdeu prematuramente a coesão do braço, enquanto o outro par de irmãs não. Se dois pontos de sonda de braço estiverem conectados por um fio, as cromátides irmãs não serão marcadas como separadas. Portanto, considera-se que uma figura meiótica como essa tem apenas três pontos de sonda de braço com um par de irmãs exibindo perda prematura da coesão do braço.

A perda prematura da coesão do braço para ambos os conjuntos de cromátides irmãs resulta em quatro pontos de sonda do braço. Em todos os quatro exemplos mostrados, a coesão centromérica está intacta. Uma vez dominado, rolar os oócitos para um genótipo pode ser feito em aproximadamente 25 minutos se for realizado corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como rolar oócitos, realizar FISH usando sondas de braço e pontuar imagens para determinar o estado de coesão do braço meiótico em oócitos de drosófila. Ao realizar a hibridização e as lavagens, é importante lembrar de ser paciente. Não esperar o tempo suficiente para que os oócitos se assentem após cada etapa de lavagem reduzirá o rendimento dos oócitos para imagens no final.

Pode ser possível otimizar este protocolo para combinar FISH com coloração de aminoácidos, a fim de responder a perguntas adicionais sobre a localização de proteínas ou a estrutura do fuso meiótico, ao mesmo tempo em que monitora o estado de coesão do braço. O desenvolvimento desta técnica abrirá caminho para pesquisadores no campo da meiose de drosófila explorarem os mecanismos que garantem e interrompem a coesão do braço meiótico e impactam a segregação cromossômica.