Um método de co-cultura para investigar o Crosstalk entre raio-x irradiados PBMC e células Caco-2

O objetivo geral deste protocolo de cocultura é medir os efeitos da radiação ionizante na permeabilidade da monocamada de células epiteliais Caco-2 e na função de junção apertada na presença ou ausência de células mononucleares do sangue periférico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia da radiação e da radioimunoterapia sobre possíveis efeitos sinérgicos entre a exposição à radiação ionizante e as funções das células imunes. As principais vantagens desta técnica são que diferentes estímulos e população celular podem ser testados e fenômenos observados desacoplados através de medidas complementares ad hoc.

Os procedimentos de radiação visam considerar a monocamada de células Caco-2 como o volume tumoral é irradiado com o feixe adequado e dosimetria precisa, como é o caso da radioterapia no paciente. Uma semana antes de sua irradiação, semeie cinco vezes 10 para as quintas células Caco-2 em dois mililitros de meio completo em uma inserção de cultura de células estéril de um micrômetro de diâmetro de poro por poço em uma placa de cultura de células de seis poços. Adicione três mililitros de meio completo fresco no compartimento inferior de cada poço e coloque as células em uma incubadora de cultura de células umidificada a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por sete dias.

No último dia de incubação, adicione 25 mililitros de Ficoll a um tubo cônico de 50 mililitros. E coloque cuidadosamente 25 mililitros de sangue total recém-coletado sobre o Ficoll. Separar as células por centrifugação por gradiente de densidade.

E use uma pipeta Pasteur para transferir as células mononucleares do sangue periférico ou PBMC na interface para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, lave o PBMC isolado em duas lavagens de PBS de 10 mililitros. E cultive o PBMC em meio completo fresco por não mais do que três a cinco horas na incubadora de cultura de células.

Defina a energia de raios-x do fóton para um pico de seis megavolts. E coloque a cultura de células Caco-2 em uma folha de plexiglass de 1,4 centímetro de espessura dentro da trajetória dos raios-x e a 100 centímetros da fonte de radiação. Em seguida, coloque um bolus de 0,57 centímetro de espessura em cada amostra para garantir o equilíbrio do componente de radiação retroespalhada e das partículas carregadas.

E use um campo de radiação plano e simétrico de 20 por 20 centímetros quadrados e uma taxa de dose de três cinzas por minuto para irradiar as células. Para avaliar a atividade metabólica e a viabilidade das células Caco-2, semeie duas vezes 10 elevado ao quinto Caco-2 células em cada poço de uma placa de 24 poços 24 horas antes de sua irradiação em 1,25 mililitros de meio completo. Em seguida, retorne as células à incubadora de cultura de células por 21 horas.

No dia seguinte, adicione 100 microlitros de cinco miligramas por mililitro de solução de MTT a cada poço e incube as células por mais três horas. Depois de lavar as células com um mililitro de PBS, adicione 500 microlitros de dimetilsulfóxido a cada poço para dissolver quaisquer cristais de formazan liberados pelas células Caco-2 e avalie a absorbância com um leitor de placas de vários poços em um lambda de 570 nanômetros. Para avaliar a viabilidade celular do Caco-2, lavar as células com um mililitro de PBS por poço, seguido de descolamento das células com 100 microlitros de solução de tripsina-EDTA por dois minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2.

Pare a reação com 500 microlitros de meio completo e transfira as células para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro para centrifugação. Ressuspenda os pellets em 50 microlitros de PBS por tubo e misture as suspensões celulares resultantes com um volume igual de solução de corante de viabilidade de azul de tripano. Após três minutos à temperatura ambiente, conte o número de células coradas viáveis não coradas e não viáveis no hemocitômetro.

Para avaliar a resistência elétrica transepitelial ou TEER das células Caco-2, imediatamente após a transferência de irradiação, metade da cultura de células Caco-2 é inserida em uma nova placa com três mililitros de meio completo fresco em cada poço e metade das culturas inseridas em uma nova placa semeada com duas vezes 10 elevado ao sexto PBMC por três mililitros de meio completo por poço. Em seguida, coloque um eletrodo de pauzinho TEER no inserto de cultura de células a cada hora durante as primeiras seis horas e depois a cada três horas até 48 horas após a irradiação. Para análise de Western blot, 48 horas após a irradiação, lise as células Caco-2 e PBMC com 40 microlitros por um vezes 10 para as sextas células do tampão de lise celular.

Ao lisar e raspar as células Caco-2, tome cuidado para não separar a membrana porosa da inserção, o que pode resultar em perda de lisado celular e resultado tendencioso. Armazene as amostras de células lisadas a menos 20 graus Celsius. Depois de quantificar a quantidade total de proteína em cada amostra de lise celular pelo método do ácido bicinconínico, adicione volumes iguais de tampão de amostra Laemmli suplementado com beta-mercaptoetanol a cada amostra de proteína total em tubos de microcentrífuga individuais.

Aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, colete as proteínas desnaturadas por centrifugação e carregue volumes totais de proteína iguais de cada amostra em um gel pré-moldado de quatro a 20%. Execute as amostras por uma hora a 120 volts.

Em seguida, use um sistema de transferência elétrica semi-seco para transferir as proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno. Em seguida, coloque a membrana em um recipiente e bloqueie os locais de ligação inespecíficos com leite em pó desnatado a 5% em PBS suplementado com 0,2% Tween 20 por 60 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. No final da incubação de bloqueio, lave a membrana três vezes com 10 mililitros de 0,2% PBS Tween 20 por cinco minutos por lavagem e rotule a membrana com os anticorpos primários apropriados de interesse por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave.

Após incubação noturna a quatro graus Celsius com agitação suave, lave a membrana três vezes com 0,2% de PBS Tween 20 como acabamos de demonstrar e incube a membrana com os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano apropriados por 60 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Após três lavagens de PBS, incube a membrana com um kit de solução quimioluminescente aprimorado. Em seguida, crie imagens do filme resultante com um sistema de digitalização apropriado e quantifique os resultados com um programa de análise de imagem adequado.

A irradiação de até 10 cinzas não altera a atividade metabólica das células Caco-2 24 ou 48 horas após a irradiação, embora a viabilidade celular diminua com o tempo em ambas as doses. A avaliação TEER de células Caco-2 não cocultivadas após exposição a dois cinzas de irradiação revela valores TEER consistentes até 48 horas após a irradiação. Após 10 cinzas de irradiação, no entanto, as células demonstram uma diminuição prolongada no TEER a partir de três horas após a irradiação.

A cocultura com PBMCs resulta em uma redução de TEER que é evidente de três horas após a irradiação em ambas as doses até 30 horas após a irradiação, ponto em que os valores de TEER parecem permanecer relativamente consistentes. A análise de Western blot de proteínas de junção apertada não revela diferenças na expressão de Claudin-1 ou Occludin em resposta à irradiação e / ou cocultura de PBMC, enquanto grandes flutuações são observadas em várias proteínas de andaime. Além disso, a proteína total NF-kappa B não é afetada em nenhuma das doses de irradiação, enquanto os níveis de proteína XIAP são regulados positivamente quatro vezes em ambas as doses.

Usando este procedimento, outros estímulos biológicos como Enterobactérias podem ser adicionados para responder a perguntas adicionais sobre como diferentes estímulos biológicos podem modificar a resposta da boa monocamada à exposição à radiação ionizante. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir o impacto da radiação ionizante e das células imunes na permeabilidade das células Caco-2 e na expressão do complexo de junção apertada.