Name: Um método de co-cultura para investigar o Crosstalk entre raio-x irradiados PBMC e células Caco-2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Aprenda um método de co-cultura para investigar o efeito da radiação ionizante na permeabilidade do monolayer de células Caco-2 e na função das junções firmes na presença de células PBMC.

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Instituto italiano de Física Nuclear (INFN) parcialmente financiado este trabalho através do projeto INFN-MERIDIAN. Os autores reconhecem Prof Edoardo Milotti (departamento de física, Universidade de Trieste, Itália) para coordenação do projeto INFN-meridiano; Dr. Roberto Chignola (departamento de biotecnologia, Universidade de Verona, Itália) para fornecer as células Caco-2, o ohmímetro e por sua valiosa ajuda e treinamento. Também reconhecemos Agnese Solari para assistência técnica.

O protocolo seguinte envolve a retirada de sangue humano de voluntários saudáveis. Os doadores fornecida escrito consentimento informado antes da inscrição. Este procedimento está em conformidade com a declaração de Helsínquia e as retiradas de sangue foram realizadas por um profissional de saúde assistente.
1. cultura e set-up co-cultura de células
<ol><li>Uma semana antes da irradiação, prepare uma suspensão de células Caco-2 contendo 2,5 × 105 células/mL em fresco RPMI1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 de μg/mL.</li>
	<li>Semente de 2 mL de suspensão de células estéreis 1 µm-poro cultura de pilha de diâmetro insere para placas 6-poços e colocar a inserção em uma placa de 6. Nota: Inserções de cultura de célula talvez precise ser ativado pela incubação com meio completo estéril antes da semeadura de célula. Nesse caso, meios de cultura deve ser descartado e substituído com mídia de suspensão celular.</li>
	<li>Adicionar 3 mL de meio fresco RPMI1640, suplementado com 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 UI/mL penicilina e estreptomicina 100 µ g/mL em cada compartimento inferior e cultura de células a 37 ° C numa incubadora com umidificado atmosfera contendo 5% de CO2.</li>
	<li>No mesmo dia de irradiação de células Caco-2, coletar sangue total humano em tubos de 6 mL comercialmente disponível heparina de lítio-revestido (tamanho do tubo: 13 x 100 mm).</li>
	<li>Posteriormente, isole células mononucleares de sangue periférico (PBMC) usando gradiente de Ficoll. Para separar PBMC, colocar 25 mL de Ficoll em um tubo de centrifuga conico de 50 mL e camada igual volume de sangue total diluído 1:1 com RPMI1640 para a superfície de Ficoll. Nota: Um doador saudável normal geralmente tem aproximadamente 4-10 × 106 PBMC/mL.</li>
	<li>Centrifuga os tubos de 50 mL a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Delicadamente, recolher o PBMC na interface entre o Ficoll e plasma por aspiração com uma pipeta Pasteur e colocá-los em um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Lave o PBMC duas vezes, adicionando 10 mL de salina tamponada fosfato (PBS) e centrifugação PBMC em 250 x g durante 10 minutos.</li>
	<li>Cultura PBMC por um período máximo de 3-5 h em T25 frascos de2 cm em concluir RPMI1640 mídia, como descrito antes, a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Nota: Coletar PBMC no dia do experimento e propagar a 2 × 106 células/poço, suspenso em 3 mL de meio RPMI1640 completo, no compartimento inferior da cultura co. Pastilhas com células Caco-2 são transferidas em poços de PBMC contendo 30 min após sua irradiação. PBMC coletada do sangue inteiro não pode ser mantida em cultura por mais de cerca de 72 h, se não estimulada com por exemplo. fitoemaglutina (PHA), após o qual a viabilidade das células é perdida. Cuidado: A qualidade e a segurança de todo o sangue e hemoderivados devem ser garantidas durante todo o processo.</li>
</ol>2. irradiação set-up
Nota: Irradiação de células Caco-2 foi realizada no departamento de radioterapia do Istituto di Ricovero e Cura um Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pavia, Itália), com um acelerador linear rotineiramente usado para tratar diferentes tipos de cancros.
<ol><li>Defina energia de raios-x de fóton para 6 pico de MV. O acelerador linear opera em regime pulsante (tempo entre dois pulsos consecutivos, aproximadamente de 4 ms; duração de pulso único sobre 5 µs com uma dose de taxa até 1 × 10-3 Gy/p).</li>
	<li>Coloca as placas de 6-poços contendo inserções com Caco-2 sobre a trajetória dos raios-x em um 1.4 cm de espessura Plexiglas folha (correspondente a uma distância ligeiramente maior que a acumulação da radiação utilizada) a 100 cm da fonte de radiação.</li>
	<li>Coloque 0,5 cm de espessura em bolus em cada amostra antes da irradiação ocorre para garantir que o componente da radiação retroespalhados e o equilíbrio de partículas carregadas.</li>
	<li>Irradiar as células (doses na faixa de 10-2 Gy) com um pneu furado e simétrica (± 2%) campo de radiação2 20 x 20 cm e uma taxa de dose de 3 Gy/min. Nota: Controlar "sham"-células irradiadas foi submetido as mesmas condições processuais dos irradiados, sem entrar no quarto de irradiação (dose recebida: 0 Gy). Cuidado: dispositivos produtores de radiações ionizantes devem ser usados somente por pessoal especializado.</li>
</ol>3. célula ensaio da viabilidade (MTT Assay)
Nota: Atividade metabólica das células Caco-2 foi avaliada através do ensaio de brometo de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT)14.
<ol><li>Semente de 2 × 105 Caco-2 em uma placa de 24 24 h antes da irradiação em 1,25 mL de meio completo.</li>
	<li>Irradiar as células como descrito nos passos 2.1-2.4 então incubar as células a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.</li>
	<li>21 h após a irradiação, adicionar 100 µ l de 5 mg/mL de solução de MTT e manter as células a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 por 3 h.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e lavar as células com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Dissolver os cristais de formazan adicionando 500 µ l de Dimetilsulfóxido (DMSO) em cada poço e avaliar a absorvância com um leitor de placa multi bem no λ = 570 nm.</li>
	<li>Repita a etapa 3.3-3.4 - 3.5-3.6 a 45 h após a irradiação. Nota: Os resultados são mostrados como uma perturbação da condição Souza correspondente, que é normalizada a 100%. Atenção: O DMSO é agente inflamável e irritante para a pele, olhos e sistema respiratório (GHS07, GHS08). Em caso de contato com os olhos, lavar imediata e abundantemente com água e consultar um médico. MTT é um agente irritante para a pele, olhos e sistema respiratório (GHS07, GHS08). Em caso de contato com os olhos, lavar imediata e abundantemente com água e consultar um médico.</li>
</ol>4. percentagem de determinação de células viáveis (ensaio de exclusão de corante Trypan azul)
Nota: A percentagem de células viáveis foi avaliada por ensaio de exclusão de corante azul Trypan.
<ol><li>Semente de 2 × 105 Caco-2 em placa de 24 24 h antes da irradiação em 1,25 mL de meio completo.</li>
	<li>Irradiar as células com doses na faixa de 0 - 10 Gy (ver passos 2.1-2.4) então incubar as células a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 por 24-48 h.</li>
	<li>Depois o tempo escolhido dois pontos, lavar as células com PBS, descartá-lo e, em seguida, adicionar 100 µ l de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) da solução de ácido. Colocar as células a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 por 2 min, em seguida, adicione meio completo para prender a reação enzimática.</li>
	<li>Coletar as células em um 1,5 mL-tubo e centrifugar o tubo a 500 x g por 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 50 µ l de PBS.</li>
	<li>Misturar a suspensão de células com 50 µ l de solução de corante azul de Trypan e incubar a mistura por 3 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Contar o manchado (não viáveis) e inocente (viáveis) células com uma câmara de Bürker.</li>
</ol>5. resistência elétrica Trans-epitelial (TEER)
<ol><li>Semente de 5 × 105 Caco-2 células uma semana antes da irradiação em placa de 6 co cultura inserções (polietileno tereftalato (PET), 2 x 106 poros/cm2).</li>
	<li>1 h antes da irradiação, medir a TEER com um voltímetro/ohmímetro.</li>
	<li>Irradiar as células como descrito nos passos 2.1-2.4.</li>
	<li>Incube as células Caco-2 em presença/ausência de co-cultura com PBMC a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.</li>
	<li>Para o primeiro poucas horas pós-irradiação, medir TEER cada hora e subsequentemente a cada 3 h até 48 h.</li>
</ol>6. Western Blot análise de Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1, ZO-2, NF-kB e XIAP
<ol><li>Células de semente 5 × 105 1 semana antes da exposição ao raios-x em co-cultura 6 placa insere (PET, 2 x 106 poros/cm2) e irradiar as células como descrito nos passos 2.1-2.4.</li>
	<li>Incube as células Caco-2 em presença/ausência de co-cultura com PBMC a 37 ° C numa atmosfera umidificada contendo 5% de CO2.</li>
	<li>48 h após a irradiação, preparar Caco-2 e PBMC lisados celulares, tratando as células com lise celular buffer e armazenam amostras a-20 ° C. Nota: o protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Quantificar a quantidade de proteínas totais pelo método de bicinchoninic ácido (BCA). Nota: o protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Misture quantidades iguais de proteínas totais com tampão de amostra Laemli adicionado com β-mercaptoetanol (concentração final de β-Mercaptoetanol é de 5%), aqueça as amostras a 95 ° C por 5 min e girá-los a 10.000 x g.</li>
	<li>Amostras de carga em um 4-20% prefabricados de gel e realizar a eletroforese em 120 V para proteínas de transferência de 1 h. em uma membrana de flúor (PVDF) polyvinildiene.</li>
	<li>Bloquear sites inespecificas incubando a membrana PVDF em temperatura ambiente com 5% sem gordura leite (NFDM) em PBS adicionado com 0,2% Tween-20 (PBT). Lavar a membrana três vezes com 10ml de 0,2% PBT por 5 min.</li>
	<li>Incubar a membrana com agitação suave por 1h à temperatura ambiente antes de serem colocados durante a noite a 4 ° C, com os seguintes anticorpos primários: anti-claudin-1, anti-ZO-1, anti-ZO-2, anti-afadin, anti-occludin, anti-NF-kB, anti-XIAP e anti actina. Lavar a membrana três vezes com 10ml de 0,2% PBT por 5 min.</li>
	<li>Incube as membranas com anticorpos secundarios conjugados a HRP Peroxidase de rábano por 1h à temperatura ambiente com agitação suave. Lavar a membrana três vezes com 10ml de 0,2% PBT por 5 min.</li>
	<li>À temperatura ambiente, desenvolva filmes fotográficos incubando as membranas com kit de quimio-luminescente reforçada.</li>
	<li>Adquirir filmes fotográficos com um sistema de digitalização e quantificar as bandas obtidas com software de análise de imagem adequada. Nota: A avaliação de Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1 e 2-ZO é realizada nas células Caco-2. A avaliação de NF-kB e XIAP é realizada em PBMC. Cuidado: β-Mercaptoetanol é tóxico (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). Não respirar vapores, evitar a libertação no ambiente e usar dispositivos de proteção individual e proteção respiratória. Se ingerido, imediatamente pedi aconselhamento médico.</li>
</ol>7. análise estatística
<ol><li>Para determinar se a exposição à radiação e a co-cultura induzir uma perturbação significativa, executar um teste de duas vias de análise de variância (ANOVA) com comparações múltiplas para medidas repetidas (com testes de post-hoc de Bonferroni para comparar replicar significa).</li>
	<li>Caso contrário, calcule a significância estatística (p) pelo teste-t de Student bicaudal. Cada valor é a média de experimentos independentes de ≥3 ± erro padrão do dizer (SEM).</li>
</ol>

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<li>Pellegrina, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+wheat+germ+agglutinin+on+human+gastrointestinal+epithelium%3A+Insights+from+an+experimental+model+of+immune%2Fepithelial+cell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharm%22%5BJournal%5D)">Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction.</a> Toxicol Appl Pharm. 237 (2), 146-153 (2009).</li>
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</ol>

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Câncer colorretal, com sua alta ocorrência em países desenvolvidos, é uma das causas mais frequentes de morbidade e mortalidade na população. Geralmente é gerido pela cirurgia, quimioterapia e radioterapia1. No âmbito de tratamentos de radioterapia, deve prestar especial atenção aos efeitos da exposição de tecido saudável4; Além disso, estudos sistemáticos sobre a relação entre a exposição à radiação e o sistema imunológico são fundamentais para o desenvolvimento de abordagens de radio-imunoterapia3.
A metodologia que adotamos neste trabalho foi adaptada para a investigação de células Caco-2 e diafonia PBMC. Enfocamos os efeitos da exposição de raios-x de células tumorais, mas o mesmo protocolo pode ser adaptado para estudos com agentes farmacológicos. Sendo mais perto de condições fisiológicas em relação ao cultivo de célula padrão, a forte vantagem deste método é a possibilidade de uma dissecação completa de um sistema complexo, dada a possibilidade de analisar os diferentes tipos de células e a liberação de moléculas de sinal em dois compartimentos da cultura co em si. Desta forma, métodos biológicos rotineiramente aplicados podem ajudar a compreensão do celular interplay mecanismos relacionados.
A caracterização inicial dos efeitos de X-ray induzida em células Caco-2 foi baseada em duas medidas complementares, ou seja, o ensaio colorimétrico de MTT e a exclusão do corante azul de Tripan teste. Os resultados aparentemente inconsistentes poderiam ser explicados pelo foco destes dois ensaios diferente. MTT avalia a atividade de enzimas oxidorredutase, enquanto o Trypan corante azul é baseado em um mecanismo de tintura de célula viva exclusão.
A investigação da interação de Caco-2-PBMC requer a criação de uma monocamada epitelial capaz de conduzir a uma separação completa entre os dois compartimentos da cultura co. A possibilidade de semear células Caco-2 em inserção da co-cultura permite a irradiação apenas dessa população celular. Desde a co-cultura começa após a irradiação, não há nenhum viés devido a qualquer exposição acidental de PBMC. Esta configuração precisa ser manipulado com cuidado para evitar danos (ou contaminação) a monocamada celular durante os movimentos da inserção de uma placa de 6 para o outro. Quando realizada com cuidado, TEER medições são um método simples e não-invasiva para investigar a permeabilidade monocamada. Este ensaio está estritamente relacionado com a configuração de cultura co, e não é a única escolha para a investigação de permeabilidade monocamada. Uma vez que é bem calibrado com meio fresco completo permite uma boa reprodutibilidade das medidas. Ensaios comuns focar a difusão dos corantes químicos do compartimento superior "apical" para o fundo "basolateral" um (por exemplo o isotiocianato de fluoresceína (FITC)-ensaio de dextrano)16. No entanto, desde que PBMC estão presentes no compartimento basolateral neste estudo, decidimos evitar a introdução de reagentes químicos nos experimentos.
Entre as diferentes técnicas adoptadas neste trabalho, medição de TEER é o único que requer a configuração de co-cultura17,18. No entanto, as outras técnicas comuns de laboratório fornecem resultados mais informativos quando aplicados às células em co-cultura, que permitem a investigação de um condições mais perto de fisiológicos de configuração e os dados têm um forte significado biológico. Por outro lado, deve-se notar que o uso de células cultivadas em um suporte poroso pode levar a algumas dificuldades nas operações necessárias para preparar as amostras, tais como o lysis da pilha para a preparação de extratos celulares ser analisado através da mancha ocidental.
O sistema adotado neste estudo tem potencial para ser ainda mais melhorada, por exemplo, com a aplicação de substâncias capazes de recriar o ambiente da matriz extracelular. No entanto, isso também resultará em um aumento da complexidade do sistema, e uma dissecação completa de afinação será mais difícil de ser alcançado.
Configurações para cultura de células co certamente representam uma ferramenta poderosa para o avanço da pesquisa em vitro e para a compreensão de sistemas complexos. Esta técnica tem o potencial de aumentar o conhecimento sobre os mecanismos fundamentais, fornecendo novas entradas para estudos de pesquisa básica em sinalização molecular e com possíveis aplicações para a modulação da atividade do sistema imunológico, no âmbito da manejo de paciente clínico oncológico.

A metodologia adotada neste trabalho foi desenhada para investigar a interação entre as células de cancro colo-rectal e o sistema imunológico, explorando um passo mais perto para o estado fisiológico quando comparado a culturas de célula normal 2-dimensional.
Carcinoma colorretal (CRC) é considerado o terceiro mais frequente tipo de câncer, com mais de 1 milhão de casos em todo o mundo (Observatório Global de câncer, a Agência Internacional para pesquisa sobre câncer, a Organização Mundial de saúde, http://gco.iarc.fr). Gestão do CRC é rotineiramente realizada através de cirurgia, quimioterapia ou radioterapia1. Quando comparado a técnicas invasivas como a cirurgia ou quimioterapia, radioterapia em grande medida evita as reações sistêmicas prejudiciais típicas decorrentes dessas abordagens clínicas, graças a entrega localizada da dose de radiação. No entanto, os efeitos colaterais podem surgir nos tecidos saudáveis circundantes, provocando inflamação com dano direto às células saudáveis e danos mediada pelos efeitos não específico2,3,4. Enfocando os efeitos adversos devido a irradiação durante o tratamento do cancro colo-rectal, dois aspectos precisam ser investigadas. Em primeiro lugar, os mecanismos responsáveis de impermeabilidade intestinal podem ser alterados por entrega de radiação, fazendo com que, por sua vez, a possibilidade de efeitos colaterais devido a uma contenção alterada da população bacteriana e a passagem de paracellular de moléculas e solutos. Em segundo lugar, a presença de tecido linfático associado intestino (GALT) atua como um posto avançado do sistema imunológico, com a função de controlar o crescimento bacteriano e mediando a resposta imune geral5,6,7. Para cumprir essas funções, impermeabilidade intestinal é mantida devido à função de complexos juncionais entre as membranas das células. Por estas razões, as consequências prejudiciais induzidas devido a diferentes doses de raios-x foram investigadas em células Caco-2 em paz e em culturas co com PBMC.
Embora a realização de estudos sobre culturas de pilha é o primeiro setline de investigação na investigação biomédica, a falta de conhecimento detalhado dos mecanismos de condução célula biologia e recíprocas interações entre diferentes tipos de células pode se tornar crítico quando aproximando-se o estudo da fisiologia dos órgãos, sistemas e aparelhos que não podem ser recriados facilmente no laboratório. Por isso, decidimos adotar uma afinação de co-cultura, permitindo que tanto o estudo de duas populações de células juntos e a dissecção de aspectos relacionados aos mecanismos intercelulares e extracelulares.
Co-cultura é uma técnica explorada quando estudando funções epiteliais e a interação entre diferentes tipos de células. Em particular, o uso de tal técnica torna-se obrigatória no nosso caso, porque os epitélios são constituídos por células, caracterizadas por polaridade. No caso da barreira intestinal, enterócitos mostram uma polarização bem definida, com apical e basolateral poloneses normalmente separaram devido à presença de moléculas de adesão de junção-criando apertado. Esta compartimentalização é necessária para a fisiologia do tecido, evitando paracellular tráfico e permitindo a passagem de determinadas moléculas apenas. Esse recurso é naturalmente impossível recriar com uma célula normal, cultivo de set-up. Além disso, a adoção de set-up a co-cultura reproduz a presença de células do sistema imunológico apenas na superfície basolateral, enquanto a superfície apical (correspondente ao lúmen intestinal) não é directamente em contacto com outras células.
Recentemente, linhas de células Caco-2 ganharam mais importância como um modelo in vitro da barreira intestinal. Embora derivado do adenocarcinoma de cólon humano, células Caco-2 mantêm a capacidade de diferenciação e criar uma monocamada polarizada funcional8, que permite a investigação das propriedades da membrana celular, quando cultivada em uma inserção de co-cultura.
Caco-2 cultivo numa membrana porosa é um modelo bem estabelecida em vitro de monocamada intestinal, uma melhoria desde a co-cultura entre Caco-2 e outras células. Esta instalação foi adoptada com frequência para medir o crosstalk entre diferentes tipos9 de célula e pode ser usado para desvendar o Caco-2 perturbado resposta aos estímulos exógenos quando em co-cultura, em relação a Caco-2 cultivadas em paz.
Muitos estudos têm abordado Caco-2 comportamento quando co cultivadas com ambas as bactérias não-patogênicas e periférica de sangue células mononucleares, para elucidar, em particular, a interferência com o sistema imunológico10. Pozo Rubio et al . 11 estudaram a expressão de diversas citocinas em co-cultura um Caco-2/PBMC com bifidobactérias estimulando células Caco-2. Seu trabalho destacado modificação substancial para perfis de expressão de citocinas dependendo da estimulação bacteriana realizada na presença/ausência de PBMC. Seus resultados levam à conclusão de que a presença de PBMC sensibiliza Caco-2 de bifidobactérias.
Diferentes respostas de Caco-2 células de bactérias patogénicas e não patogénicas foram avaliadas por equipes de pesquisa diferente. Parlesak et al. 12 demonstrado os efeitos imunossupressores das células Caco-2 em Escherichia coli-estimulada PBMC. Além disso, Haller et al. 13 estudou a resposta das células Caco-2 estimuladas com ambos lipopolissacarídeo (LPS) de enteropatogênica Escherichia coli spp. ou bactérias não-enteropatogênica i.e.E. coli spp., Lactobacillus spp., reforçando o conjectura de que a resposta das células Caco-2 estritamente depende da presença de leucócitos na confi guração do co-cultura.
Através da realização de ensaios laboratoriais complementares diferentes (por exemplo, borrão ocidental, resistência elétrica trans-epitelial, MTT, etc), além da análise dos diferentes tipos de células cultivadas em co-cultura, promete a metodologia toda resultados que podem ser considerados mais representativo do que realmente acontece em vivo. Além disso, esta configuração permite a separação dos compartimentos diferentes co-cultura, permitindo não só o estudo dos tipos de célula envolvidos, mas também as moléculas de sinalização intercelulares lançadas no compartimento inferior superior vs ou na presença de vs ausência de co-cultura.

<table><tbody><tr><td>ThinCert Inserções de Cultura de Células de 6 Poços para Placas Multipoços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657610</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Células Multipoços, 6 Poços&nbsp;</td>Placa Multipoços para Cultura de Células de <td>Plástico</td> <td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td></tr><tr><td>, 24 Poços&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td>Plástico</td></tr><tr><td>RPMI 1640 sem L-Glutamina</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Lonza</td><td>DE14-801</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605C</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina&nbsp; 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Heal Force</td><td>HF240</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Ficoll Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td> Tubo de <td>Reagentes</td></tr><tr><td>, 50 mL, PP, Greiner de Fundo Cônico</td><td>Bio-one</td><td>227261</td> Tubo <td>de Plástico</td></tr><tr><td>, 15 mL, PP, Greiner de Fundo Cônico</td><td>Bio-one</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td> de Plástico <td>ThermoScientific</td><td>CL31R</td><td></td></tr><tr>Frasco de cultura de células de <td>reagentes</td> <td>de solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td></tr><tr><td>, 25 cm 2, PS</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>Clinac 2100 de plástico Acelerador linear</td><td>Varian</td><td>CLINAC 2100C / D</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio brometo (MTT)</td> <td>Reagentes</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Multiwell Plate Reader</td><td>GDV</td><td>DV990BV6</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0,4 %&nbsp;</td><td>Reagentes Amresco</td><td>K940</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Tripsina-EDTA</td><td>Reagentes Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>Tubos</td></tr> de <tr><td>1,5 mL</td><td>Reagentes Eppendorf</td><td>0030125150</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes Voltímetro/ohímetro Millicell-ERS</td><td>Millipore</td><td>MERS 00001</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento Cell Lysis Buffer (10x)</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>#9803</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>B&uuml; Equipamento de Hemocitômetro rker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR719520</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Quantificação de Proteína BCA</td><td>Abcam</td><td>ab102536</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>2x Tampão de Amostra Laemmli&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>#1610737</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>#1610710</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Accublock Digital Dry Bath</td><td>Labnet International Inc.</td><td>D1100</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Sem Manchas, 10 bem, 30 &micro; L</td><td>BioRad</td><td>#4568093&nbsp;</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Mini-PROTÉICO&nbsp; Tetra Célula de Eletroforese Vertical para Mini Géis Pré-moldados, 4-gel</td><td>BioRad</td><td>#1658004</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>PowerPac HC Fonte de Alimentação de Alta Corrente</td><td>BioRad</td><td>#1645052&nbsp;</td><td>equipamento</td></tr><tr><td>Padrões de Blotting WesternC da Proteína Precision Plus</td><td>BioRad</td><td>#1610385&nbsp;</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>10x Tris/Glicina/SDS Tampão de Corrida</td><td>BioRad</td><td>#1610732&nbsp;</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Trans-Blot&nbsp; Pacotes de Transferência de PVDF Turbo Mini</td><td>BioRad</td><td>#1704156</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Trans-Blot&nbsp; Sistema de Transferência Turbo</td><td>BioRad</td><td>#1704150</td><td>Bloqueador</td></tr><tr><td>de Grau de Blotting&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>#1706404</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93773</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Claudin-1 (D5H1D) XP&nbsp; Coelho mAb&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td> <td>#13255</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>ZO-1 (D7D12) Coelho mAb&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td> <td>#8193</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>ZO-2 Anticorpo&nbsp;</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>#2847</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Afadin (D1Y3Z) Tecnologia</td><td>de Sinalização Celular</td> mAb de Coelho<td>&nbsp;#13531</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Anti-Oclulina Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>ABT146</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Anti-NF-kB p65 anticorpo [E379]</td><td>Abcam</td><td>ab32536</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Anti-XIAP anticorpo&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab21278</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Amersham ECL Mouse IgG, Ab inteiro ligado a HRP (de ovelhas)</td> <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG, Ab inteiro ligado a HRP (de burro)</td> <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate, 200 mL</td><td>BioRad</td><td>#1705060&nbsp;</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Carestream&nbsp; Kodak&nbsp; autorradiografia GBX desenvolvedor/reforçador</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td>Reagentes</td></tr><tr><td>Carestream&nbsp; Kodak&nbsp; fixador/reforçador de autorradiografia GBX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Carestream&nbsp; Kodak&nbsp; BioMax&nbsp; filme leve</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z370401</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ System</td><td>BioRad</td><td>#1708270&nbsp;</td><td>equipamento</td></tr></tbody></table>

um método de co-cultura para investigar o crosstalk entre raio-x irradiados pbmc e células caco-2

A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

O protocolo adotado neste trabalho visa desvendar como radiografias perturbam o funcionamento da barreira intestinal, enfocando a interação entre as células do tumor colorretal e sistema imunológico. O carcinoma colorectal é entre o tipo mais comum de câncer, normalmente tratado pela cirurgia, quimioterapia e radioterapia. Vantagens de radioterapia em alvejar o tumor são bem conhecidas. No entanto, mesmo limitadas exposições de tecidos saudáveis são de grande preocupação, nomeadamente sobre os efeitos sobre a barreira intestinal e sistema imunológico. A configuração adotada permite estudar a interação entre duas populações de células em uma condição mais semelhante ao fisiológico, quando comparado com culturas de células normais. Para esse efeito, podemos recorrer a técnicas diferentes e usamos um modelo co-cultura em vitro , baseado em células Caco-2 diferenciadas como uma monocamada e PBMC, compartilhando o mesmo meio de cultura. Este protocolo foi desenvolvido com foco em ambos efeitos macroscópicos, ou seja, a viabilidade celular e resistência elétrica Trans-epitelial (TEER) e, através de borrão ocidental, alterações moleculares, ou seja, a ativação da via inflamatória em células do sistema imunológico e a expressão da proteína de junção apertada em células Caco-2. Primeira avaliação dos efeitos de radiação sobre a viabilidade de células Caco-2 foi avaliada através do brometo de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) e ensaios de Trypan azul, enquanto TEER foi medido em intervalos de tempo fixo através de um ohmímetro projetado especificamente para sistemas de co-cultura. Desta forma, os efeitos devido à radiação, a presença da células mononucleares de periférico sangue (PBMC) e eventualmente seu efeito sinérgico, podem ser demonstrados. Através destas técnicas complementares, observamos uma rádio-resistência elevada do Caco-2 dentro do intervalo de 2-10 Gy de raios-x e um aumento da permeabilidade monocamada de Caco-2 quando PBMC foram adicionado. Em particular, a presença PBMC foi encontrada para ser associado com a variação na expressão de proteínas do andaime de junção apertada.

Uma semana antes do experimento, as células são semeadas para a membrana porosa da inserção e permitiu a crescer durante os dias seguintes. O nível da confluência pode ser verificado ou usando um microscópio invertido ou através da medição dos valores de TEER. Com efeito, durante a fase de crescimento, TEER continua a aumentar até que toda a membrana porosa foi coberta por células e eles formam uma monocamada de células diferenciadas. Se as células se proliferam mais rápido/mais lento, o experimento poderia começar em pontos de tempo anterior/posterior após ser semeado. Quando na confluência, as células são então trazidas para as instalações de irradiação, minimizando o estresse ambiental transmitido (temperatura ou pH), antes de iniciar a co-cultura com/sem PBMC, semeado no compartimento inferior (Figura 1A), ou avaliando a proliferação de células Caco-2. Tendo em conta a densidade de semeadura inicial, no dia 0 células devem atingir 100% de confluência e criar um monolayer diferenciado de células epiteliais, que pode ser observado pelo planalto de TEER mostrado na Figura 1B. Uma vez que as células atingir tal status, o valor TEER é mantido relativamente constante ao longo da semana seguinte, enquanto o velho meio de cultura é substituído com meio fresco, pelo menos uma vez por semana (Figura 1B). Como mostrado na Figura 1C, o ensaio de MTT não mostra qualquer alteração estatisticamente significativa do estatuto proliferativa das células Caco-2 em 24 horas, nem a 48 h, independentemente da dose recebida (até 10 Gy).
Observou-se um resultado diferente sobre a mortalidade a curto prazo das células Caco-2. Em ambos os pontos de tempo, a coloração azul Trypan mostrar um aumento dose-dependente na mortalidade de célula. Estes resultados mostram um claro efeito de exposição a radiação, embora as porcentagens de células mortas parecem ser muito baixa, especialmente quando se considera que a dose mais elevada entregue (10 Gy) produz somente aproximadamente 20% de morte celular (Figura 1D).
As amostras foram co cultivadas com ou sem PBMC no compartimento inferior. Dado o fato que PBMC não recebeu qualquer estímulo externo para proliferar, um experimento de 48 h foi considerado ideal para evitar o viés introduzido por PBMC começando a morrer. Portanto, de imediatamente antes da irradiação, TEER foi regularmente medido por 48 h, para manter o controle de possíveis efeitos transitórios causados pelo protocolo de irradiação. Como mostrado na Figura 1 E-F, valores TEER são apresentados como variações relativas no que diz respeito a condição previamente tratada (que eram da ordem de 1200-1500 Ω·cm2) para melhor realçar a perturbação induzida pela irradiação do raio-x e / ou pela presença/ausência de PBMC na cultura co. Em ambos os casos, um pico de transiente inicial pode ser claramente observado no primeiro ponto de tempo após a exposição à radiação, que pode ser atribuída ao processo de irradiação.
Quando não em co-cultura com PBMC (Figura 1E), valores TEER são quase constantes acima de 48 h ao mesmo tempo, depois de 10 Gy de raios-x, as células apresentam uma diminuição prolongada de TEER começando no pós-irradiação 3h. A presença de PBMC modifica completamente a dinâmica temporal de TEER (Figura 1-F). Para todas as doses, é uma redução a TEER claramente observáveis de 3h até aproximadamente 30 h pós-irradiação, quando TEER aparece ao acordo em um valor constante (Figura 1-F).
Níveis de expressão de complexos de junção apertada foram investigados em lysates de células Caco-2 através do ensaio de borrão ocidental. Células caco-2 foram expostas a radiações ionizantes (com doses de 0, 2 e 10 Gy) e posteriormente cultivadas isoladamente ou em co-cultura com PBMCs no compartimento inferior para 48 h (como mostrado na Figura 2A-F). Para não ser significativamente alteradas por raio-x e/ou co-cultura com PBMC, acharam-se tanto Claudin-1 e Occludin (Figura 2A, 2B). Em vez disso, grandes flutuações observaram-se em proteínas andaime ZO-1, ZO-2 e Afadin (Figura 2C, 2D, 2E). Em particular, uma redução nos níveis de expressão ZO-2 é observada já depois de 2 Gy quando em co-cultura com PBMC enquanto apenas em 10 Gy quando Caco-2 foram crescendo sozinho. Níveis de expressão de Afadin em vez disso são afetados somente após 10 Gy de raios-x, com uma redução adicional quando Caco-2 são co cultivadas com PBMC.
PBMC co cultivada com Caco-2 foram analisado em relação o estado inflamatório, em particular, o fator de transcrição Nuclear kB (NF-kB) e o inibidor ligadas ao X da apoptose níveis de proteína (XIAP) têm sido investigados (Figura 2 G-eu). Quantidade total de NF-kB não foi afetada pela cultura co com Caco-2 expostos a doses de radiação diferentes (Figura 2G). Ao contrário, níveis XIAP eram 4-fold acima-está regulada em ambos a 2 Gy e 10 Gy co culturas, embora as grandes variações exigem um maior número de amostras analisadas para reduzir estas flutuações e ganhar um melhor poder estatístico.
Como mostrado na Figura 2F e 2I, algumas bandas inespecíficas podem aparecer ao lado do esperado peso molecular da proteína de interesse. A menos que bandas de verdadeiras e não-específica são facilmente distinguíveis, anticorpo diferente e/ou concentrações de BSA ou NFDM devem ser consideradas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56908/56908fig1.jpg"> Figura 1 . Configuração geral experimental e efeitos macroscópicos da exposição à radiação e/ou co-cultura PBMC. A) esquemática representação do modelo co-cultura. B) TEER valores medidos diariamente da semente inicial de células Caco-2 para avaliar o status de crescimento e diferenciação adequado da monocamada. Viabilidade celular C) e D) mortalidade em Caco-2 expostos aos raios x (0, 2, 5 e 10 Gy). Medições E) TEER em Caco-2 células irradiadas com 0, 2 e 10 Gy de raios-x cultivadas sem ou F) com PBMC. Cada valor é a média de experimentos independentes de ≥3 ± SEM. * p-val &lt; 0,05; * * p-va l &lt; 0,01; p-val &lt; 0,001. Gráficos adaptados de Morini et al. 15. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56908/56908fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56908/56908fig2.jpg"> Figura 2. Resultados Western Blot de Caco-2 e PBMC lysates. Nível de expressão das proteínas de junção apertada (Claudin-1 (A), (B) Occludin, ZO-1 (C), ZO-2 (D) e Afadin (E)) no Caco-2 após 0, 2 e 10 Gy de raios-x e na presença/ausência de PBMC em co-cultura. Os valores são normalizados no nível de actina. Filmes ilustrativos para cada proteína junção apertada e condições são mostradas no painel (F). Nível de expressão de NF-κB (G) e XIAP (H) em PBMCs co cultivadas com células Caco-2. Filmes representativos para NF-kB, XIAP e actina são mostradas no painel. Cada valor é a média de experimentos independentes de ≥3 ± gráficos SEM. adaptado de Morini et al. 15. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56908/56908fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Apresentamos um protocolo para investigar o crosstalk entre Caco-2 X-ray-irradiados e células mononucleares do sangue periférico (PBMC). O protocolo começa com a instalação e Caco-2 irradiação da cultura co com PBMC; posteriormente, resistência elétrica trans-epitelial é medida regularmente durante 48 h e ocidental do borrão realizados em PBMC e Caco-2.

Um método de co-cultura para investigar o Crosstalk entre raio-x irradiados PBMC e células Caco-2

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between ...

O objetivo geral deste protocolo de cocultura é medir os efeitos da radiação ionizante na permeabilidade da monocamada de células epiteliais Caco-2 e na função de junção apertada na presença ou ausência de células mononucleares do sangue periférico. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia da radiação e da radioimunoterapia sobre possíveis efeitos sinérgicos entre a exposição à radiação ionizante e as funções das células imunes. As principais vantagens desta técnica são que diferentes estímulos e população celular podem ser testados e fenômenos observados desacoplados através de medidas complementares ad hoc.Os procedimentos de radiação visam considerar a monocamada de células Caco-2 como o volume tumoral é irradiado com o feixe adequado e dosimetria precisa, como é o caso da radioterapia no paciente. Uma semana antes de sua irradiação, semeie cinco vezes 10 para as quintas células Caco-2 em dois mililitros de meio completo em uma inserção de cultura de células estéril de um micrômetro de diâmetro de poro por poço em uma placa de cultura de células de seis poços. Adicione três mililitros de meio completo fresco no compartimento inferior de cada poço e coloque as células em uma incubadora de cultura de células umidificada a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por sete dias.No último dia de incubação, adicione 25 mililitros de Ficoll a um tubo cônico de 50 mililitros. E coloque cuidadosamente 25 mililitros de sangue total recém-coletado sobre o Ficoll. Separar as células por centrifugação por gradiente de densidade.E use uma pipeta Pasteur para transferir as células mononucleares do sangue periférico ou PBMC na interface para um novo tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, lave o PBMC isolado em duas lavagens de PBS de 10 mililitros. E cultive o PBMC em meio completo fresco por não mais do que três a cinco horas na incubadora de cultura de células.Defina a energia de raios-x do fóton para um pico de seis megavolts. E coloque a cultura de células Caco-2 em uma folha de plexiglass de 1,4 centímetro de espessura dentro da trajetória dos raios-x e a 100 centímetros da fonte de radiação. Em seguida, coloque um bolus de 0,57 centímetro de espessura em cada amostra para garantir o equilíbrio do componente de radiação retroespalhada e das partículas carregadas.E use um campo de radiação plano e simétrico de 20 por 20 centímetros quadrados e uma taxa de dose de três cinzas por minuto para irradiar as células. Para avaliar a atividade metabólica e a viabilidade das células Caco-2, semeie duas vezes 10 elevado ao quinto Caco-2 células em cada poço de uma placa de 24 poços 24 horas antes de sua irradiação em 1,25 mililitros de meio completo. Em seguida, retorne as células à incubadora de cultura de células por 21 horas.No dia seguinte, adicione 100 microlitros de cinco miligramas por mililitro de solução de MTT a cada poço e incube as células por mais três horas. Depois de lavar as células com um mililitro de PBS, adicione 500 microlitros de dimetilsulfóxido a cada poço para dissolver quaisquer cristais de formazan liberados pelas células Caco-2 e avalie a absorbância com um leitor de placas de vários poços em um lambda de 570 nanômetros. Para avaliar a viabilidade celular do Caco-2, lavar as células com um mililitro de PBS por poço, seguido de descolamento das células com 100 microlitros de solução de tripsina-EDTA por dois minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2.Pare a reação com 500 microlitros de meio completo e transfira as células para tubos de microcentrífuga individuais de 1,5 mililitro para centrifugação. Ressuspenda os pellets em 50 microlitros de PBS por tubo e misture as suspensões celulares resultantes com um volume igual de solução de corante de viabilidade de azul de tripano. Após três minutos à temperatura ambiente, conte o número de células coradas viáveis não coradas e não viáveis no hemocitômetro.Para avaliar a resistência elétrica transepitelial ou TEER das células Caco-2, imediatamente após a transferência de irradiação, metade da cultura de células Caco-2 é inserida em uma nova placa com três mililitros de meio completo fresco em cada poço e metade das culturas inseridas em uma nova placa semeada com duas vezes 10 elevado ao sexto PBMC por três mililitros de meio completo por poço. Em seguida, coloque um eletrodo de pauzinho TEER no inserto de cultura de células a cada hora durante as primeiras seis horas e depois a cada três horas até 48 horas após a irradiação. Para análise de Western blot, 48 horas após a irradiação, lise as células Caco-2 e PBMC com 40 microlitros por um vezes 10 para as sextas células do tampão de lise celular.Ao lisar e raspar as células Caco-2, tome cuidado para não separar a membrana porosa da inserção, o que pode resultar em perda de lisado celular e resultado tendencioso. Armazene as amostras de células lisadas a menos 20 graus Celsius. Depois de quantificar a quantidade total de proteína em cada amostra de lise celular pelo método do ácido bicinconínico, adicione volumes iguais de tampão de amostra Laemmli suplementado com beta-mercaptoetanol a cada amostra de proteína total em tubos de microcentrífuga individuais.Aqueça as amostras a 95 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, colete as proteínas desnaturadas por centrifugação e carregue volumes totais de proteína iguais de cada amostra em um gel pré-moldado de quatro a 20%. Execute as amostras por uma hora a 120 volts.Em seguida, use um sistema de transferência elétrica semi-seco para transferir as proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno. Em seguida, coloque a membrana em um recipiente e bloqueie os locais de ligação inespecíficos com leite em pó desnatado a 5% em PBS suplementado com 0,2% Tween 20 por 60 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. No final da incubação de bloqueio, lave a membrana três vezes com 10 mililitros de 0,2% PBS Tween 20 por cinco minutos por lavagem e rotule a membrana com os anticorpos primários apropriados de interesse por uma hora em temperatura ambiente com agitação suave.Após incubação noturna a quatro graus Celsius com agitação suave, lave a membrana três vezes com 0,2% de PBS Tween 20 como acabamos de demonstrar e incube a membrana com os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano apropriados por 60 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Após três lavagens de PBS, incube a membrana com um kit de solução quimioluminescente aprimorado. Em seguida, crie imagens do filme resultante com um sistema de digitalização apropriado e quantifique os resultados com um programa de análise de imagem adequado.A irradiação de até 10 cinzas não altera a atividade metabólica das células Caco-2 24 ou 48 horas após a irradiação, embora a viabilidade celular diminua com o tempo em ambas as doses. A avaliação TEER de células Caco-2 não cocultivadas após exposição a dois cinzas de irradiação revela valores TEER consistentes até 48 horas após a irradiação. Após 10 cinzas de irradiação, no entanto, as células demonstram uma diminuição prolongada no TEER a partir de três horas após a irradiação.A cocultura com PBMCs resulta em uma redução de TEER que é evidente de três horas após a irradiação em ambas as doses até 30 horas após a irradiação, ponto em que os valores de TEER parecem permanecer relativamente consistentes. A análise de Western blot de proteínas de junção apertada não revela diferenças na expressão de Claudin-1 ou Occludin em resposta à irradiação e / ou cocultura de PBMC, enquanto grandes flutuações são observadas em várias proteínas de andaime. Além disso, a proteína total NF-kappa B não é afetada em nenhuma das doses de irradiação, enquanto os níveis de proteína XIAP são regulados positivamente quatro vezes em ambas as doses.Usando este procedimento, outros estímulos biológicos como Enterobactérias podem ser adicionados para responder a perguntas adicionais sobre como diferentes estímulos biológicos podem modificar a resposta da boa monocamada à exposição à radiação ionizante. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir o impacto da radiação ionizante e das células imunes na permeabilidade das células Caco-2 e na expressão do complexo de junção apertada.

a-co-culture-method-to-investigate-crosstalk-between-x-ray-irradiated

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo descreve a cultura de células de câncer de mama adjacentes a explantes ósseos de fêmur para medir a proliferação e colonização de células cancerígenas em um sistema modelo de explante de tecido ósseo humano.

Co-cultura de células BC: Cultura de células de câncer de mama com fragmentos ósseos para estudar a proliferação de células cancerígenas

Este vídeo descreve a co-cultura 3D de células de câncer de mama com monócitos para estudar sua interação em um ambiente baseado em extrato de matriz extracelular (ECME). Este método ajuda a estudar características específicas, como degradação do colágeno, recrutamento de células imunes e invasão celular.

Co-cultura 3D com interação direta: co-cultura de células cancerígenas com monócitos para estudar sua interação

Este vídeo demonstra a medição da resistência elétrica transepitelial em células Caco-2 irradiadas, tanto na presença quanto na ausência de células PBMC. Este método permite o estudo dos efeitos sinérgicos da radiação e das células imunes na barreira celular epitelial.

Medição de TEER em células epiteliais irradiadas por raios-X co-cultivadas com PBMCs

Adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável para mimetizar o microambiente tumoral (TME). O modelo consiste em uma cultura de células mistas, permite a geração simplificada de populações de células individuais altamente enriquecidas sem o uso de marcação fluorescente ou classificação de células e permite estudar a comunicação intercelular dentro do TME em condições normais ou de estresse.

A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação

Aqui, apresentamos um sistema confiável e simples bidimensional coculture (2D) para estudar a interação entre as células do tumor e da medula óssea de adipócitos, que revela um duplo efeito de fatores derivado de células de melanoma em adipócitos a medula óssea diferenciação e também coloca um método clássico para o estudo mecanicista da metástase óssea.

Efeitos duplos de fatores derivado de células de Melanoma na diferenciação de adipócitos de medula óssea

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única, a biologia do câncer requer novas ferramentas in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado. Descrevemos protocolos para explorar co-culturas microfluídicas imunes a tumores em cenários 2D e 3D, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico de funções celulares.

Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro

Aqui, apresentamos um procedimento de ensaio simples e eficaz para ensaios de poço de resorção usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio.

Um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro

Aqui, detalhamos um protocolo simples, rápido e confiável assistido por citometria de fluxo multiparamétrico e tumor em um chip para monitorar e caracterizar as etapas que constituem o ciclo de imunidade ao câncer. De fato, uma compreensão completa das interações entre câncer e células imunológicas fornece insights críticos para superar os tumores e orientar o atendimento clínico.

Sistemas de co-cultura in vitro para reproduzir o ciclo de imunidade ao câncer

O presente protocolo descreve um fluxo de trabalho experimental que permite a análise ex vivo da estimulação de células T humanas em um sistema de co-cultura alogênica com células tumorais pré-tratadas.

Análise da atividade de células T humanas em um ambiente de co-cultura alogênica de células tumorais pré-tratadas

Este artigo descreve métodos diferentes de...

Co-cultura de Modelos Pseudomonas aeruginosa Biofilmes Grown no Live Células Airway Humanos

Aprenda um método de co-cultura para investigar o efeito da radiação ionizante na permeabilidade do monolayer de células Caco-2 e na função das junções firmes na presença de células PBMC.

Um método de co-cultura para investigar o Crosstalk entre raio-x irradiados PBMC e células Caco-2

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