Name: Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a descelularização padronizada de corações fetais e adultos de camundongos para análise comparativa da matriz extracelular em contexto 3D. Este método preserva a arquitetura tecidual nativa e pode ser aplicado a outros órgãos.

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Os autores estão em dívida para todos os membros do laboratório de Pinto--Ó para discussão crítica relevante. Este trabalho foi financiado pelo Programa MIT-Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) no âmbito do projecto "CARDIOSTEM-engenharia de tecidos cardíacos e terapias baseadas em células-tronco para aplicações cardiovasculares" (MITP-TB/ECE/0013/2013). A.C.S. é um destinatário de uma bolsa da FCT [SFRH/BD/88780/2012] e M.J.O. é um companheiro da FCT (FCT-investigador 2012).

Todas as metodologias descritas foram aprovadas pelo i3S Comitê de ética Animal e Direção Geral de Veterinária (DGAV) e estão em conformidade com a europeias Parlamento Directiva 2010/63/CE.
1. preparação das soluções decellularization
Nota: Decellularization todas as soluções devem ser filtradas através de um filtro de membrana de 0,22 μm e armazenadas por um período máximo de 3 meses, exceto especificado o contrário.
<ol><li>Para 1X PBS: misturar 8 g de NaCl, 1,01 g de Na2HPO4 200 mg de KCl e 200 mg de KH2PO4 com 900 mL de água deionizada (água DI). Ajuste o pH da solução de 7,5 e o volume de solução final para 1 filtro de L., autoclave e armazenar a solução à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Para Buffer hipotônica (10 mM Tris, 0,1% EDTA): dissolver 1,21 g de TrisBASE e 1 g de EDTA em 900 mL de água desionizada. Ajustar o pH da solução para 7,8 com NaOH/HCl e o volume de solução final para 1 L. filtro, esterilize em autoclave e armazenar no RT</li>
	<li>Para solução de SDS de 0,2% (0,2% SDS, 10mm Tris): Adicionar 0,6 g de TrisBASE e 1 g de sulfato dodecyl de sódio (SDS) em 400 mL de água Desionizada e mexa a 60 ° C até a dissolução completa de soluto. Deixe a solução arrefecer a pH de solução RT. Adjust para 7,8 e o volume da solução final de 500 mL. Esterilize a solução por filtração. Nota: A solução de SDS deve ser preparada antes de usar. Solução de filtro só depois completar a dissolução do SDS, caso contrário as partículas insolúveis SDS ficarão saturados o filtro, mudando a concentração final de SDS e, consequentemente, afetando a eficiência de decellularization de tecido.</li>
	<li>Para tampão de lavagem hipotônica (10 mM Tris): misturar 1,21 g de TrisBASE em 900 mL de DI água. Ajustar o pH da solução para 7,8 e o volume final para 1 L. filtro, esterilize em autoclave e armazenar no RT</li>
	<li>Para o tratamento de DNase (20 mM Tris, 2 mM MgCl2, 50 DNase U/mL): dissolver 2,42 g de TrisBASE e 2 mL de 1m MgCl2 em 900 mL de água Desionizada. Ajustar o pH a 7,8 e o volume de solução final para 1 L. filtro e esterilizar a solução por autoclave. Armazenar a solução no RT. Adicionar DNase eu (50 U/mL) antes de usar.</li>
	<li>Para DNase armazeno solução: preparar uma reserva de DNase contendo 50% de glicerol, pH 7,5, 1 mM MgCl2, do Tris-HCl de 20mm e ajustar para um volume de solução final de 10 mL com água. Em uma capa de fluxo laminar, adicione o DNase I do pó para o buffer de DNase e misture suavemente até dissolução completa. Esterilize a solução através de filtro de 0,22 μm. Alíquotas de 1ml de preparar e armazenar a-20 ° C.</li>
</ol>2. tecido colheita e criopreservação
<ol><li>Eutanásia em fêmeas grávidas adultas em 18 dias de gestação (fetos E18) através do CO2 asfixia. Realizar uma cesariana em fêmeas com uma tesoura cirúrgica e coletar os cornos uterinos, tendo os ratos fetais para uma placa de Petri com PBS 1x gelada usando duas pinças serrilhadas com pontas curvadas (uma pinça para cada extremidade do chifre).<ol>
<li>Abra os cornos uterinos e o saco amniótico para isolar os fetos. Transferi os fetos para uma nova placa de Petri com PBS 1x gelada para anestesia e decapitar com uma tesoura.</li>
		<li>Eutanásia em camundongos C57BL/6 machos 7-8 semanas de idade, usando CO2 asfixia. Realizar uma incisão no peito cada rato e recolher o coração.</li>
		<li>Brevemente enxague o coração fetal e adulta com gelo frio 1X PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova os átrios do coração adulto com a ajuda de um bisturi. Realizar uma incisão no ventrículo direito e removê-lo usando tesouras pequenas em linha reta. Expor a parede interna do ventrículo esquerdo através da remoção do septo. Em uma nova placa de Petri, dividir o ventrículo esquerdo livre-parede em tiras longitudinais com espessura de 2 mm e remover o músculo papilar usando um bisturi e uma pinça serrilhada com pontas curvadas.<ol>
<li>Impostos especiais de consumo pequeno tecido explantes com a ajuda de um bisturi, usando uma grade de 2 x 2 mm (descrição detalhada na complementar 1 da figura5). Brevemente enxague o tecido explantes com PBS 1x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione ~ 250 µ l da temperatura de corte ideal (OCT) composta para tubos de microcentrifuga autoclavado 1,5 mL. Transferir todo fetais corações e explantes cardíacas adultos para os tubos com 250 µ l de PTU e congelá-los com gelo seco refrigerado isopentano e loja a-80 ° C (até um máximo de 6 meses). Nota: O uso de tecido cardíaco explantes criopreservado por mais de 6 meses irá reduzir significativamente a eficiência de decellularization, especialmente em explantes de tecido do coração adulto.</li>
</ol>3. decellularization de tecido
Nota: Decellularization de tecido cardíaco é executada em uma placa de cultura de tecido de 24-poço com uma amostra por bem. Bem, 1 mL de cada solução de decellularization é adicionado para cada indivíduo. Todos os decellularization de etapas devem ser executadas com agitação a 165 rpm (agitador incubadora orbital de 20 mm de diâmetro) e a 25 ° C, a menos que especificado em contrário. Para mais detalhes, consulte o esquema na figura 1A. Anfotericina B (fungizone, por exemplo ) e gentamicina são recém adicionados a todas as soluções de decellularization antes do uso para uma concentração final de 2,5 μg/mL e 0,01 μg/mL, respectivamente. Para quantificar a quantidade de DNA mantida dentro de tecidos decellularized, a amostra massa precisa ser determinada antes de iniciar o protocolo decellularization. O protocolo de quantificação de DNA é mais detalhadas na seção 5.1.
<ol><li>
DIA 1
	<ol>
<li>Retire amostras de tecido do freezer-80 ° C. Deixe a 1,5 mL microcentrifuge tubos em RT até OCT torna-se parcialmente derretido. Transferi o bloco de tecido cardíaco da OCT ainda congelado para uma placa de Petri com PBS 1x.</li>
		<li>Depois derrete a OCT, mova o tecido cardíaco para uma nova placa de Petri com PBS 1x. Amostras de lavagens em 1 x PBS e a 60 rpm com um misturador de 10-15 min. repetir pelo menos duas vezes.</li>
		<li>Adicione 1 mL de trabalhar hipotônica Buffer por alvéolo de uma placa de cultura de tecidos de 24-poço estéril. Transferi uma amostra por poço com a ajuda de pinças.</li>
		<li>Mova a placa de cultura de tecidos de 24-bem com as amostras de um agitador de incubadora a 25 ° C e iniciar a incubação de 18 h com Buffer hipotônica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DIA 2
	<ol>
<li>Prepare a solução de SDS de 0,2%, conforme descrito na seção 1.3.</li>
		<li>Aspirar o Buffer hipotônica e lavar as amostras com PBS 1x por vezes de 1 h. repetir 3. Nota: Ponto de pausa: tecido sob decellularization pode ser mantido em 1X PBS a 4 ° C por 18 h em condições estáticas.</li>
		<li>Remover a PBS 1x, adicionar 1 mL da solução de SDS recém-feitos (etapa 1.3) por bem e incubar as amostras por 24 h. Nota: Incubação SDS de Post (CHECK POINT), certifique-se de que as amostras apresentam um branco a aparência translúcida. Neste passo, SDS tratadas amostras são encharcadas de DNA, apresentando uma consistência de gelatina. Remova a solução de SDS lentamente para evitar aderência de amostra para a ponta da pipeta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DIA 3
	<ol>
<li>Lave as amostras com amortecedor da lavagem hipotônica (1 mL por bem) por 20 min. repetir 3 vezes. Nota: Neste passo, é normal observar uma diminuição do tamanho da amostra devido à remoção de restos celulares. PONTO de pausa: Tecido sob decellularization pode ser mantido no tampão de lavagem hipotônica a 4 ° C por 18 h em condições estáticas.</li>
		<li>Adicionar 1 mL da solução de tratamento de DNase por bem e incubar as amostras por 3 h a 37 ° C.</li>
		<li>Aspirar a solução de tratamento de DNase e lavar as amostras com PBS 1x (1 mL por bem) por 20 min. repetir 3 vezes. Realize uma lavagem final com PBS 1x (1 mL por bem) durante a noite no RT e sacudindo a 60 rpm.</li>
		<li>(Ponto de verificação) Após o tratamento de DNase, certifique-se de que as amostras decellularized perderam a consistência de gelatina. Nota: Após o tratamento de DNase, retire e adicione 1X PBS suavemente, desde que as amostras podem ser facilmente aprisionadas e anexadas a ponta da pipeta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. avaliação da remoção de células do tecido decellularized
<ol><li>Corrigir as amostras em uma placa de cultura de tecido de 24-poço, 1 amostra por alvéolo, adicionando 1 mL de recém-feitos tampão neutro de formalina 10% com eosina aquosa de 0,03% para 2,5-3 h no RT Nota: Eosina é adicionada para o fixador para manchar o tecido decellularized e para facilitar a visualização da amostra durante o corte e a coloração histológica. A adição da eosina que nem interfere com as manchas histológicas, nem com as técnicas de imunofluorescência. Alternativamente, a fixação pode ser realizada durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Remover a solução fixador e adicione 1 mL de 1X PBS para lavar a amostra.</li>
	<li>Encapsule o bioscaffolds fixo no processamento de histologia gel usando um molde de amostra de vinil descartáveis de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Remova o gel histologia com a amostra incorporada do molde e transferência para fitas de processamento/incorporação de biópsia com tampa. Nota: Uma alternativa ao tecido incorporação em histologia e processamento gel é para processar cada amostra em duas esponjas de biópsia com pequenos poros. As amostras devem ser localizadas ao centro das esponjas para habilitar a detecção de biópsia. Digno de nota, algumas amostras podem ser difíceis de localizar usando esta abordagem.</li>
	<li>Processar as amostras para parafina incorporação através da incubação do sucessivas (30 min por solução) em série de concentrações de álcool (70%, 80%, 90%, 100%, 100%), solução de Hidrocarboneto alifático ISO-parafínicos (2 estações de incubação) e parafina (incubação 2 estações) a 56 ° C.</li>
	<li>Monte as amostras em um bloco de parafina.</li>
	<li>Corte 3 seções de parafina μm de espessura em um micrótomo e recolher as seções sobre lâminas de microscópio.</li>
	<li>Cortes de parafina secar durante a noite a 37 ° C. Nota: Cortes de parafina (pausa ponto) são armazenadas a 4 ° C até utilização posterior.</li>
	<li>Para verificar a eficiência do protocolo, execute hematoxilina e eosina (H & E) e Trichrome de Masson coloração (MT) das secções de amostra decellularized e secções de tecido não-manipulada de acordo com as instruções do fabricante. Nota: H & E mancha manchas cela núcleos azul/roxo, citoplasma rosa/vermelho escuro e rosa pálido de colágeno e MT manchas núcleos pretos, vermelha, citoplasma e colágeno e mucina azul. Decellularization eficiente é alcançada quando uma luz rosa porosa (H & E, MT) e azul rede (MT) é observada, na ausência de uma mancha nuclear.</li>
</ol>5. avaliação da remoção de material nuclear de tecido decellularized
Nota: A quantificação do teor de DNA no tecido decellularized deve ser realizada em comparação com o respectivo tecido não-manipulada.
<ol><li>Antes decellularization, pese um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL em uma balança digital de alta precisão. O tecido cardíaco de transferência para o tubo, remover a quantidade extra de 1X PBS e pesar o tubo com as amostras. Calcule o peso molhado das amostras: Peso úmido da amostra = peso tubo com amostras – peso tubo vazio
</li>
	<li>Decellularize as amostras conforme descrito na etapa 3.</li>
	<li>Após decellularization, colete os tecidos decellularized em um tubo de microcentrifugadora.<ol>
<li>Devido às pequenas dimensões e massa das amostras cardíacas individuais e as especificações do kit, piscina decellularized tecidos de cada condição de amostra (coração fetal: 5 corações toda; adulto LV explantes: 15 explantes). Execute o mesmo procedimento com o tecido não-manipulado. Nota: (Ponto de pausa) as amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até a extração de DNA e quantificação são executadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cortar o não-manipulada e decellularized tecidos em pequenas explantes com a ajuda de um bisturi em um tubo de ensaio limpo. Nota: Utilize um bisturi individual e placa de Petri para cada amostra. Ruptura mecânica das amostras com um bisturi facilita sua posterior digestão enzimática e posterior extração de DNA.</li>
	<li>Para a extração de DNA, use um método de extração de DNA de rotação-coluna com base de acordo com as instruções do fabricante.<ol>
<li>Colete as amostras dissociadas mecanicamente da placa de Petri com o buffer de mestre digestão (digestão buffer e proteinase K) de acordo com as instruções do fabricante usando uma ponta de pipeta de orifício largo. Nota: Lise de tecido com Proteinase K digestão é mais rápida em decellularized amostras. Para processar amostras distintas ao mesmo tempo, manter amostras lisadas no gelo, até que todas as amostras lysed para minimizar a degradação. Lise de amostras completa é alcançada entre 4-6 h.</li>
		<li>Prossiga com o protocolo de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Para aumentar o rendimento de DNA extraído de amostras de tecido decellularized e não decellularized, Eluir o DNA em 25-50 μL e 100 μL de tampão de eluição, respectivamente. Coletar o DNA eluted e carregar a rotação-coluna. Incube durante 1 min no RT. Centrifugar as amostras de acordo com as instruções do fabricante. Nota: (Pausa ponto) o ADN extraído das amostras pode ser loja a-20 ° C até utilização posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificar o DNA extraído de amostras com um kit de deteção fluorescente dsDNA seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Normalize o conteúdo de DNA como nanogramas de DNA por miligrama de massa úmida da amostra inicial (antes decellularization).</li>
</ol>6. célula decellularized andaimes semeadura
Nota: Todas as soluções/reagentes precisam ser esterilizadas e todo o procedimento realizado em condições estéreis.
<ol><li>Preparar 1 x DPBS com 2,5 μg/mL de anfotericina B e 1% P/S (penicilina, 100 UI; estreptomicina 100 µ g/mL).</li>
	<li>Retire a última etapa de lavagem de decellularization (etapa 3.3.3) a 1 x solução de PBS e adicionar 500 μL por poço do recentemente preparada 1 x DPBS/2,5 μg/mL de solução B/1% P/S anfotericina. Armazenar as amostras em 4 ° C, de 1-7 dias. Nota: O armazenamento de amostras a 4 ° C é importante para manter a esterilidade.</li>
	<li>Adicione P/S a célula basal mídia (sem FBS e suplementos) a uma concentração final de 1%.</li>
	<li>Aspire 1 x DPBS/2.5 μg/mL de solução B/1% P/S anfotericina das amostras decellularized. Adicionar 500 μL por poço de célula basal media/1% P/S e deixe amostras equilibrar durante 1 h a 37 ° C, ou a 4 ° C por mais de 1h.</li>
	<li>Dividir as células de interesse e preparar pequenas alíquotas de células para a densidade da célula desejada. Nota: O tecido decellularized semeadura deve ser realizada sob um microscópio estereoscópico e em condições estéreis. Meios de cultura de célula deve conter 1% P/S.</li>
	<li>Adicionar 3-4 μL de DPBS ao centro de um poço de uma placa de 96 poços. Usando uma pinça fina e reta, transferir os andaimes decellularized para a queda DPBS, remover o DPBS extra por aspiração e certifique-se que a amostra não é dobrada ou amassada. Deixá-lo a tornar-se seca nas bordas para aderir à superfície bem. Nota: Andaimes destacados tem baixa eficiência de semeadura.</li>
	<li>Adicione células para o cadafalso pipetando a célula única solução lentamente contra as bordas do poço. Nota: por exemplo, rato neonatal cardiomyocytes são semeadas com em uma densidade de 7.500 células/mm2 e rato imortalizado Lin− Sca-1+ cardíaca células progenitoras (iCPCSca-1) com uma densidade de 60-1.500 células/mm2. Ajuste a densidade da célula de acordo com a lógica experimental.</li>
	<li>Adicione DPBS nos poços vizinhos para evitar a evaporação rápida da mídia.</li>
	<li>24 horas pós semeadura de célula, se o tipo de célula usado aderiu para as placas de poliestireno de cultura de tecidos (PFC), transferência de bioscaffolds para um novo poço. Caso contrário, substitua o meio para remover as células não-aderentes.</li>
	<li>Mude-se cuidadosamente os meios de comunicação de acordo com exigências específicas do tipo de célula.</li>
</ol>

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<li>Coolen, N. A., Schouten, K. C., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+human+fetal+and+adult+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison between human fetal and adult skin.</a> Arch Dermatol Res. 302 (1), 47-55 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A matriz extracelular (ECM) é uma malha altamente dinâmica e complexa de glicoproteínas fibrosas e adesivas, consistindo de um reservatório de inúmeros peptídeos bioativos e fatores de crescimento aprisionados. Como o principal modulador de adesão celular, dinâmica do citoesqueleto, mobilidade/migração, proliferação, diferenciação e apoptose, ECM ativamente regula o comportamento e a função celular. Sabendo que o diferente comportamento celular em culturas 2D e 3D, tem havido esforços para desenvolver modelos de romance ...

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The fourth&#160;affiliation&#160;was corrected from:
Gladstone Institutes, University of California San Francisco
to:
Gladstone Institute&#160;of Cardiovascular Disease
An additional affiliation was added for Todd C. McDevitt:
University of California San Francisco

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Erratum: Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

A matriz extracelular (ECM) é uma rede dinâmica de moléculas que regulam processos celulares importantes, nomeadamente o destino-decisão, proliferação e diferenciação de1,2. A investigação de interacções célula-ECM foi realizada principalmente em duas dimensões (2D) em vitro culturas revestido com componentes de ECM, que constituem uma simplificação das propriedades nativas de ECM encontrado na vivo. Decellularization gera bioscaffolds de ECM 3D-como acelular que preservam em grande parte a arquitetura extracelular e composição de tecidos nativos e órgãos3,4. Além de servir como andaimes bioativos para a engenharia de tecidos, biomateriais de ECM decellularized 3D estão emergindo como plataformas de romance para avaliar biologia celular-ECM desse paralelo o ambiente em que vivo.
Avaliação da função diferencial dos componentes de diferentes tecidos, órgãos e idade ECM serão beneficiados com o uso de protocolos semelhantes de gerar bioscaffolds nativo. No coração, temos desenvolvido um protocolo versátil para decellularization de amostras fetais e adulto-derivado, como uma abordagem alternativa para realizar estudos comparativos com o microambiente do órgão. Usando esta metodologia, capturamos o microambiente cardíaca nativa e mostrou que o ECM fetal promove maior rendimento de repovoamento de células cardíacas5. Decellularization ainda mais desde a identificação de residentes diferenças estruturais entre ECM fetal e adulto ao nível da cave lamina e pericelular matriz malha o arranjo e composição de fibra5. Antes deste trabalho, Head-to-comparação de tecidos em diferentes estágios de ontogenic, usando a mesma abordagem de decellularization só tem sido relatado para roedores corações e rins de macaco rhesus. Além disso, um número limitado de estudos relatam o tecido fetal/órgão decellularization por si5,6,7. Isto foi conseguido usando SDS como agente exclusivo de decellularization; no entanto, distintas concentrações de SDS foram usadas para o decellularization do tecido cardíaco fetal e adulto7,8. SDS é um dos detergentes iônicos mais eficazes para o apuramento de material citoplasmático e nuclear e amplamente utilizado na decellularization de diferentes tecidos e espécimes9,10. Soluções contendo altas concentrações de SDS e longos períodos de exposição tem sido correlacionadas com a desnaturação da proteína, a perda de glicosaminoglicano (GAGs) e a ruptura do colágeno fibrilas10,11e, portanto, um equilíbrio entre preservação e célula remoção de ECM é necessário. Para aplicar o mesmo procedimento para o tecido cardíaco fetal e adulto, o protocolo descrito neste documento é dividido em três etapas sequenciais: lise de células por choque osmotic (hipotônica tampão); solubilização dos lipídios-proteínas, ADN-proteína e proteína-proteína interações (0,2% SDS); e remoção de material nuclear (tratamento de DNase).
Nosso protocolo mostra várias vantagens: eu) a possibilidade de decellularization equivalente dos tecidos cardíacos de idade específica aplicando a mesma estratégia de decellularization; II) sem requisitos para métodos especializados ou equipamento; III) pronta adaptação para outros tecidos e espécies como foi aplicado com sucesso com pequenas alterações em biópsias de intestino humano12 e mouse pulmão13; e, importante, iv) pode resolver propriedades biomecânicas de ECM, permitindo a montagem de organotypic 3D-como as culturas que mais estreitamente imitam as características moleculares do microambiente do tecido nativo.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubated Benchtop Shaker</td><td>Orbital</td><td>Shakers IKA:3510001</td><td>Fluorímetro recomendado</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td></td> <td>Equipamento disponível</td></tr><tr><td>Balança digital</td> <td>-</td><td></td> <td>Equipamento disponível</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td> <td>-</td><td></td> <td>Equipamento disponível</td></tr><tr><td>Incubadora de cultura de células</td> <td>-</td><td></td> <td>Equipamento disponível</td></tr><tr><td>Geladeira (4&ordm; C)</td> <td>-</td><td></td> <td>Equipamento disponível</td></tr><tr><td>Freezer (-80&ordm; C)</td> <td>-</td><td></td> <td>Equipamento disponível</td></tr><tr><td>micrótomo</td> <td>-</td><td></td> <td>Equipamento disponível</td></tr> <tr><td>< forte > instrumentos cirúrgicos < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tesoura de mola Vannas - ferramentas de ciência fina de ponta de 2,5 mm</td><td></td><td>5000-08</td><td>Recomendado</td></tr><tr><td>Dumont 5 Pinça Fina - Ferramentas de Ciência Fina Biologie / Inox</td><td></td><td>11254-20</td><td>Recomendado</td></tr><tr><td>Dumont 7 fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação recomendada, reta</td> <td>-</td><td></td> <td>Ferramenta disponível</td></tr><tr><td>Fórceps, serrilhada, curvada</td> <td>-</td><td></td> <td>Ferramenta disponível</td></tr> <tr><td>< forte > materiais< / forte > placas de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>24 poços, embaladas individualmente</td><td>VWR</td><td>29442-044</td><td>-</td></tr><tr><td>Placas de 96 poços, embaladas individualmente</td><td>VWR</td><td>71000-078-Steriflip-GV</td><td></td></tr><tr><td>, 0.22&micro; m, PVDF, Millipore Radio-Esterilizado</td><td></td><td></td> <td>SE1M179M6-Eppendorff</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td>-</td><td>Material disponível</td></tr><tr><td>15 mL Tubos Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>430791-50 mL Tubos Falcon</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>430829-Four-Compartment Biopsy Processing/Embedding com Tampa</td><td>Microscopia Eletrônica Science</td><td>70075-B</td><td>-</td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio Superfrost Plus Fisherbrand</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>-</td></tr><tr><td>Criopreservação de tecidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resina de incorporação Shandon Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td> <td>6769006-2-METILBUTANO</td><td></td></tr> <tr><td>ANIDRO 99+% (isopentano)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277258-1L-Gelo</td><td></td></tr> <tr><td>seco</td><td>- </td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Decellularization</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BDH Prolabo</td><td>27810.364-Na</td><td></td></tr><tr><td>2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-31264-KH</td><td></td></tr><tr><td>2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379-100g-KCl</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8041-1KG-TrisBASE</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G-Sulfato</td> <td>de</td></tr> <tr><td>dodecil de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-4390-MgCl</td><td></td></tr><tr><td>2</td><td>MERCK</td><td>1.05833.1000-DNAse</td><td></td></tr> <tr><td>I</td><td>AplliChem</td><td>A3778,0050-Gentamicina</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>-</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco BRL</td><td>15290-026-Água</td><td></td></tr> <tr><td>deionizada (água DI)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-<forte>Histologia</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% tampão neutro de formalina</td><td>Prolabo</td><td>361387P-Eosina</td><td></td></tr> <tr><td>Y AQUOSA</td><td>Surgipath</td><td>01592E</td><td>Pode ser substituído por eosina alcoólica</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific HistoGel Gel de processamento de espécimes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012-Álcool</td><td></td></tr> <tr><td>etílico 99,5% anydrous</td><td>Aga</td><td>4,006,02,02,00-Água</td><td></td></tr> <tr><td>deionizada (água DI)</td> <td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>Clear Rite 3</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>6915-Shandon</td><td></td></tr> <tr><td>Histoplast</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RAS.6774006</td><td>-</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PureLink Genomic DNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>K182001-Quant-iT PicoGreen&nbsp; Kit dsDNA</td><td>Invitrogen</td><td>P11496</td><td>-</td></tr><tr><td>Cultura de células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>VWR</td><td>45000-434-Penicilina-Estreptomicina</td><td></td></tr> <tr><td>Solution 100X</td><td>Labclinics</td><td>L0022-100-Fungizone</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Gibco BRL</td><td>15290-026-Meio</td><td></td></tr> <tr><td>de cultura celular da célula de interesse</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco fetal e adulto como plataformas 3d-como para estudos de vitro

Comparable Decellularization of Fetal and Adult Cardiac Tissue Explants as 3D-like Platforms for In Vitro Studies

Conhecimento atual da matriz extracelular (ECM)-célula comunicação se traduz em estudos de grande bidimensional (2D) cultura in vitro, onde os componentes de ECM são apresentados como um revestimento de superfície. Estes sistemas de cultura constituam uma simplificação da natureza complexa do tecido ECM que engloba a composição bioquímica, estrutura e propriedades mecânicas. Para melhor emular a ECM-célula comunicação moldar o microambiente cardíaca, desenvolvemos um protocolo que permite a decellularization do coração fetal toda e tecido adulto ventrículo esquerdo explants simultaneamente para estudos comparativos. O protocolo combina a utilização de um buffer hipotônica, um detergente de surfactante aniônico Propriedades e tratamento de DNase sem qualquer exigência de habilidades especializadas ou equipamento. A aplicação da estratégia de decellularization da mesma através de amostras de tecido de indivíduos de idade diferentes é uma abordagem alternativa para realizar estudos comparativos. O presente protocolo permite a identificação das únicas diferenças estruturais entre fetais e adultas cardíaca ECM malha e biológicas respostas celulares. Além disso, a aqui a metodologia demonstra uma aplicação mais vasta, sendo aplicada com sucesso em outros tecidos e espécies com pequenos ajustes, tais como em biópsias de intestino humanas e pulmão do rato.

A eficiência de decellularization deve ser avaliada através de três principais técnicas: observação macroscópica, histologia e quantificação de DNA. A aparência macroscópica de tratamento de amostras post-SDS indiretamente afeta a eficácia da remoção da célula. Após a incubação do SDS, amostras devem aparecer como translúcidas para esbranquiçado (Figura 1). Fetal (E18) decellularized tecidos são caracterizados por uma estrutura altamente translúcida enquanto ...

A cardíaca matriz extracelular (ECM) é uma rede complexa de moléculas que orquestrar processos-chave em tecidos e órgãos enquanto duradoura remodelamento fisiológico durante toda a vida. Decellularization padronizada do coração fetal e adulta permite estudos comparativos de experimentais de ambos os tecidos em um contexto 3D capturando arquitetura nativa e propriedades biomecânicas.

Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro

Current knowledge of extracellular matrix (ECM)-cell communication translates to large two-dimensional (2D) in vitro culture studies where ECM components ...

Este método pode ajudar a abordar questões importantes no campo cardiovascular sobre o impacto que a matriz extracelular tem durante diferentes estágios fisiológicos e de desenvolvimento do coração. A principal vantagem dessa técnica é que permite uma análise comparativa entre matrizes extracelulares fetais e adultas, aplicando um método de descelularização semelhante aos dois tipos de tecido. Assim, esse método tem sido bem sucedido aplicado a outros órgãos, como ressecções cirúrgicas de pacientes com câncer facilitando o estudo da matriz extracelular em diferentes contextos.Comece enxaguando brevemente os corações de camundongos fetais e adultos com PBS gelado. Em seguida, coloque os tecidos sob um microscópio dissecando e use uma tesoura pequena reta para remover a atria, o ventrículo direito e o septo dos corações do rato adulto. Transfira o ventrículo esquerdo para uma nova placa de Petri e divida a parede livre do ventrículo esquerdo em tiras longitudinais de dois milímetros de espessura.O uso de explants ventrículos esquerdos de camundongos adultos de tamanho homogêneo é essencial para uma eficiência consistente de descelularização. Use o bisturi e pinças serrilhadas com ponta curva para remover o músculo papilar antes de usar uma grade de dois por dois milímetros para cortar ainda mais as tiras em fragmentos de tecido menores. Quando todo o tecido tiver sido picado, enxágue brevemente as peças com PBS suficiente para cobrir as explantas.E transfira os corações fetais e pedaços de tecido cardíaco adulto em tubos individuais de microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo 250 microliters de temperatura de corte ideal ou composto oct por tubo. Em seguida, congele as amostras de tecido cardíaco em isócecia resfriada de gelo seco para armazenamento a 80 graus Celsius negativos. Para descelularizar os tecidos preservados crio-preservo coloque as amostras congeladas em uma placa de Petri contendo PBS suficiente para cobrir completamente as explantas.Após o derretimento do OCT, submerse as amostras em uma nova placa de Petri da PBS e lave as amostras três vezes em um agitador por 10 a 15 minutos a 60 RPM por lavagem. Após a última lavagem, adicione um mililitro de tampão hipotônico de trabalho a cada poço de uma placa de cultura tecidual estéril de 24 poços e use fórceps finos para transferir um fragmento para cada poço. Incubar a placa a 25 graus Celsius durante 18 horas, a 165 RPM seguido de três lavagens de uma hora em um mililitro de PBS por poço, por lavagem.Após a última lavagem, adicione um mililitro de sulfato de dodecyl de sódio recém-preparado ou solução de SDS para cada poço para uma incubação de 24 horas a 25 graus Celsius. No dia seguinte, enxágue as amostras com três lavagens de 20 minutos em um mililitro de tampão de lavagem hipotônica por lavagem seguido da adição de um mililitro de solução de tratamento DNase para cada poço para uma incubação de três horas, a 37 graus Celsius. No final da incubação, as amostras descelularizadas devem perder sua consistência semelhante à gelatina.Em seguida, lave os fragmentos de tecido três vezes com um mililitro de PBS por 20 minutos por lavagem seguido de uma lavagem durante a noite em um mililitro de PBS fresco por poço em temperatura ambiente e 60 RPM. Para avaliar a remoção de restos celulares do tecido descelularizado, na manhã seguinte fixe as amostras em um mililitro de tampão neutro de fórmula recém-preparada complementada com 0,03% de eosina aquosa por poço por 2,5 a 3 horas à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as amostras em um mililitro de PBS por poço.E use um molde de espécime de vinil descartável para encapsular os fragmentos descelularizados em gel de processamento de histologia de acordo com as especificações do fabricante. Em seguida, transfira os fragmentos encapsulados para um processo de biópsia incorporando. E processe as amostras para parafinas incorporando através de sucessivas incubações de 30 minutos em concentrações ascendentes de etanol, solução de hidrocarbonetos alifáticos isoparafina e dois parafinas de 56 graus Celsius.Após a segunda parafina emergente, monte amostras em um bloco de parafina e use um microtómeo para obter seções de três micrômetros de espessura. Em seguida, verifique a eficiência de descelularização colorindo as seções com hematoxilina e eosina e as manchas tricráticas de Masson de acordo com os protocolos padrão. Após a lavagem da PBS durante a noite com agitação, adicione 500 microliters de DPBS recém-preparados, complementados com 2,5 microgramas por mililitro de solução de anfotericina B 1% antibiótico para cada andaime.E armazene as amostras por um a sete dias a quatro graus Celsius. Antes de acomodar as células, substitua a solução DPBS por 500 microliters de meio basal celular suplementados com antibióticos. E incubar os andaimes por uma hora a 37 graus Celsius.No final da incubação, use um microscópio para adicionar uma queda de quatro microliter de DPBS ao centro de um poço de uma placa de 96 poços por andaime. E use pinças retas finas para transferir um andaime descelularizado para o topo de cada gota. Remova qualquer DPBS extra por aspiração e confirme que o andaime não está dobrado ou enrugado.Quando os andaimes secaram nas bordas, assento lentamente uma única suspensão celular das células de interesse na parte superior de cada andaime. O dia embrionário 18 tecidos descelularizados são caracterizados por uma estrutura altamente translúcida, enquanto explantas adultas exibem uma aparência translúcida à aparência branca. Hematoxylin e eosina e as manchas de trichome de Masson confirmam uma eficiente remoção celular pela tela porosa presença.O material nuclear é reduzido em aproximadamente 99,8% após a descelularização, em comparação com tecidos não manipulados, o que é essencial para evitar desencadear uma resposta inflamatória indesejada após a implantação. A viabilidade celular dentro de andaimes sentados pode ser monitorada durante a cultura in vitro por coloração de calcein. A análise terminal da repopulação e distribuição celular em andaimes, também pode ser realizada após o processamento da parafina, conforme observado nestas imagens representativas de uma seção central de bioscafados.Assim, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na exploração das propriedades bioativas da matriz extracelular a partir de corações de camundongos fetais e adultos, mas também de outros tecidos.

comparable-decellularization-fetal-adult-cardiac-tissue-explants-as

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Preparo de Matrizes 3D Descelularizadas de Músculo Esquelético de Camundongos Fetais para Cultura Celular

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Produção de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para Revestimento de Placa de Cultura

Um método reprodutível é apresentado para gerar tecidos miocárdicos 3D combinando scaffolds de escrita eletrospinning (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogéis de fibrina com cardiomiócitos e fibroblastos derivados de hiPSC. Essa técnica oferece controle preciso sobre a arquitetura do andaime e pode ser aplicada em testes pré-clínicos de medicamentos e modelagem de doenças cardíacas.

Geração de tecido miocárdico humano 3D usando escrita eletrogiratória por fusão de andaimes de policaprolactona e células cardíacas derivadas de hiPSC

Aprenda a descelularização padronizada de corações fetais e adultos de camundongos para análise comparativa da matriz extracelular em contexto 3D. Este método preserva a arquitetura tecidual nativa e pode ser aplicado a outros órgãos.

Decellularization comparável de explantes de tecido cardíaco Fetal e adulto como plataformas 3D-como para estudos de Vitro

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