Amostragem de seiva de floema de Brassica napus para 3D-PAGE de complexos de proteínas e ribonucleoproteínas

O objetivo geral deste procedimento 3D-PAGE é separar complexos de proteínas e ribonucleoproteínas da seiva de Brassica napus ploem, juntamente com a identificação dos respectivos componentes de ácidos nucléicos e proteínas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em bioquímica e fisiologia vegetal. Por exemplo, você pode analisar a composição de complexos de floema sob tensão.

A principal vantagem da técnica é que a seiva pura do floema pode ser coletada e os ácidos nucléicos, bem como os componentes proteicos, podem ser analisados simultaneamente. Embora esse método possa fornecer informações sobre proteínas, proteínas e interações de ácidos nucléicos de proteínas dentro do sistema de floema da colza, ele também pode ser aplicado à análise de floemas de outras plantas, como cucurbitáceas, tremoços e mandioca. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando tentamos identificar parceiros de interação de proteína e RNA para proteínas específicas do floema.

Primeiro, perfure o caule inflorescente de uma planta B.napus de oito semanas várias vezes usando uma agulha hipodérmica de 0,8 milímetro. Perfure vários outros caules inflorescências na mesma planta e em outras plantas para obter seiva de floema suficiente. Limpe a primeira gota de cada local lesionado com papel de filtro.

Depois de remover as primeiras gotas, use uma pipeta para coletar as gotas restantes. E transfira-os para um tubo de reação cônico pré-resfriado de 1,5 mililitro. Em seguida, armazene o exsudato coletado a menos 20 graus Celsius usando um sistema de resfriamento sem gelo.

Continue coletando gotas até que nenhuma outra formação de gota seja observada, mas não mais do que uma hora. Em seguida, adicione a amostra do floema a um concentrador centrífugo com um peso molecular cortado de 10.000 daltons e concentre em aproximadamente 1/6 do volume inicial. Em seguida, centrifugue a amostra concentrada a quatro graus Celsius e 20.000 g por pelo menos 15 minutos para remover as partículas de poeira.

Para executar o PAGE nativo azul, monte a câmara de gel. E adicione o tampão catódico azul escuro B à metade e lave os poços com o tampão catódico. Carregar 20 a 30 microgramas da amostra de proteína concentrada por alvéolo num gel radiante comercial Bis-Tris em pelo menos triplicado.

Encha a câmara com tampão catódico e ânodo e passe o gel a quatro graus Celsius e 150 volts até que a amostra passe 1/3 do gel, o que leva de 20 a 30 minutos. Pause a execução de um buffer de cátodo azul escuro B com buffer de cátodo azul claro B 1/10. Reinicie a corrida e continue até que a frente azul comece a eluir para fora do gel, o que leva de 120 a 180 minutos.

Corte uma faixa inteira de gel do gel azul nativo, transfira para uma membrana de náilon por semi-secagem e marque as bordas superior e inferior do gel na membrana com um lápis. Após a secagem, lave a membrana com água tratada com DEPC e coloque entre dois pedaços de papel de filtro para secar. Em seguida, execute a reticulação UV da membrana manchada com uma energia aplicada de 120.000 micro joules por centímetro quadrado.

Agora, pré-hibridize a membrana reticulada UV com seis mililitros de tampão de hibridização por 60 minutos a 68 graus Celsius em um forno de hibridização. Adicione mais um mililitro de tampão de hibridização contendo quatro microlitros de sondas biotiniladas de 3 primos à membrana. Em seguida, incube a membrana com a sonda durante a noite enquanto resfria o forno de hibridização de 68 a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, lave a membrana com tampão contendo 2x SSC e 0,1% SDS por cinco minutos em temperatura ambiente para remover as sondas presas inespecificamente. Realizar a detecção das sondas biotiniladas 3-prime na membrana com um conjugado HRP estreptavidina e luminol como substrato de peroxidase de rábano, resultando em uma reação quimioluminescente sensível. Tire as bandas únicas do gel nativo azul.

Combine bandas de amostras executadas em pistas paralelas em um tubo de reação cônico de 1,5 mililitro para obter uma concentração adicional de proteínas complexas. Para preparar um gel de ureia Tris-Tricine a 12%, despeje 10 mililitros de solução de gel A entre duas placas de vidro e cubra com isopropanol. Após a polimerização, remova o isopropanol, adicione dois a três mililitros de solução de gel B ao gel e insira um pente de 10 poços.

Para equilibrar os pedaços de gel excisados, adicione um mililitro de tampão de amostra 2x SDS no tubo de reação. Depois de incubar a amostra por 10 minutos em temperatura ambiente, aqueça em um bloco de aquecimento a 95 graus Celsius por aproximadamente um minuto. Em seguida, incubar a amostra à temperatura ambiente durante 15 minutos.

Em seguida, empilhe várias peças de gel equilibradas representando o mesmo complexo em um único bolso de gel. Depois de montar a câmara de gel, execute a eletroforese usando tampões de ânodo e cátodo a 150 volts por 45 a 60 minutos. Quando terminar, retire toda a faixa de gel.

Incube a faixa de gel cortada por 20 minutos em tampão ácido. Em seguida, equilibre em Tris-HCL 125 milimolares a pH 6,8 por mais 20 minutos. Despeje uma solução de gel de separação 15% SDS de acordo com lanely.

Assim que o gel solidificar, remova o isopropanol, adicione três mililitros de uma solução de gel de empilhamento a 4% e insira o pente especial para géis IPG. Após a solidificação, transfira a faixa de gel de equilíbrio para o gel SDS e cubra o gel com 0,5% de agarose em 1x tampão de corrida SDS suplementado com um traço de azul de bromofenol. Depois de montar a câmara de gel, execute o gel a 150 volts por 60 minutos.

Quando terminar, corar o gel com solução coloidal de Kumasi para posterior análise espectrométrica de massa. Finalmente, analise os pontos de proteína visíveis usando espectrometria de tempo de voo de ionização por dessorção a laser assistida por matriz. Um resultado representativo obtido de uma amostra de floema puro é representado aqui.

Amostras de floema não contaminadas mostram uma banda visível para a idade da tiorredoxina, enquanto nenhum sinal para RuBisCO e a proteína do revestimento de pólen é observado. Pelo menos quatro bandas principais de complexos proteicos tornam-se visíveis após BN PAGE da seiva do floema de B.napus. Concentrações muito baixas ou muito altas de seiva do floema não permitem uma separação clara dos complexos.

A separação de alta resolução é observada no 3D PAGE devido aos diferentes comportamentos de migração de proteínas nos géis de ureia e SDS-PAGE. Normalmente, as proteínas pertencentes a um único complexo serão visíveis como uma linha diagonal através do gel. As proteínas acima desta linha têm uma hidrofobicidade aumentada, enquanto as proteínas abaixo da linha são mais hidrofílicas.

O Northern blotting BN mostra que um tRNA específico está presente apenas em um complexo específico. A análise espectrométrica de massas mostrou que este complexo contém principalmente tRNA ligases que confirmam a atividade de ligação ao tRNA encontrada pelo BN northern blotting. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três dias se for executada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar luvas e jaleco para minimizar a contaminação por caroteno que dificultará a análise espectrométrica de massa. Após este procedimento, outros métodos como zimogramas e ensaios enzimáticos com seiva do floema coletada podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como atividade complexa e estudos de inibição. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da ciência das plantas explorarem complexos de múltiplas subunidades em amostras de floema de diferentes espécies de plantas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar a seiva do floema de plantas Brassica napus e como isolar e analisar proteínas e complexos de ácidos nucléicos de proteínas. Não se esqueça de que trabalhar com SDS, acrilamida e TMET pode ser extremamente perigoso, e precauções como trabalhar sob o capuz com luvas e jaleco devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.