Name: Amostragem de seiva de floema de Brassica napus para 3D-PAGE de complexos de proteínas e ribonucleoproteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Aprenda a amostragem de seiva de floema de Brassica napus para análise de complexos proteicos e ribonucleoproteicos por 3D-PAGE. Este método permite a identificação simultânea de componentes proteicos e de ácidos nucleicos.

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Agradecemos a Jennifer Deke e Urszula Zarzenska pelo apoio científico. Este trabalho foi apoiado financeiramente por uma concessão de integração de carreira (CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734) pela Comissão Europeia no âmbito do 7º programa-quadro, a concessão LFF-GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung Hamburgo) e a concessão DFG (DFG KE 856_6-1) atribuído a JK.

1. amostragem e preparação de seiva do floema de b. napus plantas 4,8,20
<ol><li>De seiva do floema de amostragem, usar bem regada de 8 semanas de idade b. napus essa floração inicial apenas mostrar para evitar contaminações de pólen de plantas.</li>
	<li>Use uma agulha hipodérmica (Ø 0,8 mm) e a inflorescência punctate-tronco várias vezes. Repita em várias outras hastes de inflorescência e em outras plantas para obter suficiente seiva do floema (Figura 2a). Nota: Para análise complexa, é recomendável começar com pelo menos 600 µ l de seiva do floema. 4 a 5 plantas produzirá entre 700 e 200 µ l de seiva do floema.</li>
	<li>Limpe a primeira gota do lesionado sites com papel de filtro. Estas gotas principalmente contenham material altamente contaminado do lesionado tecido circundante e precisam ser descartados.</li>
	<li>Recolher as gotas seguintes pipetando e armazenar o exsudato coletado em um tubo de reação de pre-refrigerados cónico 1,5 mL a-20 ° C, usando um sistema de refrigeração livre de gelo.</li>
	<li>Continue coletando até sem mais formação de gota é observável, mas não mais de 1 h. Este procedimento pode ser repetido após dois dias sem perda significativa de seiva do floema coletados. Nota: A seiva do floema coletados pode ser usada imediatamente ou armazenada a-80 ° C para análise futura. Para o armazenamento de-80 ° C, choque-congelar no tubo de reação em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Concentre a amostra de floema para aproximadamente 1/6th do volume inicial usando concentradores centrífugos com um peso molecular corte (MWCO) de 10.000 Daltons (Da). Centrifugar a amostra concentrada a 4 ° C e 20.000 x g, durante pelo menos 15 min remover partículas de poeira. Nota: Concentração de seiva do floema não conduz a uma perda significativa de proteínas.</li>
	<li>Para posterior análise complexa, proceda com o passo 3.1.</li>
</ol>2. controle de pureza de seiva floema usando transcriptase reversa PCR (RT-PCR) 4,8,20
<ol><li>Isolar o RNA total de seiva do floema usando um método padrão para a extração de RNA para material líquido (por exemplo, extração de TRIzol ou fenol-clorofórmio seguido de precipitação do isopropanol da fase aquosa e etanol lavagem etapas de acordo com o protocolo do fabricante). Atenção: O fenol-clorofórmio é tóxico. Trabalhar sob uma capa com equipamento de proteção pessoal apropriado. O RNA extraído pode ser armazenado em etanol a-80 ° C por até seis meses.</li>
	<li>Remover a contaminação de DNA por digestão com DNase I (1 u / µ g) por 45 min a 37 ° C e inativar a enzima adicionando EDTA para uma concentração final de 5 mM e incubar a amostra a 75 ° C por 10 min.</li>
	<li>Para obter RNA puro, purificar e concentrar a amostra por outra etapa de purificação (por exemplo, usando Kits de limpeza de RNA, de acordo com as instruções do fabricante).</li>
	<li>Executar um transcriptase reversa PCR (RT-PCR) para a síntese de cDNA com um kit de síntese do cDNA usando 150 ng do RNA puro conforme descrito pelo fabricante do protocolo. Nota: O cDNA pode ser armazenado a-20 ° C até utilização posterior.</li>
	<li>Use 5 µ l de cDNA como um modelo para uma reação de PCR padrão conforme especificado pelo fabricante, para amplificar o compartimento específico transcrições e verificar por eletroforese em gel de agarose. Confirme a pureza das amostras de floema usando, por exemplo, as primeiras demão para pequena subunidade rubisco, tioredoxina h e a proteína do revestimento de pólen (Figura 1b, tabela 1).</li>
</ol>3. azul nativo página 4,de25,de26,31
<ol><li>Use ou géis de gradientes nativos auto derramados como descrito em outro lugar27 ou géis de gradiente comerciais Bis-Tris.</li>
	<li>Carga de 20 a 30 µ g de amostra concentrada de proteína por alvéolo até o gel pelo menos triplica.</li>
	<li>Funcione o gel a 4 ° C e 150 V usando buffers de catodo azul escuro B e ânodo (tabela 2) até que a amostra passado 1/3rd do gel (ca. 20 a 30 min, Figura 3a). Nota: Para a mancha do Norte, uma pista única gel é suficiente, enquanto para a análise da composição de proteína por página 3D e espectrometria de massa é aconselhável combinar a mesma banda de até dez pistas de gel para concentrar proteínas menos abundantes.</li>
	<li>Pausar a execução e buffer de catodo azul escuro de troca B com luz azul cátodo buffer B/10 (tabela 2) e continuar a executar. Termine o gel executar quando a fachada azul começa a eluir fora o gel (ca. 120 a 180 min, Figura 3a). Nota: O gel nativo azul acabado pode ser armazenado a 4 ° C durante pelo menos uma semana. Armazenamento prolongado pode levar a difundir bandas e deve ser evitado. Buffer de azul escuro B pode ser reutilizado.</li>
</ol>4. opcional: Detecção de RNA usando azul nativo mancha norte 4
<ol><li>Cortar bandas distintas ou usar o gel de todo do gel azul nativo e transferi-los para uma membrana de nylon por semi seco mancha a 3,5 mA/cm2 para 60 min e marcar a fronteira de gel de superior e inferior com um lápis na membrana (figura 4a).</li>
	<li>Depois da mancha, lave a membrana com água tratada DEPC e secar entre dois papéis de filtro.</li>
	<li>Executar UV-reticulação da membrana borrada com 120.000 µ j/cm2 (85 s se usando o Crosslinker na Tabela de materiais).</li>
	<li>Pre-cruzar a membrana com 6 mL de tampão de hibridização (comercial ou self-made) para 60 min a 68 ° C em um forno de hibridização (figura 4a).</li>
	<li>Adicionar um adicional 1 mL de tampão de hibridização contendo 4 µ l de sondas de 3'-biotinilado (100 nM).</li>
	<li>Incube a membrana com a sonda durante a noite, arrefecendo o forno de 68 ° C a 37 ° C.</li>
	<li>Lave a membrana com tampão contendo 2 x SSC e 0,1% SDS, por 5 min à temperatura ambiente para remover sondas vinculadas unspecifically. Cuidado: SDS pode causar irritações. Use luvas e avental quando estiver trabalhando com SDS e SDS contendo soluções.</li>
	<li>Execute a detecção das sondas 3'-biotinilado sobre a membrana , por exemplo, com um conjugado-Streptavidin-HRP e luminol como substrato horseradish peroxidase (HRP), resultando em uma sensível reação quimioluminescente (figura 4a).</li>
</ol>5. segunda dimensão: Tris-Tricine-ureia página 4,28
<ol><li>Impostos especiais de consumo única bandas do gel azul nativo. Combine faixas de amostras correr em pistas paralelas para alcançar uma maior concentração de proteínas complexas (Figura 5). Nota: Bandas extirpadas podem ser armazenadas em tubos de reação simples até o uso mais a 4 ° C.</li>
	<li>Despeje um gel Tris-Tricine-ureia de 12% (espessura de 1mm, 6,8 x 8,6 cm (largura x comprimento)). Prepare-se para o gel de separação (tabela 2), 10 mL de solução de gel A derramar entre duas placas de vidro e sobreposição com isopropanol. Remover o isopropanol após a polimerização é terminada e transferir 4 mL de solução de gel B (tabela 2) para o gel de empilhamento para o gel e inserir que um 10 bem pentear. Atenção: Não polimerizada acrilamida pode ser neurotóxica e TEMED é prejudicial se inalado. Sempre use equipamentos de proteção pessoal e trabalhar sob um capuz.</li>
	<li>Transferir as bandas excisado do gel em um tubo de reação de 1,5 mL e adicionar 1 mL de tampão de amostra SDS para o equilíbrio das peças gel (Figura 5, tabela 2) de 2x.<ol>
<li>Incubar as amostras durante 10 minutos à temperatura ambiente, antes da ebulição em um bloco de aquecimento (95 ° C) ou no microondas e incubar as amostras novamente à temperatura ambiente para um mais 15 min.</li>
		<li>Empilhe vários pedaços de gel equilibrado que representa o mesmo complexo em um gel único bolso.</li>
		<li>Realizar a eletroforese usando o ânodo e o cátodo executando buffers de 150 V por 45 a 60 min e excisar a gel de toda pista.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar a corte lane por 20 min em tampão ácido (100 mM Tris, 100 mM de ácido acético) e equilibrar em 125 mM Tris-HCl, pH 6,8 por mais 20 minutos (Figura 5).</li>
</ol>6. terceira dimensão: 4,de SDS-PAGE32
<ol><li>Despeje um SDS de 15%, separando o gel de acordo com Laemmli32 (espessura: 1.5 mm, 6,8 x 8,6 cm (largura x comprimento)) (tabela 2) e adicionar uma camada fina de um 4% acima do gel de empilhamento. Cuidado: SDS, acrilamida e TEMED são tóxicos e prejudiciais. Trabalhar sob um capuz e use equipamento de proteção pessoal.</li>
	<li>Transferir a faixa de gel equilibrada sobre o gel de SDS e cobrir o gel com 0,5% (w/w) agarose em 1x SDS executando o tampão completado com um traço de azul de bromofenol (Figura 5).</li>
	<li>Ferva o SDS com buffer de agarose no microondas prévia de carregamento para o gel.</li>
	<li>Para a execução de um marcador de proteína para estimar os pesos moleculares dos componentes simples, coloque um pedaço de papel de filtro em uma extremidade do gel até que solidificou a agarose ou usar um pente especial geralmente usado para géis IPG.</li>
	<li>Funcione o gel a 150 V por 60 min e mancha o gel com Coomassie coloidal, mancha prateada ou qualquer outro método de coloração adequado para posterior análise de espectrometria de massa.</li>
	<li>Analisar os pontos visíveis da proteína usando espectrometria de massa abordagens como a laser assistida por matriz dessorção/ionização tempo-de-voo (MALDI-TOF) ou espectrometria de massa de LC-MS/MS. Nota: Recomendamos a utilização do Coomassie coloidal coloração como já descrito,33. Em nossas mãos, ainda menos abundantes proteínas podem ser suficientemente manchados e permite uma análise de espectrometria de massa com qualidade razoável dos dados.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O floema é um compartimento de grande interesse, uma vez que constitui a rota de transporte principais para fotossimilados e também é essencial para a sinalização de longa distância entre plantas diferentes partes9,20,34, 35. Além de pequenas moléculas, macromoléculas como proteínas e RNAs têm sido implicadas com a manutenção do floema e sinalização4,7,8. A análise da composição do floema é restrito pela acessibilidade limitada para amostras de floema na maioria das espécies de plantas. A técnica de inseto estilete é amplamente aplicável, mas experimentalmente exigentes e resulta em muito pequenas quantidades de amostras de floema11. Uma técnica fácil, usada para amostragem de floema é exsudação EDTA-facilitou12. EDTA quelatos íons divalentes, como o cálcio e, portanto, impede o fechamento das placas de peneira por P-proteínas e callose. É fácil de usar, mas é propenso à contaminação por células danificadas e as amostras são diluídas. Empobrecimento íons divalentes por EDTA também pode levar a um colapso de complexos existentes. No entanto, ele permite a amostragem de uma grande variedade de espécies, incluindo a planta de modelo a. thaliana15. Espontânea exsudação de seiva do floema ocorre apenas em um pequeno número de espécies de plantas. É um método invasivo que envolve significativa lesão de tecidos de planta10. Recentemente estabelecemos b. napus como uma espécie de modelo para estudar o transporte de longa distância4,8,20. Aqui, seiva do floema pode ser degustada de pequenas incisões, que reduz ferindo efeitos e fontes de contaminação.
Usando técnicas de amostragem diferentes, a proteoma das amostras do floema de diferentes espécies de plantas tem sido pesquisada em anos recentes7,8,17,36,37, 38,39. Para estes estudos de proteoma, proteínas foram extraídas e precipitadas sob condições de desnaturação e, portanto, não permitem conclusões sobre proteína: proteína e proteína: interações ácido nucleico presente sob condições nativas. Co-imunoprecipitação (CoIP) e sobreposição ensaios indicaram que um grande complexo de ribonucleoprotein pode existir na seiva do floema de abóbora40, mas não foi demonstrado que qualquer complexos macromoleculares existirem sob condições nativas dentro da sistema de floema.
Azul página nativa, introduzida por Schägger et al . 26, em combinação com passos de eletroforese de gel de alta resolução subsequente permitem a separação dos componentes individuais de grandes complexos de proteínas. Usando o 3D-página análises de nativo b. napus exsudado do floema, nós recentemente pôde demonstrar que várias proteínas: proteína de alto peso molecular e complexos de RNP existem em amostras de floema e são enzimaticamente ativo4. Métodos alternativos para isolar os complexos da proteína, bem como RNPs como cromatografia de exclusão podem existir, mas falham em termos de resolução quando comparado à BN-página. Além disso, para uma razoável qualidade de separação complexa, matrizes de coluna de exclusão de tamanho devem ser adaptados de acordo com os global complexos pesos moleculares sendo investigados. Analisando a complexos de tamanho diferente, portanto, vai exigir diferentes tipos de colunas que é custo intensivo e não permitir como alta potência focagem como BN-página.
Passos críticos para analisar complexos de b. napus incluem a quantidade total de seiva do floema usada como material de partida. Pelo menos 600 µ l de amostra do floema são necessárias e podem ser obtidas de cinco plantas bem regadas. 3D-página e BN mancha do Norte é necessário iniciar o gel BN inicial com uma quantidade suficiente de amostras de floema. Para alcançar este objetivo, amostras de floema estão concentradas até 20 a 30 µ g de proteína pode ser carregado em cada bem e pelo menos que triplica da mesma amostra é executada em paralelo. Muito baixas ou muito altas concentrações reduzem a detecção dos complexos (Figura 3). Floema amostras precisam ser coletadas em tubos de reação no gelo e devem ser armazenadas congelados para uso posterior evitar a rotatividade e a degradação das proteínas. Inibidores de protease têm sido encontrados em todos os floema proteomes analisados, mas também uma Proteassoma totalmente ativa foi descrita no floema de b. napus4. Além disso, volume e composição das amostras de floema dependem do tempo-ponto de amostragem e de condições ambientais10. Portanto, deve-se ter cuidado para coletar ao mesmo tempo do dia em condições similares. Tratamentos de stress (por exemplo, seca) podem reduzir a quantidade de floema que pode ser coletada. Para identificar proteínas única por espectrometria de massa, é obrigatório para limitar as contaminações possíveis queratina por usando luvas o tempo todo. Leva a sinais adicionais durante a análise em massa e dificulta a identificação da proteína queratina. A BN-página em execução em uma tensão mais alta ou a temperatura ambiente pode causar aquecimento do gel que possa resultar na desmontagem dos complexos frágil.
O protocolo aqui apresentado é adequado para a análise de complexos de proteína: proteína. Também mostramos que ele pode ser usado para detectar RNAs específicos contidos na complexos em paralelo. Para conseguir isso, introduzimos recentemente um protocolo para BN norte da mancha a4. RNAs são propensas à degradação por contaminações de RNAse. Para limitar tal degradação DEPC tratada, água deve ser usada.
Principais limitações do método apresentado incluem a estimativa do peso molecular de complexos de proteínas separadas por BN-página, desde que o comportamento de migração depende de tamanho, forma e até mesmo modificações posttranslational de complexos31, 41. Estimativa de tamanho de complexos RNP é ainda mais complicada devido à influência dos ácidos nucleicos sobre o comportamento de migração. Ele também não pode ser evitado que os complexos do mesmo tamanho co migram em uma única banda. Isso pode levar à previsão errônea de composições complexas. Portanto, verificar as interações observadas com técnicas complementares, por exemplo, por ensaios funcionais4, pode ser necessário. Também proteínas apenas fracamente ou transitoriamente associadas a um complexo macromolecular podem ser perdidas no BN buffer usado. Para evitar isso, as amostras podem ser ligação cruzada, o que também pode levar a artefatos ou pode impedir a identificação da proteína, ou as condições de reserva podem ser otimizadas.
Em contraste com o clássico 2D-PAGE, a combinação de ureia - e SDS-PAGE permite a separação de acordo com a hidrofobicidade e peso molecular, em vez de ponto isoelétrico (pI) e peso molecular de 28e não limita a separação de proteínas de um intervalo específico de pI. Similar ao clássico 2D-PAGE, separadas de proteínas são visíveis como pontos simples, mas na diagonal, linha de 4,28 (Figura 5, Figura 6). Mais proteínas hidrofóbicas aparecem em pontos acima a diagonal, Considerando que mais hidrófilas proteínas encontram-se abaixo da linha28. As concentrações de poliacrilamida utilizadas neste protocolo vão separar proteínas entre 25 a 80 kDa bem. Para permitir uma separação de proteínas de menores ou maiores a poliacrilamida concentração pode ser variada ou géis gradientes podem ser usados na terceira dimensão. Os componentes do complexo IV (Figura 3), separados por 3D-página (Figura 6) foram cortados, tripsina digerido e analisados por espectrometria de massa. Isto resultou na identificação de vários ligases de tRNA. Os componentes dos outros complexos têm sido recentemente publicado 4. Nossa página de 3D habilitado a separação de ligases diferentes, ou seja, aspartato, asparagina, treonina, lisina e glicina ligases, com peso moleculares similares (tabela 3). Usando uma sonda de tRNA específico de metionina, foram capazes de detectar o tRNA potencialmente acoplado dentro complexo IV, mas se tRNA completos ou fragmentos de tRNA são no complexo não podem ser discriminados com as sondas utilizadas. Para verificar se os ácidos nucleicos são realmente acoplado dentro do complexo e não co migrando, protease digerido seiva do floema amostras poderá servir como controles de migração adequada.
Foi especulado anteriormente que tradução de proteína pode ocorrer dentro de tubos de peneira do floema, uma vez que quase a maioria dos componentes do Ribossoma inteira, bem como fatores de alongamento foram encontrados em amostras de floema4,7. Nosso achado de tRNA e ligases tRNA parece apoiar esta ideia. No entanto, fragmentos de tRNA presentes nas amostras de floema de abóbora foram mostrados para ser potentes inibidores da tradução42 e ribossomas funcionais parecem estar ausentes da4, sugerindo que a tradução não pode ter lugar.
Tomados em conjunto, o protocolo aqui apresentado permite a separação de proteínas: proteína nativa e até mesmo RNP complexos de amostras de floema e a separação e identificação dos seus componentes individuais com alta resolução. A aplicação deste método permite a descoberta de novas proteínas e complexos de RNP em amostras de floema e, portanto, pode elucidar novas funções neste compartimento planta altamente especializados.

Os conduítes de longa distância do floema são essenciais para a atribuição de nutrientes orgânicos em plantas superiores, mas também estão envolvidos na regulação de muitos processos diferentes importantes para o crescimento e desenvolvimento, defesa do patógeno e a adaptação ao adversos condições ambientais. Além de pequenos efetores como íons, fitohormônios ou metabolitos próprios, macromoléculas como proteínas e RNAs surgiram recentemente como potenciais sinais.
Estudos têm mostrado que o carregamento do floema de proteínas é tamanho dependente e controlado pelo limite de exclusão de tamanho (SEL) das unidades do pore-plasmodesmal conectando células companheiro (CC) e peneira elementos (SE) que são tipicamente na faixa de 10 a > 67 kDa1 , 2 , 3. no entanto, apesar destes tamanho limitações maiores proteínas e proteínas complexos foram encontrados dentro do sistema de floema, desafiando a ideia de exclusão de tamanho4, e nem inespecífica perda de proteínas do CC para SE tem sido sugeridas5 .
Complexos Multiproteicos, bem como grandes ribonucleoprotein desempenham um papel crucial na biossíntese e mantendo a integridade estrutural da célula6. Há evidências de que o floema-mobile da proteína-proteína e ribonucleoprotein complexos existem4,7, mas até agora pouco sobre a sua função é conhecido. Em elementos crivados de floema proteína: proteína e RNP complexos têm sido implicados com o transporte de longa distância e / ou sinalização de8,9. Para desvendar as funções dos complexos translocados, estudando sua composição sob diferentes ambiental ou condições de estresse é necessárias. Para conseguir isso, complexos nativos precisam ser isolado e seus componentes têm de ser separados com resolução suficiente.
Para isolar complexos de alto peso molecular do floema, é primeiro necessário para obter amostras de seiva em qualidade e quantidade suficientes. A técnica que pode ser usada para amostragem de floema depende da espécie de planta de interesse. Três métodos principais para obter seiva do floema existem 10: inseto stylectomy11, exsudação de EDTA-facilitou12e exsudação espontânea13.
Amostras de floema de Arabidopsis thaliana (a. thaliana), a planta modelo grande em laboratórios em todo o mundo, só podem ser obtidas por EDTA-facilitado exsudação ou pulgão stylectomy14,15. Ambos os métodos conduzem a seiva do floema altamente diluídas ou quantidades de amostra muito baixa. Exsudação de EDTA-facilitou também é propensa a contaminação e não pode representar o floema real composição16. Exsudação de floema espontânea é limitada para plantar espécies como abóboras, tremoço ou yucca, onde cortar as partes da planta leva a uma emissão espontânea de seiva do floema que pode ser facilmente coletadas13,17,18, 19. Recentemente estabelecemos colza (Brassica napus) como um sistema de modelo apropriado para a análise do floema, uma vez que é um parente próximo da . thaliana e vários microlitros de seiva do floema podem ser obtidos de pequenas incisões que tem sido mostrado para ser de alta pureza4,8,20. Além disso, a sequência do genoma de b. napus foi lançada em 201421.
Exceto para pulgão stylectomy, todos os métodos de coleção de floema descritos incluem danos do tecido no local da amostragem, e a composição da seiva do floema pode mudar em resposta a lesões. Portanto, é essencial verificar a qualidade das amostras de floema, independentemente do método de amostragem aplicada. Existem diferentes métodos para o controle de qualidade de seiva do floema coletados, por exemplo, por determinação do RNase atividade22,23, RT-PCR com primers contra Rubisco8,24ou a análise do açúcar composição8.
Diferentes métodos para isolar e separar os complexos da proteína podem ser aplicados, incluindo cromatografia de exclusão, ultracentrifugação de densidade de sacarose ou filtração da amostra através de membranas com distintas de peso molecular de corte offs. No entanto, essas abordagens não permitem alta resolução. A técnica chamada azul nativa página (BN-), primeiramente descrita por Schägger et al. 25, é superior em termos de resolução. Foi usado com sucesso para determinar os pesos moleculares dos complexos proteína nativa grande de várias organelas ou de lisados celulares e suas abundâncias relativas de26,27.
Para elucidar ainda mais a composição complexa de complexos de proteínas, é necessário separar os componentes individuais sob condições, levando a desmontagem completa dos componentes do complexos de desnaturação. Isto pode ser conseguido por uma segunda dimensão de SDS-PAGE 28,29 , ou, para obter maior resolução, por uma segunda dimensão de focalização isoelétrica (IEF) seguida por um third dimension de SDS-PAGE30 e posterior identificação de as proteínas usando espectrometria de massa.
Neste protocolo, descrevemos a amostragem de seiva pura do floema de plantas b. napus e a análise de complexos de proteínas de tais amostras de floema usando uma abordagem eletroforética 3D combinando BN-página com Tris-Tricine-ureia-página e SDS-PAGE. Os componentes de complexos de proteínas separadas são posteriormente identificados usando espectrometria de massa. Além disso, nós introduzimos azul nativo northern blot que serve como um método que permite a detecção de RNAs em grandes complexos RNP4, estendendo-se a aplicabilidade da abordagem.

<table><tbody><tr><td>Tubos de reação de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>pente de 10 poços para SDS PAGE, espessura 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>Solução de acrilamida-bisacrilamida a 30% (29:1) Solução</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>Solução de acrilamida-bisacrilamida a 30% (37,5:1) BioRad</td><td></td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>96 % Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Carl Roth</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de alumínio (14-18)-hidrato</td><td>AppliChem</td><td>141101</td><td></td></tr><tr><td>Peroxodissulfato de amônio (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>Concentradores centrífugos e.g. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td>Kit de Módulo de Detecção de Ácido Nucleico Quimioluminescente <td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Papéis de cromatografia por exemplo 3 mm CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30 System</td><td>Biocision</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Etanol abs.</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem em gel por exemplo Chemidoc Touch</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb mais</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>Forno de hibridização e.g. Incubadora de hibridização GFL 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>Agulha hipodérmica (0,8 mm)</td><td>B Pente</td><td>de gel Braun 4658309</td><td></td></tr><tr><td>IPG, espessura 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653367</td><td></td></tr><tr><td>Marcação de RNA e.g.Biotina 3'End DNA Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>Gel de gradiente nativo e.g. Novex NativePAGE 4&ndash; Gel de proteína Bis-Tris 16%</td><td>Invitrogen</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nylon e.g. Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ortofosfórico</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler pré-fabricada escada de proteína</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de alimentação para eletroforese em gel EPS</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>disponível na GE Healthcare</td></tr><tr><td>RNA Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semi seco Blot</td><td>Biometra</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td> <td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td> <td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>Síntese de cDNA por exemplo RevertAid Kit de Síntese de cDNA de primeira fita</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td> <td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trissódico di-hidratado</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb Tampão de hibridização ultrassensível</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker e.g. Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td>da Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Aparelho de eletroforese vertical e.g.O sistema XCell SureLock Mini-Cell ou Mini-Protean III</td><td>Thermo Fisher Scientific ou BioRad</td><td>EI0001 ou 1658004</td> <<td></td></tr><tr><td>em>e.g. KIMWIPES Delicado Limpadores</td><td>de Tarefas Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

amostragem de seiva de floema de brassica napus para 3d-page de complexos de proteínas e ribonucleoproteínas

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

O floema de plantas superiores de amostragem é muitas vezes trabalhoso e significativamente dependente das espécies vegetais. No entanto, estudos de proteoma sob condições de desnaturação poderiam ser alcançados em diferentes espécies de plantas. Proteína: proteína nativa e proteína: complexos de ácidos nucleicos de amostras de floema ainda mal foram analisados, embora eles podem desempenhar um papel importante na manutenção deste compartimento especializado ou na sinalização de longa distância. Grandes conjuntos moleculares podem ser isolados usando uma eletroforese em gel azul de nativo (BN-PAGE). Seus componentes de proteínas podem ser separadas por um sulfato dodecyl de sódio subsequentes página (SDS-PAGE). No entanto, as proteínas com peso moleculares similares co migram, o que pode dificultar a identificação de proteínas por espectrometria de massa. Combinando a BN-página com dois diferentes desnaturação gel de electroforese passos, ou seja, Tris-Tricine-ureia e SDS-PAGE, permite a separação adicional de proteínas de acordo com sua Hidrofilia/hidrofobicidade e, portanto, aumenta a resolução e o sucesso da identificação de proteínas. Ele ainda permite distinguir as proteínas que só diferem em suas modificações posttranslational. Além disso, a mancha do Norte nativo azul pode ser aplicado para identificar os componentes do RNA em complexos macromoleculares. Nós mostramos que nosso protocolo destina-se a desvendar a proteína e os componentes do RNA de proteína: proteína nativa e complexos ribonucleoprotein (RNP) ocorrem nas amostras de floema. Combinando um azul nativa página com duas diferentes etapas de página desnaturação pode ajudar a separar os diferentes tipos de grandes complexos de proteínas e também permite uma taxa de aumento da identificação de seus componentes por espectrometria de massa. Além disso, o protocolo é robusto o suficiente para detectar simultaneamente potencialmente vinculados ácidos nucleicos dentro de complexos de proteínas simples.

Aqui nós apresentamos um protocolo para analisar a composição da proteína da proteína: proteína nativa grande e proteína: complexos de ácidos nucleicos de colza (b. napus) exsudato floema usando uma abordagem de eletroforese (página) do gel de polyacrylamide 3D combinando azul nativo (BN) com duas páginas de desnaturação, seguido pela identificação de espectrometria de massa.

Amostragem de seiva de floema de Brassica napus para 3D-PAGE de complexos de proteínas e ribonucleoproteínas

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

O objetivo geral deste procedimento 3D-PAGE é separar complexos de proteínas e ribonucleoproteínas da seiva de Brassica napus ploem, juntamente com a identificação dos respectivos componentes de ácidos nucléicos e proteínas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em bioquímica e fisiologia vegetal. Por exemplo, você pode analisar a composição de complexos de floema sob tensão.A principal vantagem da técnica é que a seiva pura do floema pode ser coletada e os ácidos nucléicos, bem como os componentes proteicos, podem ser analisados simultaneamente. Embora esse método possa fornecer informações sobre proteínas, proteínas e interações de ácidos nucléicos de proteínas dentro do sistema de floema da colza, ele também pode ser aplicado à análise de floemas de outras plantas, como cucurbitáceas, tremoços e mandioca. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando tentamos identificar parceiros de interação de proteína e RNA para proteínas específicas do floema.Primeiro, perfure o caule inflorescente de uma planta B.napus de oito semanas várias vezes usando uma agulha hipodérmica de 0,8 milímetro. Perfure vários outros caules inflorescências na mesma planta e em outras plantas para obter seiva de floema suficiente. Limpe a primeira gota de cada local lesionado com papel de filtro.Depois de remover as primeiras gotas, use uma pipeta para coletar as gotas restantes. E transfira-os para um tubo de reação cônico pré-resfriado de 1,5 mililitro. Em seguida, armazene o exsudato coletado a menos 20 graus Celsius usando um sistema de resfriamento sem gelo.Continue coletando gotas até que nenhuma outra formação de gota seja observada, mas não mais do que uma hora. Em seguida, adicione a amostra do floema a um concentrador centrífugo com um peso molecular cortado de 10.000 daltons e concentre em aproximadamente 1/6 do volume inicial. Em seguida, centrifugue a amostra concentrada a quatro graus Celsius e 20.000 g por pelo menos 15 minutos para remover as partículas de poeira.Para executar o PAGE nativo azul, monte a câmara de gel. E adicione o tampão catódico azul escuro B à metade e lave os poços com o tampão catódico. Carregar 20 a 30 microgramas da amostra de proteína concentrada por alvéolo num gel radiante comercial Bis-Tris em pelo menos triplicado.Encha a câmara com tampão catódico e ânodo e passe o gel a quatro graus Celsius e 150 volts até que a amostra passe 1/3 do gel, o que leva de 20 a 30 minutos. Pause a execução de um buffer de cátodo azul escuro B com buffer de cátodo azul claro B 1/10. Reinicie a corrida e continue até que a frente azul comece a eluir para fora do gel, o que leva de 120 a 180 minutos.Corte uma faixa inteira de gel do gel azul nativo, transfira para uma membrana de náilon por semi-secagem e marque as bordas superior e inferior do gel na membrana com um lápis. Após a secagem, lave a membrana com água tratada com DEPC e coloque entre dois pedaços de papel de filtro para secar. Em seguida, execute a reticulação UV da membrana manchada com uma energia aplicada de 120.000 micro joules por centímetro quadrado.Agora, pré-hibridize a membrana reticulada UV com seis mililitros de tampão de hibridização por 60 minutos a 68 graus Celsius em um forno de hibridização. Adicione mais um mililitro de tampão de hibridização contendo quatro microlitros de sondas biotiniladas de 3 primos à membrana. Em seguida, incube a membrana com a sonda durante a noite enquanto resfria o forno de hibridização de 68 a 37 graus Celsius.No dia seguinte, lave a membrana com tampão contendo 2x SSC e 0,1% SDS por cinco minutos em temperatura ambiente para remover as sondas presas inespecificamente. Realizar a detecção das sondas biotiniladas 3-prime na membrana com um conjugado HRP estreptavidina e luminol como substrato de peroxidase de rábano, resultando em uma reação quimioluminescente sensível. Tire as bandas únicas do gel nativo azul.Combine bandas de amostras executadas em pistas paralelas em um tubo de reação cônico de 1,5 mililitro para obter uma concentração adicional de proteínas complexas. Para preparar um gel de ureia Tris-Tricine a 12%, despeje 10 mililitros de solução de gel A entre duas placas de vidro e cubra com isopropanol. Após a polimerização, remova o isopropanol, adicione dois a três mililitros de solução de gel B ao gel e insira um pente de 10 poços.Para equilibrar os pedaços de gel excisados, adicione um mililitro de tampão de amostra 2x SDS no tubo de reação. Depois de incubar a amostra por 10 minutos em temperatura ambiente, aqueça em um bloco de aquecimento a 95 graus Celsius por aproximadamente um minuto. Em seguida, incubar a amostra à temperatura ambiente durante 15 minutos.Em seguida, empilhe várias peças de gel equilibradas representando o mesmo complexo em um único bolso de gel. Depois de montar a câmara de gel, execute a eletroforese usando tampões de ânodo e cátodo a 150 volts por 45 a 60 minutos. Quando terminar, retire toda a faixa de gel.Incube a faixa de gel cortada por 20 minutos em tampão ácido. Em seguida, equilibre em Tris-HCL 125 milimolares a pH 6,8 por mais 20 minutos. Despeje uma solução de gel de separação 15% SDS de acordo com lanely.Assim que o gel solidificar, remova o isopropanol, adicione três mililitros de uma solução de gel de empilhamento a 4% e insira o pente especial para géis IPG. Após a solidificação, transfira a faixa de gel de equilíbrio para o gel SDS e cubra o gel com 0,5% de agarose em 1x tampão de corrida SDS suplementado com um traço de azul de bromofenol. Depois de montar a câmara de gel, execute o gel a 150 volts por 60 minutos.Quando terminar, corar o gel com solução coloidal de Kumasi para posterior análise espectrométrica de massa. Finalmente, analise os pontos de proteína visíveis usando espectrometria de tempo de voo de ionização por dessorção a laser assistida por matriz. Um resultado representativo obtido de uma amostra de floema puro é representado aqui.Amostras de floema não contaminadas mostram uma banda visível para a idade da tiorredoxina, enquanto nenhum sinal para RuBisCO e a proteína do revestimento de pólen é observado. Pelo menos quatro bandas principais de complexos proteicos tornam-se visíveis após BN PAGE da seiva do floema de B.napus. Concentrações muito baixas ou muito altas de seiva do floema não permitem uma separação clara dos complexos.A separação de alta resolução é observada no 3D PAGE devido aos diferentes comportamentos de migração de proteínas nos géis de ureia e SDS-PAGE. Normalmente, as proteínas pertencentes a um único complexo serão visíveis como uma linha diagonal através do gel. As proteínas acima desta linha têm uma hidrofobicidade aumentada, enquanto as proteínas abaixo da linha são mais hidrofílicas.O Northern blotting BN mostra que um tRNA específico está presente apenas em um complexo específico. A análise espectrométrica de massas mostrou que este complexo contém principalmente tRNA ligases que confirmam a atividade de ligação ao tRNA encontrada pelo BN northern blotting. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três dias se for executada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar luvas e jaleco para minimizar a contaminação por caroteno que dificultará a análise espectrométrica de massa. Após este procedimento, outros métodos como zimogramas e ensaios enzimáticos com seiva do floema coletada podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como atividade complexa e estudos de inibição. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da ciência das plantas explorarem complexos de múltiplas subunidades em amostras de floema de diferentes espécies de plantas.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar a seiva do floema de plantas Brassica napus e como isolar e analisar proteínas e complexos de ácidos nucléicos de proteínas. Não se esqueça de que trabalhar com SDS, acrilamida e TMET pode ser extremamente perigoso, e precauções como trabalhar sob o capuz com luvas e jaleco devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.

phloem-sap-sampling-from-brassica-napus-for-3d-page-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A base molecular do espaço-respostas específicas fitocromo está sendo investigado o uso de plantas transgênicas que apresentam tecidos e órgãos específicos deficiências fitocromo. O isolamento de células específicas exibindo esgotamento cromóforo fitocromo induzida por fluorescência-Activated Celular classificação seguido por análises de microarray está sendo utilizada para identificar genes envolvidos em respostas espaciais específicos fitocromo.

Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana</em

Nós desenvolvemos uma técnica para testar interações proteína-proteína na planta. A proteína fluorescente amarela (YFP) é dividido em dois fragmentos não-sobrepostas. Cada fragmento é clonado em-frame de um gene de interesse através do sistema Gateway, permitindo a expressão de proteínas de fusão. Reconstituição do sinal YFP só ocorre quando as proteínas interagem inquérito.

Detecção de interações proteína na planta através de um gateway de Complementação de fluorescência Compatível Bimolecular (BiFC) Sistema

Descrevemos aqui um protocolo para a purificação e caracterização de complexos de proteínas de plantas. Nós demonstramos que por imunoprecipitando uma única proteína dentro de um complexo, para que possamos identificar as suas modificações pós-traducionais e seus parceiros que interagem.

Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

A abordagem descrita comparativa, quantitativa proteómica visa obter conhecimentos sobre a composição de complexos multiproteicos sob diferentes condições e é demonstrada através da comparação geneticamente diferentes estirpes. Para a análise quantitativa de volumes iguais de diferentes fracções de um gradiente de densidade de sacarose são misturados e analisados ​​por espectrometria de massa.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

O conhecimento da composição da seiva floema, bem como o seu mecanismo de carregamento e de longa distância de transporte é essencial para a compreensão de sinalização de longa distância no desenvolvimento das plantas e stress / agente patogénico e da resposta assimilar transporte. Este manuscrito descreve a recolha de exsudados do floema, utilizando o método de EDTA-facilitada.

Coleta e análise de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floema exsudados Usando o método EDTA facilitada

Degradação de proteínas alvejado representa um grande mecanismo regulador para a função celular. Ela ocorre através da via de ubiquitina-proteassoma conservado, que se liga cadeias de poliubiquitina para a proteína alvo, que, em seguida, servir de "tags", como moleculares para o proteassoma 26S. Aqui, descrevemos um ensaio livre de células simples e confiável para a degradação de proteínas proteosomal.

Ensaiando proteosomal Degradação em um sistema de livre-Cell em Plantas

Este protocolo detalha a extração otimizada do fluido de lavagem do apoplasto das folhas das plantas, usando plantas de feijão francês (Phaseolus vulgaris) como exemplo modelo.

A técnica de infiltração-centrifugação para Extração de apoplásticas Fluid das folhas da planta Usando Phaseolus vulgaris Como exemplo

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

Interações da proteína-proteína e proteína-metabólito são cruciais para todas as funções celulares. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a análise paralela dessas interações com uma proteína de escolha. Nosso protocolo foi otimizado para culturas de células de plantas e combina a purificação da afinidade com espectrometria de massa base de proteína e deteção do metabólito.

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Apresentada aqui é uma abordagem fosfoproteômica, ou seja, parar e ir extração baseada em fosfoproteômica, que fornece alta produtividade e cobertura profunda de fosfoproteome arabidopsis. Esta abordagem delineia a visão geral da sinalização de estresse osmótico em Arabidopsis.

Estratégia fosfoproteômica para traçar sinalização de estresse osmótico em Arabidopsis

O presente protocolo descreve um método otimizado para a observação histológica de galhas induzidas por Plasmodiophora brassicae. Seções vibratórias de hipocótilos são limpas antes da imagem de fluorescência para estudar o envolvimento de fatores de transcrição e fitohormônios durante a progressão da doença. Este protocolo supera as limitações de incorporação de resina, possibilitando na planta a visualização de proteínas fluorescentes.

Combinando Microscopia de Limpeza e Fluorescência para Visualização de Mudanças na Expressão Gênica e Respostas Fisiológicas a Plasmodiophora brassicae

Aprenda a amostragem de seiva de floema de Brassica napus para análise de complexos proteicos e ribonucleoproteicos por 3D-PAGE. Este método permite a identificação simultânea de componentes proteicos e de ácidos nucleicos.

Amostragem de seiva de floema de Brassica napus para 3D-PAGE de complexos de proteínas e ribonucleoproteínas

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