Um método para a medição da função da glândula salivar em ratos

O objetivo geral deste procedimento é coletar e medir com precisão e reprodutibilidade a saliva de camundongos após a estimulação com pilocarpina. Medir a produção de saliva em roedores é um procedimento desafiador e propenso a alta variabilidade. Este método é simples e pode ser repetido no mesmo animal nos vários momentos de todo o estudo.

Este método pode não apenas medir o volume da saliva produzida, mas também pode ser usado para coletar a saliva para posterior análise de moléculas bioativas que podem ser secretadas na saliva. Em última análise, isso será de grande utilidade ao investigar a Síndrome de Sjögren, fibrose da glândula salivar ou regeneração da glândula salivar em sistemas modelo de roedores. Para este procedimento, mandar preparar e congelar alíquotas de cloridrato de pilocarpina com um máximo de três meses.

Não congele novamente as alíquotas descongeladas. Comece preparando tubos de microcentrífugas de 0,6 mL. Faça um pequeno furo no fundo dos tubos com uma agulha aquecida de calibre 18

Faça um tubo por mouse. Em seguida, coloque esses tubos em tubos de 2 mL. A esterilidade não é uma preocupação.

Em seguida, usando métodos assépticos, corte cotonetes absorventes cilíndricos em comprimentos de dois centímetros. Em seguida, corte cada pedaço de dois centímetros na diagonal para fazer dois cotonetes de formato cônico. Coloque um cotonete cônico em cada um dos tubos de microcentrífugas preparados.

Em seguida, pese cada tubo de 0,6 mL com seu cotonete seco. Agora, transfira os camundongos para o estudo em uma nova gaiola limpa. Eles podem ser alojados juntos.

Nas próximas duas horas, dê-lhes água gelada, mas sem comida. Pouco antes do término do período de duas horas, prepare a solução de Pilocarpina diluindo uma alíquota de estoque de 100x em solução salina estéril até 1x. Vortex o tubo e mantenha a solução no gelo.

Para começar, pese cada camundongo para calcular as doses. Em seguida, anestesiar os camundongos com injeções intraperitoneais de cetamina mais xilazina. Se após quatro minutos um camundongo não estiver anestesiado, ajuste a dosagem.

Agora, aplique uma pomada tálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento. Em seguida, administre a dose calculada de pilocarpina ao camundongo usando uma via intraperitoneal e ajuste o cronômetro para dois minutos. Durante esse intervalo de dois minutos, insira o mouse em um tubo de contenção de 50 mL, de modo que apenas a cabeça e as orelhas fiquem para fora.

Posicione o tubo em um ângulo de 45 graus, com a cabeça do mouse para baixo e a superfície ventral voltada para cima. Em seguida, prenda o tubo com fita adesiva. Logo após os dois minutos, levante a mandíbula inferior para abrir a boca e insira suavemente uma pinça de dissecação fechada, de um a dois milímetros na boca.

Certifique-se de que a língua esteja apoiada no braço superior da pinça. Com a outra mão, use uma pinça fina para segurar o cotonete seco pré-pesado perto de sua ponta cônica. Em seguida, deslize suavemente a ponta cônica do cotonete na boca e retire a pinça, deixando a ponta do cotonete na cavidade oral.

Agora, segure e gire o cotonete até que ele esteja fazendo contato máximo com a boca e para que não caia. A extremidade larga do cotonete deve permanecer fora da boca. Mantenha o cotonete nesta posição por quinze minutos.

Após quinze minutos, gire suavemente o cotonete para coletar qualquer saliva que não tenha sido absorvida. Em seguida, transfira o cotonete embebido em saliva no tubo de microcentrífuga de 0,6 mL. Tampe o tubo e coloque-o no tubo de 2 mL, colocado no gelo.

Agora, transfira o mouse de volta para uma gaiola de recuperação. Forneça gel dietético ou pellets de comida umedecidos na gaiola para ajudá-la a se reidratar. Uma injeção subcutânea de 0,2 mL de solução salina isotônica também pode ser administrada para acelerar a recuperação.

Depois de coletar todas as amostras de saliva, pese-as para determinar a massa de saliva coletada. Corte as tampas dos tubos de 2 mL contendo o tubo menor de amostra de saliva e, em seguida, coloque-as em uma centrífuga refrigerada e gire-as por dois minutos a 7.500 g e a quatro graus Celsius. A saliva se acumulará no tubo de dois mL.

Em seguida, meça os volumes das amostras usando uma micropipeta. A produção de saliva foi medida em camundongos C57 pretos de onze semanas de idade, usando o método descrito. Na dose de 1 micrograma de pilocarpina por grama de peso corporal, alguns dos camundongos começaram a exibir sinais de angústia.

Houve uma boa relação dose-resposta entre a produção de pilocarpina e saliva. Houve também uma concordância significativa entre o peso e o volume da saliva. Usando a técnica descrita, foram encontradas diferenças de cepa para deformação na saliva.

A linhagem 129 S6 de camundongos produziu a menor quantidade de saliva. Em um experimento para detectar a hipofunção das glândulas salivares, lipopolissacarídeos foram injetados para ativar uma resposta imune inata. Durante a resposta, os camundongos produziram menos saliva.

Outra tática para induzir a hipofunção das glândulas salivares foi injetar nos camundongos um adjuvante Alum mais anticorpos anti-Ro52. O controle do veículo foi tratado apenas com Alum. Isso também foi detectável com a técnica descrita.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir com precisão e reprodutibilidade a produção de saliva em camundongos. Uma vez dominados, dez camundongos podem ser avaliados em cerca de duas horas e meia. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser extremamente consistente em todas as etapas, desde as injeções intraperitoneais até a colocação do cotonete e o gerenciamento dos intervalos de tempo para cada etapa.

Não se esqueça que o cloridrato de pilocarpina atua no sistema cardiovascular, causando bradicardia e hipotensão. Portanto, a injeção de pilocarpina nos camundongos deve ser feita com cuidado.