Um ensaio simples, rápido e quantitativo para medida de reparação de ADN-proteína ligações cruzadas em plasmídeos transfectadas em células de mamíferos

O objetivo do presente protocolo é quantificar a reparação de ligações cruzadas de ADN-proteína definidas no plasmídeo. Lesado plasmídeos são transfectados em linhas de células de mamíferos destinatário e peso molecular baixo colhidas em vários pontos de tempo pós-transfecção. Cinética de reparo de DNA são quantificados usando a extensão de vertente específica da primeira demão, seguido por qPCR.

O objetivo geral deste ensaio QPCR de extensão de primer transpacífico é avaliar quantitativamente o reparo de adutos, reticulados ao DNA do plasmídeo, após a transfecção em células de mamíferos. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do reparo do DNA. Por exemplo, quais vias estão envolvidas no reparo de ligações cruzadas de proteínas de DNA.

Essa técnica tem o potencial de fornecer uma melhor compreensão da resposta ao dano do DNA. Porque permite estudar seletivamente o reparo das ligações cruzadas das proteínas do DNA e a ausência de outros tipos de danos ao DNA. Embora esse método possa fornecer informações sobre o reparo de ligações cruzadas de proteínas de DNA, ele também pode ser aplicado a outros tipos de danos ao DNA.

Como sítios abásicos e outros adutos bloqueadores da polimerase. A principal vantagem desta técnica é que ela pode detectar o reparo de plasmídeos contendo adutos, em pontos de tempo tão cedo quanto duas horas. Inicialmente, pretendíamos usar a reativação de células domésticas para estudar o reparo, no entanto, esses ensaios não medem diretamente o reparo ou podem superestimar a eficiência do reparo.

Particularmente se a RNA polimerase puder ler produtos de reparo incompletos. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de purificação e extensão do primer específicas da fita são difíceis de visualizar. Misture 20 microlitros de uma solução contendo 80 picomoles de um oligonucleotídeo contendo oito oxoguanina com cinco microlitros de tampão ligase 10x.

E adicione um microlitro de uma solução contendo 10 unidades de polinucleotídeo quinase T4. Ajuste o volume final para 50 microlitros e incube o tubo em banho-maria por 30 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, constituem a reação de extensão do primer no gelo.

Defina o programa no termociclador e inicie a execução. Após a incubação, ajuste o volume total para 375 microlitros adicionando diferentes reagentes, enzimas e tampão. Em seguida, incube a reação em banho-maria a 37 graus Celsius durante a noite.

Para preparar uma mistura de fenil-clorofórmio na proporção de 50:50, adicione volumes iguais de fenol e clorofórmio. Em seguida, misture os dois componentes e gire em uma centrífuga de mesa a 21.130 G por cinco minutos. Após o término da centrifugação, adicione 375 microlitros da camada orgânica à reação de extensão do primer. Misturar.

E novamente centrifugue a 21, 130 G por cinco minutos. Após a centrifugação, pipetar cuidadosamente a camada superior. E misture com acetato de amônio até uma concentração final de 0,3 molar.

Em seguida, adicione dois volumes de etanol 100% a ele. Armazene a mistura a 20 graus Celsius negativos por pelo menos 30 minutos durante a noite. Terminado o período de incubação, centrifugar a amostra a 15 000 RPM a quatro graus Celsius durante 10 minutos.

Em seguida, rejeitar o sobrenadante e lavar o sedimento em etanol a 70%. Girar novamente a amostra numa centrifugadora de mesa a 15 000 rpm durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, rejeitar o sobrenadante e dissolver o sedimento em 100 microlitros de água.

Combine 50 microlitros do DNA com 34 microlitros de água e 16 microlitros de corante de carregamento de gel 6x. Execute a amostra em um gel de agarose de 10 centímetros, 0,8% de baixo ponto de fusão, contendo 0,5 microgramas por mililitro de brometo de etídio a dois volts por centímetro por seis horas em 1x tampão TAE. Em seguida, use uma lâmina de barbear para extirpar o DNA superenrolado.

E pese a fatia de gel. Em seguida, adicione um tampão de reação de beta-agarase de microlitro para digerir a cada 10 miligramas de fatia de gel. Em seguida, incube a fatia a 65 graus Celsius por 10 minutos, seguido de resfriamento a 42 graus Celsius em um termociclador.

Assim que a fatia de gel se dissolver e esfriar a 42 graus Celsius, adicione 10 unidades de beta-agarase e deixe a 42 graus Celsius por uma hora no termociclador. Após uma hora, medir o volume da fatia de gel dissolvido e adicionar acetato de amónio a uma concentração final de 0,3 molar e incubar em gelo durante 15 minutos. Após a incubação, centrifugar a mistura a 15 000 g durante 15 minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, recolha o sobrenadante e pipete dois volumes de isopropanol e misture. Em seguida, armazene a mistura a 20 graus Celsius negativos durante a noite. No dia seguinte, centrifugue o DNA superenrolado purificado em uma centrífuga de mesa a 15.000 RPM por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Remova o super nadante e ressuspenda o pellet em 40 microlitros de água. Em seguida, combine 15 microlitros de uma solução contendo 12 picomoles de DNA com um microlitro de uma solução de 36 picomoles de oxoguanina glicosilase em um tampão e ajuste o volume final para 30 microlitros. Em seguida, incube a mistura a 37 graus Celsius por 30 minutos em banho-maria.

Um dia antes da transfecção, semeie as células em uma placa de cultura de seis poços. No dia seguinte, misture 1,5 microgramas do plasmídeo reticulado com 300 microlitros de meio de cultura sem soro em um tubo, certificando-se de salvar um microlitro de DNA como ponto de sinal de hora zero. Em outro tubo misture 12 microlitros de reagente de transfecção com 300 microlitros de meio sem soro.

Em seguida, combine 300 microlitros do DNA reticulado com um volume igual de reagente de transfecção diluído. E incubar por cinco minutos em temperatura ambiente em uma capela de fluxo laminar. Após a incubação, adicione 250 microlitros do complexo a cada um dos dois poços e incube a 37 graus Celsius.

Após um mínimo de uma hora, remova o meio e adicione um mililitro de solução de dodecil sulfato de sódio a 0,6% com EDTA 0,1 molar e incube em temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Em seguida, retire as células raspando com um policial de borracha e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de cloreto de sódio 5 molar a uma concentração final de um molar e inverta o tubo cinco vezes.

Em seguida, incube a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, centrifugue a amostra a 21.130 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Pós-centrifugação, colete o super nadante.

E adicione acetato de amônio a uma concentração final de 0,3 molar, misture e adicione dois volumes de etanol 100% para precipitar o DNA. Armazene a mistura a 20 graus Celsius negativos por no mínimo 30 minutos. Após a precipitação de etanol e ressuspensão das amostras de DNA recuperadas em 50 microlitros de água, diluir a amostra de hora zero em 500 microlitros de água e constituir as reações de PCR usando as amostras não transfectadas e transfectadas.

Em seguida, defina o programa no termociclador e inicie a execução. Esta etapa de extensão do primer trans-específica é crucial porque nos dá a amplificação do fio danificado. Se não for usado, os valores de TC delta seriam menores que um, dificultando a detecção de baixos níveis de reparo do DPC.

Depois de completar oito ciclos, adicione 100 picomoles do segundo primer. Em seguida, misture um microlitro do DNA não amplificado das amostras não transfectadas e transfectadas com 2x master mix, água e 100 picomoles de ambos os primers até um volume final de 60 microlitros. Carregue as amostras em triplicados em uma placa de PCR de 96 poços.

Realizar PCR quantitativo durante 30 ciclos e calcular a média do limiar de ciclo para cada uma das amostras triplicadas. Neste estudo, a QPCR é realizada com e sem extensão de primer específico da fita para calcular a porcentagem de DNA plasmidial que foi reparado. A diferença nos valores limite do ciclo entre as amostras estendidas por primer e as amostras não estendidas por primer é chamada de delta CT.As visto aqui, uma amostra reparada submetida a SSPE-QPCR tem um delta CT maior do que uma amostra não reparada.

Dados representativos da porcentagem de reparo calculada a partir dos valores delta CT mostram que as amostras recuperadas após três horas de transfecção são 66% reparadas, enquanto as amostras recuperadas após oito horas são 93% reparadas. Os valores percentuais de fundo calculados a partir de duas amostras de controle com eficiência de reticulação de proteínas respectivamente alta e baixa são mostrados aqui. O baixo percentual de fundo presente no controle indica por que apenas substratos reticulados de forma eficiente são usados para transfecções.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas a três horas. Ao tentar este procedimento, é importante tirar amostras de tempo zero para subtrair qualquer fundo deste ensaio. Seguindo este procedimento, outros métodos, como análise de sequência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como: o reparo do DPC é propenso a erros?

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar, transfectar e quantificar o reparo de plasmídeos contendo adutos em células de mamíferos. Não se esqueça de que trabalhar com fenol, clorofórmio e brometo de etídio pode ser perigoso. E precauções como usar luvas e trabalhar em um exaustor devem sempre ser tomadas.