Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo

Esta mensagem pode ajudar a responder a perguntas-chave em Imunofenofoteping em modelos murinos, como marcadores usados para identificar diferentes linhagens de imunidade e estratégias de envelhecimento. A maior vantagem desta técnica é que o marcador e o envelhecimento, quando imunofenofoteping, podem ser aplicados a uma variedade de modelos murinos. Monitore o peso corporal de C57 Black 6 camundongos usando um equilíbrio.

Além disso, monitore o volume tumoral de camundongos doadores variados por medição de calibre. Seguindo a eutanásia do animal em um capô de risco biológico conforme o protocolo, esterilize a pele ao redor do tumor usando cotonetes de iodophor. Após a remoção cirúrgica do tumor conforme detalhado no protocolo de texto, coloque o tumor em uma placa de petri contendo 20 mililitros de PBS que foi pré-refrigerado a 4 graus Celsius.

Se houver sangue contaminante, transfira o tumor para outra placa de Petri e lave o tumor com PBS. Corte o tumor ao meio. Remova qualquer pele extra, vasos, calcificação e necrose.

Escolha apenas pedaços intactos de tumor e coloque-os em um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéril. Adicione 20 mililitros de PBS antes de transportar tubo para uma sala animal separada para estudos de farmacologia. Para se preparar para a implantação ortotópica, fixe um mouse totalmente anestesiado em uma placa de experimento na posição lateral direita.

Desinfete a pele ao redor do baço com idodine e depois desodinada com 75% de álcool etílico. Encontre o ponto mediano do baço e faça uma incisão vertical de 1 centímetro no abdômen para expor o baço. Suavemente, retire parte do tecido do pâncreas sob o baço usando pinças de ponta plana.

E sutro rato homoenergrafal peça tumor do rato C para o pâncreas do rato receptor por 9-O bsorbable surgical sutura. Feche o abdômen com uma sutura de seda 6-O por costura dupla. Alcance a homeostase por compressão.

Após o término da implantação do tumor, mantenha o animal em uma gaiola quente, desde que não ocorra sangramento ou vazamento de tecido tumoral. Monitore o animal até que recuperem a consciência suficiente para manter a recumbência severa. Devolva o animal para a sala dos animais após a recuperação completa da anestesia.

Monitore o tumor variando camundongos palpando o abdômen perto do baço e selecione os camundongos com tumores ortotópicos. Para cada tumor, prepare um tubo C com tampão de digestão tumoral. Use 3 mililitros de tampão de digestão para fragmentos tumorais inferiores a 0,8 gramas para garantir que o tumor esteja totalmente digerido.

Rotule o tumor com o código de estudo, tumor, RG do rato, grupo de tratamento e peso tumoral. Pegue o tumor do rato. Lave o tumor em PBS frio e limpe o tecido ligado ao tumor.

Coloque tumor na mídia de digestão em um poço de uma placa estéril de 6 poços. Segure o tumor no lugar com pinças estéreis ou fórceps e corte com um bisturi. Corte o tumor bem o suficiente para quebrar em pedaços menores.

Agora, coloque os pedaços do tumor de volta no tubo C e use o tampão de digestão restante para lavar a placa. Transfira o fluido para o tubo C e coloque-o no gelo até a digestão. Em seguida, ligue o dissociador com aquecedores.

Coloque a dissociação do tumor C-tube de cabeça para baixo na manga da posição vaga. Ajuste o status da posição do tubo de Livre para Selecionado. Escolha um programa de dissociação siga pela seleção da pasta necessária onde a lista de programas é exibida.

Após o término do programa, tire o tubo C do dissociador e gire brevemente para palete a amostra. Agora, suspenda as amostras e coloque-as em um coador de células acima de um tubo de 50 mililitros. Lave a célula através do coador celular com 10 mililitros de tampão de lavagem para fornecer uma única suspensão celular.

Depois de centrifugar tubo a 300 G por 5 minutos, descarte o supernasciente e suspenda as células com 5 mililitros de tampão de lavagem. Conte células viáveis e ajuste a concentração celular para 1 milhão de células por tubo ou por amostra. Realize o design do painel imunológico, imunostaining e fluorescência menos um controle como detalhe no protocolo de texto.

Prepare as contas UltraComp enquanto os instrumentos de fluxo estão aquecendo-os completamente antes do uso. Rotule um tubo de amostra separado de 12 x 75 milímetros para cada anticorpo conjugado fluorocromático. Adicione 100 microliter de tampão de coloração a cada tubo seguido por uma gota completa das contas.

Adicione anticorpos e realize o procedimento de coloração conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, adicione 0,5 mililitro de tampão de coloração a cada pelota de contas e suspenda completamente via vórtice. Agora, defina a tensão PMT de citometria de fluxo por tecido alvo para o experimento dado.

Execute a amostra através da citometria Flow para aquisição de dados, ganhando na população de contas únicas por dispersão de frente e leituras de dispersão lateral. Defina a vazão em torno de 200 a 300 eventos por segundo. Defina a compensação apropriada para um determinado anticorpo de conjugação fluorescein FITC usando um gráfico de pontos FL1 versus FL1.

Coloque um portão do quadrante para que as contas negativas estejam dentro do quadrante inferior esquerdo e as contas positivas estejam dentro do quadrante superior ou inferior direito. Ajuste os valores de compensação até que a intensidade mediana de fluoresceína de cada população seja aproximadamente igual. Repita estes passos para todos os tubos.

Agora, prossiga para a aquisição de amostras de manchas reais. Execute o assistente de compensação e salve a configuração com o formato:data, experimento e suas iniciais. A implantação ortotópica do adenocarcinoma ductal pancreático resultou em crescimento rápido do tumor semelhante ao observado na implantação subcutânea.

Imagens representativas de hematoxílina e eosina são mostradas e demonstram crescimento semelhante de implantes subcutâneos e ortotópicos. Foram obtidos rendimentos razoavelmente elevados de células viáveis a partir da amostra tumoral de ambos os tipos de implantação. O representante FACS splat mostra células viáveis do tumor separados das células mortas e detritos celulares.

Mostrado aqui, é um tumor infiltrando-se em um perfil imunológico comparando a população de células principais e numeradores de vários subconjuntos-chave de células imunes tumorais. Homoenerxerto subcutâneo versus ortotópico de câncer de pâncreas são mostrados. Os dados mostram claramente que o tumor aumentou significativamente a infiltração de células imunes em comparação com o pâncreas de camundongos saudáveis.

Além disso, diferentes percentuais de subconjuntos de células imunes infiltrados de tumor foram encontrados em homoenerxertos ortotópicos versus subcutâneos. Por exemplo, há significativamente mais células B em ortotópico do que em subcutâneos. Ao tentar este procedimento é importante lembrar de preparar todos os materiais e reagentes associados com antecedência.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar análises FACS para modelos murine.