Name: Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda a realizar imunofenotipagem de homoenxertos ortotópicos de adenocarcinoma ductal pancreático murino usando citometria de fluxo multi-marcadores. Este método permite perfilar o microambiente imunológico tumoral em modelos PDAC.

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Os autores gostaria de agradecer o Dr. Jody Barbeau - leitura crítica e edição do manuscrito e graças a Ralph Manuel para a concepção de obras de arte. Os autores também gostaria de agradecer a equipe de coroa Bioscience biomarcador de imuno-Oncologia Oncologia e a equipe de Oncologia In Vivo , por seus grandes esforços técnicos.

Todos os protocolos e aditamentos ou procedimentos que envolvem o cuidado e a utilização de animais serão revistos e aprovados pela coroa Bioscience institucional Animal Care e Use Comité (IACUC) antes da realização de estudos. O cuidado e a utilização de animais serão normalmente conduzidas em conformidade com as diretrizes internacionais AAALAC (Associação para a avaliação e acreditação of Laboratory Animal Care) conforme relatado no guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, pesquisa nacional Conselho (2011). Todos os procedimentos experimentais animais estarão sob condições estéreis, nas instalações da SPF (específico isentos de organismos patogénicos) e conduzido em estrita conformidade com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório, de instituições de governo diferentes (por exemplo Os institutos nacionais de saúde). O protocolo terá de ser aprovado pelo Comité de ética de Animal experiências na instituição de instalação (por exemplo, Comissão dos assuntos institucionais IACUC).
1. preparação para o transplante de Tumor
<ol><li>
Alojamento dos animais
	<ol>
<li>Obter genéricos camundongos C57BL/6 de um fornecedor de reprodução comercial.</li>
		<li>Ratos de casa (5) em gaiolas ventiladas individuais nas seguintes condições: temperatura: 20-26 ° C; 30 – 70% de umidade; ciclo de iluminação: luz 12 h e 12 h de escuro.</li>
		<li>Uso milho espiga de cama é mudada semanalmente.</li>
		<li>Para dieta, fornece irradiação esterilizada grânulo seco comida durante o período de estudo inteiro.</li>
		<li>Para a água, fornece animais livre acesso à água potável estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de fragmento de tumor de doador
	<ol>
<li>Começar pelo monitoramento do peso corporal (PC), através de pesagem usando um contrapeso e tumor volume (TV), pela medição da maxila, dos ratos de tumor-rolamento doador.</li>
		<li>Quando TV atinge 500 – 1.200 mm3, abater o animal em uma capa de risco biológico conforme protocolo.</li>
		<li>Esterilize a pele ao redor do tumor, usando cotonetes Iodofor.</li>
		<li>Remover cirurgicamente o tumor (detalhes descritos na secção 3: colheita de necropsia e tumor) e coloque o tumor em uma placa de Petri contendo 20 mL de PBS (pre-chill a mídia ou o buffer de 4 ° C antes da eutanásia de animais).</li>
		<li>Se houver sangue contaminante, transferir o tumor em outra placa de Petri e lavar o tumor com PBS.</li>
		<li>Cortado ao meio, removendo qualquer excesso de pele, vasos, calcificação e/ou necrose, o tumor.</li>
		<li>Escolha apenas intactas partes do tumor e colocá-los em um tubo de centrífuga estéril 50 mL e adicionar 20 mL de PBS então transportar o tubo para uma sala separada de animais para estudos de farmacologia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ortotópico e enxertia subcutânea (SC)
<ol><li>
Inoculação de SC
	<ol>
<li>Corte de tumores em 2 mm peças de diâmetro utilizando um bisturi, colocar 1 pedaço cada trocarte, para implantação de SC ou para posterior implantação ortotópico (veja abaixo).</li>
		<li>Anestesia o animal destinatário com 5% de isoflurano, que é mantido por um cone de nariz em 1%. O animal vai começar a relaxar, perder seu braço endireitante reflex e eventualmente tornar-se imóvel. A esta profundidade da anestesia pode facilmente ser despertados por estímulos dolorosos; permitir que a anestesia aprofundar até tais respostas à dor estão ausentes.</li>
		<li>Uma vez anestesiado, consertar os ratos em uma placa de experiência em posição lateral direita. Esterilize o mouse usando cotonetes Iodofor, particularmente as áreas circundantes dos tumores.</li>
		<li>Com um bisturi, faça uma incisão de pele de 0,5 a 1,0 cm no flanco esquerdo, só craniano até à anca.</li>
		<li>Túnel sob a pele no sentido do membro anterior, dois ou três centímetros, com fórceps rombudo.</li>
		<li>Assepticamente, transferir um cubo de tumor do meio e coloque no fundo do túnel subcutâneo.</li>
		<li>Visualmente, confirme que o tumor é no fundo do túnel (e não da incisão na pele).</li>
		<li>Feche a ferida com clipes de ferida.</li>
		<li>Monitore a animais post inoculação até recobra a consciência suficiente para manter o decúbito esternal. Animais de retorno de volta para sua gaiola somente após sua completa recuperação da anestesia. Completar o Log de anestesia e iniciar o gráfico de Saúde Animal. Pesar o destinatários animais diariamente por três dias</li>
		<li>Para um procedimento padrão, inocule os ratos de 5-10 por grupo para monitoramento de crescimento do tumor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Implantação ortotópico pancreático
	<ol>
<li>Anestesia e Analgesia<ol>
<li>Usar uma injeção de 2 mL cetamina e injeção de xilazina 0,42 mL (20 mg/mL) misturado com 5.91 água de injeção estéril ou solução salina em um volume de dose de 0,06 – 0.1 mL/20-25 g de massa corporal. Nota: De acordo com o bem-estar dos animal, analgesia é necessária ambos pré e pós operação. 0,05-0,1 mg /kg de buprenorfina, SC. A primeira dose é pré operação e depois uma dose 3 vezes cada operação de post 4 horas continuamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Operação cirúrgica para implantação ortotópico<ol>
<li>ANESTHETIZE ratos através de injeção intramuscular (IM) por passo 2.2.1.</li>
			<li>Depois que os animais são totalmente anestesiados, consertar os ratos em uma placa de experiência em posição lateral direita.</li>
			<li>Manter os ratos na posição lateral direita. Desinfecte a pele ao redor do baço com iodo depois de-iodinate com 75% de álcool etílico.</li>
			<li>Encontrar o ponto médio do baço e fazer uma incisão vertical de 1 cm no abdômen para expor o baço.</li>
			<li>Tirar uma parte do tecido do pâncreas sob o baço delicadamente com uma pinça de ponta plana e um pedaço de tumor homograft do mouse do mouse semente no pâncreas de rato destinatário de sutura por sutura cirúrgica de 9-0.</li>
			<li>Feche o abdômen com uma sutura de seda 6-0 a costura dupla. Alcançar a homeostase por compressão.</li>
			<li>Após o implante de tumor acabamento, se ocorrer sangramento nem tumor vazamento de tecido, manter os animais em uma gaiola quente.</li>
			<li>Monitorar o animal até que recupere a consciência suficiente para manter a prostração esternal; devolver o animal para a sala de animais após a completa recuperação da anestesia. Monitorar o tumor rolamento ratos por palpação do abdômen, perto do baço e selecionar para fora os ratos com tumores ortotópico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tumor-rolamento ratos saúde monitoramento
	<ol>
<li>Verifica o consumo de água e comida diariamente.</li>
		<li>Examine a aparência do mouse para uma pelagem ungroomed, pedaços, magreza, respiração anormal ou ascite.</li>
		<li>Palpe o abdómen para verificar se existem espontâneas tumores no fígado ou baço.</li>
		<li>Ratos, semanalmente, utilizando uma balança de pesar.</li>
		<li>Se qualquer um dos seguintes sinais clínicos são observados, os ratos são sacrificados para coleta de amostra e necropsia: perda de BW > 20%; prejudicada mobilidade (não é capaz de comer ou beber); incapaz de se mover normalmente devido à ascite significativa e alargada do abdome; esforço na respiração.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. necrópsia e colheita de Tumor
<ol><li>Inspecione visualmente e por palpação para a presença de tumores palpáveis antes do término.</li>
	<li>Rescisão, primeiro eutanásia em ratos conforme protocolo aprovado e abrir o abdômen e examinar visualmente o pâncreas para tumores.</li>
	<li>Corte o tumor por cirurgia mortal post e adicioná-lo ao frio PBS. Coloque todos os animais em uma câmara de eutanásia limpo, sem acusações, translúcido com tampa especial com uma porta para a entrega do dióxido de carbono a ser usado.</li>
	<li>Descarga de gás para a câmara a uma taxa de fluxo que produz inconsciência rápida com mínimo desconforto para o animal. A taxa de fluxo ideal para CO2 deve ser cerca de 2-2,5 L/min.</li>
	<li>Observe visualmente cada animal durante o procedimento de eutanásia para garantir a todos os animais recebem as concentrações de gases adequada e não recuperar a consciência durante o procedimento de euthanize.</li>
	<li>Manter o fluxo de gás pelo menos 1 min após a aparente morte clínica para minimizar a possibilidade de que um animal pode se recuperar (se apneicos mas não morto).</li>
	<li>Remova tecidos adjacentes não-tumoral. Tumor limpo pode ser fotografada rapidamente. Coloque os tecidos de tumor em RPMI-1640 e manter no gelo antes de dissociação. Nota: Carcaças de animais são ensacadas e armazenadas no congelador apropriado aguardar a remoção.</li>
</ol>4. tumor tecido dissociação e única célula preparação
<ol><li>
Preparação do reagente Nota: O Kit de dissociação de Tumor contém 2 frascos de enzima D (pó liofilizado), 1 frasco de enzima R (pó liofilizado), 1 frasco de enzima A (pó liofilizado) e 1 mL de tampão A.<ol>
<li>Prepare-se D enzima reconstituir o pó liofilizado em cada frasco com 3 mL de RPMI-1640. Prepare alíquotas de um volume adequado para evitar o congelamento-descongelamento-ciclos repetidos.</li>
		<li>Prepare a enzima R, reconstituir o pó liofilizado no frasco com 2,7 mL de RPMI 1640. Prepare alíquotas de um volume adequado para evitar o congelamento-descongelamento-ciclos repetidos.</li>
		<li>Prepare-se enzima A reconstituir o pó liofilizado no frasco com 1 mL de tampão A fornecidos com o kit. Fazer não o vórtice. Prepare alíquotas de um volume adequado para evitar grátis-degelo-ciclos repetidos.</li>
		<li>Prepare a mistura de enzima adicionando 2,35 mL de RPMI-1640, 100 µ l de enzima D, 50 µ l de enzima R e 12,5 µ l da enzima A em cada gentleMACS C-tubo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissociação do tumor
	<ol>
<li>Para cada tumor preparar um tubo C com mistura de digestão do tumor, por favor consulte a secção 4.1 para a preparação e diluição de tampão de digestão.</li>
		<li>Uso 3 mL digestão de tampão para fragmentos de tumor < 0,8 g e garantir que o tumor é totalmente digerido.</li>
		<li>Etiqueta com o código de estudo, tumor, rato ID, grupo de tratamento e peso do tumor.</li>
		<li>Recolher o tumor do mouse, lave o tumor em PBS fria e limpa o tecido anexado do tumor (tais como os vasos sanguíneos, gordura, fáscia, etc.).</li>
		<li>Colocar o tumor em mídia de digestão em um poço de um prato bem 6 estéril.</li>
		<li>Segure o tumor no lugar com uma pinça/Pinças esterilizadas e corte com um bisturi. Fatie o tumor bem o suficiente para quebrar em pedaços menores (~ 1 mm3).</li>
		<li>Coloque os pedaços de tumor volta no tubo de C... e usar o buffer de digestão restantes para lavar a placa e depois transferir o líquido para o C-tubo que é colocado no gelo até a digestão.</li>
		<li>Ligue o dissociador com aquecedores.</li>
		<li>Coloque a dissociação de tumor C-tubos de cabeça para baixo em mangas das posições vagas e ajustar o status de posições do tubo de Free para selecionado. Escolha um programa de dissociação (37_c_m_TDK_1), seguido pela seleção da pasta necessária, onde a lista de programas é exibida.</li>
		<li>Após o término do programa, tire C-tubos a dissociador e spin brevemente (300 x g, 4 ° C) para a amostra de Pelotas.</li>
		<li>Re-suspender as amostras e coloque em um coador de célula acima de um tubo de 50 mL. Lave as células através do filtro de celular com 10 mL de tampão de lavagem para fornecer uma suspensão de célula única.</li>
		<li>Centrifugar os tubos a 300 x g por 5 min, desprezar o sobrenadante e ressuspender as células com 5 mL de tampão de lavagem, contagem de células viáveis usando trypan azul e/ou pelo contador de célula e ajustar a célula concentraton a 1 x 106 células por tubo ou por amostra. Incluem os anticorpos de controle isotipo correta para garantir a coloração é específica</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. projeto do painel imune e aquisição de dados de fluxo
<ol><li>
Projeto do painel
	<ol>
<li>Por favor, consulte a tabela 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining
	<ol>
<li>Células de amostra FC-bloco: re-suspender as células em 200 µ l de buffer com 1 µ g/mL Fc-bloco, seguido de incubação sobre refrigeração de gelo ou a 4 ° C por 15 min no escuro a coloração.</li>
		<li>Mancha de células usando os painéis de anticorpos/fluorescência desejado (por exemplo. T-Cell painel, painel do macrófago, etc.): Adicione a mistura de anticorpo diluída em tampão de bloqueio de Fc para cada amostra, a mancha pelo menos 30 min no gelo no escuro.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de PBS frio gelo a cada tubo e ressuspender as células suavemente, seguido por centrifugação a 300 x g durante 5 min. descartar o sobrenadante resultante.<ol>
<li>Repita o procedimento para lavar as células duas vezes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mancha para marcadores intracelulares, se necessário, seguintes passos 6-10, caso contrário pule para o passo 10.</li>
		<li>Ressuspender o centrifugado pelo vórtice do pulso e adicionar 200 µ l de solução de trabalho de fixação/permeabilização preparada para cada amostra. Vórtice de pulso novamente e então incubar a 4 ° C durante a noite (preferencial) ou 30 min à temperatura ambiente no escuro.</li>
		<li>Gire para baixo as células e remover o sobrenadante.</li>
		<li>Lave duas vezes pela adição de 1 mL de tampão de permeabilização (feita a partir de 10x Buffer de permeabilização, diluída com água destilada H2O) 1x seguido de centrifugação e decantação do sobrenadante.</li>
		<li>Adicione o anticorpo marcador intracelular em tampão de permeabilização 1x e incubar a temperatura ambiente por 30 min no escuro.</li>
		<li>Lave as células duas vezes com 1 mL de tampão de permeabilização 1x. Centrifugar e decantar o líquido sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células em 150 µ l de tampão de coloração e analisar em um citômetro. Devido ao processo de fixação e permeabilização, o FSC (dispersão de luz para a frente) / distribuição de SSC (dispersão sidelight) da população celular será diferente de células vivas. Portanto, o portão e tensões precisará ser modificado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Controles FMO (fluorescência menos um controle) Nota: Análise de fluxo de multi-color é particularmente importante para a análise das células do sistema imunológico tumor infiltrando. Portanto, há uma necessidade de encontrar uma maneira de identificar e células no contexto de dados se espalhou devido as várias fluorochromes em um determinado painel da porta. Controle FMO (menos uma fluorescência) é uma abordagem importante para essa finalidade.<ol>
<li>Para este fim, incluem mouses adicionais em cada grupo para controles FMO (pelo menos 2 por Rx) e processo individual para cada tecido. Após a dissociação, tecidos de piscina. Por exemplo, em um estudo com 4 grupos de Rx, 8 tumores adicionais devem ser processados individualmente e então agrupados em uma amostra para FMO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Configuração de instrumento de fluxo
	<ol>
<li>Fazer contas de compensação, enquanto a máquina está a aquecer (pelo menos 20 min).</li>
		<li>Use grânulos do CS & T para verificar o desempenho.</li>
		<li>Configurações de tensão e compensação: usar grânulos UltraComp, vórtice o Comp grânulos cuidadosamente antes de usar.</li>
		<li>Rotule um tubo de amostra2 12 x 75mm separado para cada anticorpo conjugado fluorocromo.</li>
		<li>Adicione 100 µ l de buffer para cada tubo de coloração. Adicione 1 gota cheia (cerca de 60 µ l) dos grânulos para cada tubo.</li>
		<li>Acrescente os anticorpos e realizar o procedimento de coloração exatamente como o processo de amostra afirmado na seção 4.</li>
		<li>Adicione 0,5 mL de tampão cada, completamente re-suspender pelotas grânulo através do vórtice de coloração.</li>
		<li>Definir a tensão de PGTO de citômetro de fluxo por tecido-alvo para a determinada experiência.</li>
		<li>Execute através do citômetro de fluxo para aquisição de dados, por retenção na população de grânulo singlete por leituras de FSC e SSC.</li>
		<li>Definir taxa de fluxo em torno de 200 – 300 eventos/s.</li>
		<li>Definir a compensação adequada para uma determinado fluoresceína [FITC]-anticorpo conjugado, uso um FL1 vs FL2 ponto enredo.</li>
		<li>Coloque um portão do quadrante grânulos negativos estão no quadrante inferior esquerdo e os grânulos positivos estão na parte superior ou inferior direito quadrante. Ajuste os valores de compensação até a intensidade de fluorescência mediana (IFM) de cada população (como mostrado na janela de estatísticas do quadrante) é aproximadamente igual (ou seja, para FL2-% FL1, FL2 IFM de ambas as contas devem ser semelhante).</li>
		<li>Repita as etapas 5.4.11 e 5.4.12 para todos os tubos.</li>
		<li>Proceda para adquirir o real manchada de amostras. Execute o assistente de compensação e salvar as configurações com o formato "data experimentar suas iniciais".</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. fluxo de dados análise e apresentação
<ol><li>Analise dados por Flowjo e/ou Kaluza.</li>
</ol>

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<li>Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-L1+expression+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+is+a+poor+prognostic+factor+in+patients+with+high+CD8%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes%3A+highly+sensitive+detection+using+phosphor-integrated+dot+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining.</a> Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImmunoScore+Signature%3A+A+Prognostic+and+Predictive+Tool+in+Gastric+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer.</a> Ann. Surg. , (2016).</li>
<li>Ribas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Blockade+Expands+Intratumoral+Memory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells.</a> Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).</li>
</ol>

Todos os autores são empregados em tempo integral da coroa Bioscience, Inc.

Embora estudos utilizando tumores de SC são mais facilmente conduzidos, modelos de tumores orthotopically implantado podem potencialmente ter mais relevantes para os estudos de farmacologia pré-clínica (particularmente as investigações I/O) fornecer Traduzibilidade próprios reforçado. Este relatório visa ajudar o leitores/público interessado para ser capaz de Visualizar diretamente os procedimentos técnicos que podem ser usados em suas respectivas pesquisas. Nossos protocolos de demonstram essa ortotópico implantação do ...

Adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) faz com que quase a metade um milhão mortalidade mundial anualmente, um dos top 5 câncer assassinos. Há poucas opções de tratamento eficazes e imunoterapias não aprovadas; Portanto, novos tratamentos são desesperadamente necessários. Cancros são cada vez mais sendo reconhecidos como doenças imunológicas, incluindo PDAC, além das doenças genéticas, como conhecido hoje. Fatores imunológicos e genéticos provavelmente iria determinar o prognóstico da doença, bem como tratamento os resultados. Tumores de iludir a vigilância imune hospedeiro e eventualmente avançam para causar a morte. Muitos destes processos imunes ocorrerem dentro o microambiente do tumor (TME)1,2,3,4 onde diferentes tipos de células do sistema imunológico interagem com células tumorais, com o outro e com outro tumor componentes do estroma, diretamente ou indiretamente através de citocinas que, finalmente, determinar o resultado de doença. Portanto, a caracterização dos componentes imunes tumor da TME ou tumor immunophenotyping, incluindo subtipos, numeração e localização de diferentes linhagens de células do sistema imunológico, é fundamental para compreensão imunidade anti-tumoral. No caso do PDAC, foi proposto que elevou o tumor infiltrando supressivos macrófagos (TAM) e células B conduziram a prevenção da infiltração de células T e/ou ativação e níveis elevados de fibrose5,6.
A abordagem comum para TMEs imunes a investigar experimentalmente estaria usando modelos animais pré-clínicos de substituto tumor, tumor de rato principalmente relevante os modelos7, particularmente do mouse syngeneic (homograft) ou modelos de rato geneticamente modificados (GEMM) de câncer, na similaridade assumida de rato e humanos para tumores e imunidade8,9. Entende-se na realidade que existem diferenças inerentes entre as duas espécies de10,11.
Transplantado rato tumores têm vantagens operacionais significativas sobre tumores espontânea7, ou seja desenvolvimento de tumor sincronizado, em contraste com o desenvolvimento de tumor espontânea GEMM parental. Stent de tumores murino espontâneas é considerados tumores primários nunca tendo sido manipularam in vitroe espelhamento original rato tumor histo - molecular patologia7, bem como possíveis perfis imunes. Estes murino stent é muitas vezes consideradas ser "uma versão do mouse do paciente-derivado xenografts (PDXs)". Portanto eles provavelmente têm um melhor Traduzibilidade próprios que cela syngeneic convencional linha-derivado do mouse tumores12. Em particular, muitos stent é derivadas do GEMM específico onde mecanismos de doenças humanas específicas, por exemplo, as mutações de motorista oncogênica, são projetados, e estes stent, portanto, deve ter vantagens para sua relevância clínica. Em particular, a KPC GEMM desenvolver rato PDAC dentro de 15-20 semanas de idade, que recapitula morfologicamente a doença humana com predominantemente bem a moderadamente-diferenciadas de arquitetura glandular e altamente enriquecido o estroma. Este modelo também recapitula as características genéticas mais comuns de PDAC humana, nomeadamente Kras ativando mutação e perda-de-função P53, que ocorrem em 90% e 75% do PDAC humana, respectivamente de5,6.
Sites de transplante também sugeridos que desempenham um papel na Traduzibilidade próprios do modelo. Específicos do ambiente circundante de tecido, como um ambiente ortotópico correspondente, poderia ser um nicho para tumores específicos para ambientes de progresso, em oposição a uniforme subcutânea (SC) para tumores comumente transplantados. Seria de particular interesse se, e/ou, que diferença existe entre os dois locais de transplante, em termos de microambiente imunológico e a relevância para câncer humano, por exemplo. no caso do PDAC.
Um dos aspectos mais importantes da criação de perfil imune, ou immunophenotyping, é determinar o tumor infiltrando as células imunes de linhagens diferentes, os números, percentual relativo dentro tumores, bem como seus Estados de ativação e locais. Isso inclui o tumor-infiltratrating lymphoctyes (TILs, ambos T - e B-), tumor infiltrando macrófagos (TAMs), tumor infiltrando células assassinas naturais (NKs) e residente em tumor dendrítica células3,13,14 , 15 , 16 , 17e a Localização subcellular de certas células18,19,20, etc. Fluorescência citometria de fluxo ou classificação de celular ativado (FACS) é uma tecnologia de deteção de célula única que é comumente usada para medir os parâmetros específicos de uma célula. Multi cor medidas de citometria de fluxo vários marcadores em uma única célula3,4,21 e é o método mais comumente utilizado para determinar o número e a percentagem relativa de diferentes subconjuntos de células do sistema imunológico, incluindo aqueles dentro de tumores.
Este relatório descreve procedimentos para perfilação tumor infiltrando células do sistema imunológico: 1) implantação de ortotópico PDAC rato tumor stent, juntamente com a implantação de SC; 2) tumor tecido colheita e preparação única célula através de dissociação de tumor; 3) análise de citometria de fluxo de todas as células derivadas de tumores, como uma linha de base; 4) comparação dos perfis de linha de base de ambas as abordagens de transplante.

<table><tbody><tr><td>Máquina de anestesia</td><td>\</td><td>SAS3119</td><td>\</td></tr><tr><td>Trocarte 20</td><td>\</td><td>\</td><td>2 mm</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>\</td><td>\</td><td>20 mm</td></tr><tr><td>100x antibiótico</td><td>\</td><td>\</td><td>\</td></tr><tr><td>Cotonetes de iodóforo</td><td>\</td><td>\</td><td>Compra diária de farmácia</td></tr><tr><td>Cotonetes de álcool</td><td>\</td><td>\</td><td>Compra</td></tr> <tr><td>diária de farmáciaNitrogênio líquido</td><td>Ar químico</td> <td>\</td><td>\</td></tr> <tr><td>Capa de biossegurança</td><td>AIRTECH</td><td>BSC-1300IIA2</td> <td>\</td></tr> <tr><td>FACS máquina LSRFortessa X-20</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td> <td>\</td></tr> <tr><td>anticorpos</td><td>BD</td> <td>\</td> <td>\</td></tr> <tr><td>Trevigen MD ou BD Matriz de membrana basal Alta concentração</td><td>BD</td><td>354248</td> <td>\</td></tr> <tr><td>FACS buffers</td><td>BD</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>553142563794Filtros</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>BD-Falcon</td><td>352350</td><td>70 &micro; m</td></tr><tr><td>tubo de sangue de rotina</td><td>BD-Vacutainer</td><td>365974</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Kaluza</td><td>Beckman</td><td></td><td>vs 1.5</td></tr><tr><td>placas de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3516</td> <td>\</td></tr> <tr><td>Foxp3 Fix / Perm kit</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td> <td>\</td></tr> <tr><td>UltraComp eBeads</td><td>ebioscience</td><td>01-2222-42</td> <td>\</td></tr> <tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810R,5920R</td><td>\</td></tr> <tr><td>Software FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td> <td>\</td> <td>vs 10.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Hyclone</td><td>SH30809.01</td> <td>\</td></tr> <tr><td>Bisturis descartáveis e estéreis</td><td>Jin zhong</td><td>J12100</td><td>11 #</td></tr> <tr><td>cabo de faca</td><td>Jin zhong</td><td>J11010</td> <td>\</td></tr> <tr><td>tesouras e pinças para os olhos</td><td>Jin zhong</td><td>Y00030</td><td>Tesoura para os olhos 10 cm</td></tr><tr><td>tesouras e pinças para os olhos</td><td>Jin zhong</td><td>JD1060</td><td>Pinças para os olhos 10 cm com dentes</td></tr><tr><td>Tanque portátil de nitrogênio líquido</td><td>Jinfeng</td><td>YDS-175-216</td> <td>\</td></tr> <tr><td>Balança eletrônica</td><td>Metter Toledo</td><td>AL204</td><td>0-100 g</td></tr><tr><td>Miltenyi C-tubes</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-334</td> <td>\</td></tr> <tr><td>Miltenyi Gentle MACS com blocos aquecedores</td><td>Miltenyi</td><td>120-018-306</td><td>\</td></tr><tr><td>Kit de Dissociação de Tumor</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-730</td><td>\</td></tr><tr><td>Contador de células</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer</td><td>Cellometer Auto T4</td></tr><tr><td>tubo de criopreservação</td><td>Nunc</td><td>375418</td><td>1,8 mL</td></tr><tr><td>Cultrex Alta Concentração de Proteína (HC20+) BME</td><td>PathClear</td><td>3442-005-01</td><td>\</td></tr><tr><td>seringas</td><td>Shanghai MIWA indústria médica</td> <td>\</td> <td>1-5 mL</td></tr><tr><td>Studylog software</td><td>Studylog</td> <td>\</td> <td>software</td></tr><tr><td>Studylog-Balance e suporte USB</td><td>OHAUS</td><td>SE601F</td><td>Balance e suporte USB</td></tr><tr><td>Studylog-Data linha de paquímetros vernier</td><td>Sylvac</td><td>926.6721</td><td>Linha de dados de paquímetros vernier</td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Sylvac</td><td>910.1502.10</td><td>Sylvac S-Cal pro</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga esterilizados</td><td>Thermo</td><td>339653</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga esterilizados</td><td>Thermo</td><td>339651</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>Thermo</td><td>KLCS-288</td><td>4 &deg; C</td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>Thermo</td><td>PLF-276-20</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>Balde de gelo</td><td>Thermo</td><td>DW-862626-80</td> <td>&deg; C</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermo</td><td>am7021</td><td>\</td></tr></tbody></table>

immunophenotyping de ortotópico homograft (syngeneic) de murino kpc primário de adenocarcinoma ductal do pâncreas por citometria de fluxo

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) tumores são o carro-chefe de pesquisa pré-clínica do hoje imuno-Oncologia (i/o). O microambiente do tumor (TME), particularmente seus componentes-imunológico, é vital para o prognóstico e previsão de resultados dos tratamentos, especialmente aqueles de imunoterapia. TME imune-componentes são compostos de diferentes subconjuntos de tumor infiltrando as células imunes avaliável por multi cor FACS. Adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) está entre os mais mortíferos malignances falta de opções de tratamento bom, assim, uma necessidade urgente e insatisfeita médica. Uma razão importante para a sua não-capacidade de resposta às diversas terapias (quimioterapia-, alvo, I/O) tem sido seu TME abundante, composta por fibroblastos e leucócitos que protegem as células do tumor destas terapias. Orthotopically implantado PDAC acredita-se que mais precisão recapturar o TME de cânceres pancreáticos humanos do que os modelos convencionais de subcutânea (SC).
Tumores homograft (KPC) são transplantes de rato espontânea PDAC originários de KPC-ratos geneticamente modificados (K-rasG12D / +/P53- / -/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). O tecido do tumor primário é cortado em pequenos fragmentos (~ 2 mm3) e transplantado por via subcutânea (SC) para os destinatários syngeneic (C57BL/6, 7-9 semanas de idade). O stent foram então cirurgicamente orthotopically transplantado para o pâncreas de novos camundongos C57BL/6, juntamente com SC-implantação, que atingiram volumes de tumor de 300 – 1.000 mm3 por 17 dias. Somente os tumores de 400 – 600 mm3 foram colhidos por procedimento aprovado autópsia e limpo para remover os tecidos de tumor não adjacentes. Eles foram dissociados por protocolo usando um dissociador tecido em suspensões de célula única, seguidas por coloração com painéis designados de fluorescente etiquetado anticorpos para os vários marcadores de diferentes células do sistema imunológico (linfoide, mieloide e NK, DCs). As amostras coradas foram analisadas usando FACS multi cor para determinar o número de células do sistema imunológico de linhagens diferentes, bem como a sua percentagem relativa dentro de tumores. Os perfis imunes de ortotópico tumores foram então comparados dos tumores do SC. Os dados preliminares demonstraram TILs/TAMs infiltrante significativamente elevados em tumores sobre o pâncreas e infiltração de células B maior ortotópico em vez de tumores do SC.

Ortotópico implantação do PDAC resultou no crescimento do tumor rápida semelhante à observada para implantação de SC. Depois que os fragmentos de tumor de doadores foram implantados em ratos destinatários, tanto por via subcutânea e orthotopically de acordo com os protocolos descrito nos passos 2.1 e 2.2, os tumores de homograft KPC implantados demonstraram semelhante rápido crescimento, como mostrado em figura 1A . Tumores de homograft KPC colhidas nos ponto...

O procedimento experimental sobre o immunophenotyping de stent de murino ortotópico PDAC visa perfilação a imuno-microambiente do tumor. Os tumores são orthotopically implantado através de cirurgia. Tumores de 200-600 mm3 no tamanho foram colhidos e dissociados para preparar suspensões de célula única, seguidas de análise multi imune marcador FACS usando diferentes anticorpos fluorescente-etiquetadas.

Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Esta mensagem pode ajudar a responder a perguntas-chave em Imunofenofoteping em modelos murinos, como marcadores usados para identificar diferentes linhagens de imunidade e estratégias de envelhecimento. A maior vantagem desta técnica é que o marcador e o envelhecimento, quando imunofenofoteping, podem ser aplicados a uma variedade de modelos murinos. Monitore o peso corporal de C57 Black 6 camundongos usando um equilíbrio.Além disso, monitore o volume tumoral de camundongos doadores variados por medição de calibre. Seguindo a eutanásia do animal em um capô de risco biológico conforme o protocolo, esterilize a pele ao redor do tumor usando cotonetes de iodophor. Após a remoção cirúrgica do tumor conforme detalhado no protocolo de texto, coloque o tumor em uma placa de petri contendo 20 mililitros de PBS que foi pré-refrigerado a 4 graus Celsius.Se houver sangue contaminante, transfira o tumor para outra placa de Petri e lave o tumor com PBS. Corte o tumor ao meio. Remova qualquer pele extra, vasos, calcificação e necrose.Escolha apenas pedaços intactos de tumor e coloque-os em um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéril. Adicione 20 mililitros de PBS antes de transportar tubo pa

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Células-tronco cancerosas (CSCs) foram identificados em uma série de tumores malignos. Neste protocolo, descrevemos um método de citometria de fluxo utilizando atividade aldeído desidrogenase e CD44 e CD24 expressão para isolar CSCs de xenoenxertos adenocarcinoma pancreático humano. Estas células viáveis ​​podem então ser utilizados em estudos funcionais e analíticos.

Isolamento de células-tronco de xenoenxertos Humano do Câncer de pâncreas

O vídeo explica um método cirúrgico passo a passo para implantação ortotópica de um fragmento tumoral de um doador canceroso para o pâncreas de um camundongo receptor não canceroso para o desenvolvimento de câncer de pâncreas. O PDAC implantado ortotopicamente pode recapturar o microambiente tecidual de cânceres pancreáticos humanos do que os modelos subcutâneos (SC) convencionais com mais precisão.

Transplante de tumor ortotópico de homoenxerto: uma técnica para gerar modelos de camundongos com tumor pancreático

A geração de um modelo de rato ortotópico de mesotelioma pleural maligno por implantação de II-45 células de mesotelioma na cavidade pleural de ratos imuno-competentes é apresentado. Um método de citometria de fluxo para analisar sete subconjuntos de células imunitárias em animais a partir destes uma amostra de sangue de 25 uL é também descrito.

Orthotopic Implantação e Acompanhamento Peripheral Imune celular no Modelo II-45 Rat Singênico mesotelioma

Nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de marcadores de células estaminais de leucemia em células de leucemia mieloide aguda primária por citometria de fluxo. Nós mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts.

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

Aqui descrevemos um modelo de transplante ortotópico syngeneic minimamente invasiva de células de adenocarcinoma do pulmão como um modelo de redução de custos e tempo para estudar o câncer de pulmão não-pequenas células.

Ortotópico transplante de células de Adenocarcinoma de pulmão Syngeneic para estudar a expressão de PD-L1

Descrevemos um protocolo para a implantação guiada por ultrassom de linhas de células de adenocarcinoma ductal pancreática derivada de urina diretamente no local do tumor nativo. Esta aproximação conduziu aos tumores pancreatic detectáveis pela exploração do ultra-som dentro de 2-4 semanas da injeção, e reduziu significativamente a semeadura da pilha do tumor da proporção na parede peritoneal em comparação à implantação ortotópica cirúrgica.

Implantação ortotópica guiada por ultrassom do Adenocarcinoma Ductal Pancreático murine

Este protocolo descreve a geração cirúrgica de tumores pancreatic ortotópicos e a digestão rápida de tumores pancreatic recentemente isolados do murine. Após a digestão, populações de células imunes viáveis podem ser usadas para análise a jusante, incluindo a estimulação ex vivo das células T para detecção intracelular de citocina por citometria de fluxo.

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

Aqui, apresentamos um protocolo de transplante de tumor para a caracterização de linfócitos derivados de tumores inerentes ao tumor e periferia em um modelo de tumor de camundongos. O rastreamento específico do influxo de células imunes derivadas do receptor com citometria de fluxo revela a dinâmica das alterações fenotípicas e funcionais dessas células durante as respostas imunológicas antitumorais.

Transplante de tumor para avaliar a dinâmica das células CD8+ T que se infiltram em tumores em camundongos

Aloenxertos ortotópicos singênicos de adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) de camundongos recapitulam a biologia, os fenótipos e as respostas terapêuticas dos subtipos da doença. Devido à sua rápida e reprodutível progressão tumoral, são amplamente utilizados em estudos pré-clínicos. Aqui, mostramos práticas comuns para gerar esses modelos, injetando culturas de PDAC murino singênico no pâncreas.

Aloenxertos Ortotópicos Singênicos de Camundongos para Modelo de Câncer de Pâncreas

Descrevemos um método para utilizar linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) de camundongos por meio de citometria de fluxo para transferência de células adotivas. Este protocolo tem como objetivo verificar a citotoxicidade específica de TILs contra tumores em um modelo de camundongo com câncer de pâncreas singênico, fornecendo informações sobre o desenvolvimento de terapias celulares adotivas para câncer de pâncreas.

Isolamento baseado em citometria de fluxo e avaliação terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor em um modelo de câncer de pâncreas em camundongo

Aqui, um método baseado em citometria de fosfofluxo é descrito para analisar a sinalização a jusante das vias mTORC1, JAK/STAT5 e MAPK em células de leucemia mielóide humana aguda xenoenxertadas em camundongos e obtidas de aspirados de medula óssea. Os níveis de p-STAT5, p-4EBP1, p-RPS6 e p-ERK1/2 são medidos simultaneamente usando um citômetro de fluxo espectral de última geração com alta sensibilidade.

Citometria de fosfofluxo intracelular de xenotransplantes derivados de pacientes com leucemia mielóide aguda

Aprenda a realizar imunofenotipagem de homoenxertos ortotópicos de adenocarcinoma ductal pancreático murino usando citometria de fluxo multi-marcadores. Este método permite perfilar o microambiente imunológico tumoral em modelos PDAC.

Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal

Immunophenotyping de ortotópico Homograft (Syngeneic) de murino KPC primário de Adenocarcinoma Ductal do pâncreas por citometria de fluxo

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