Avaliação pré-clínica da Bioatividade da OT48 de cumarina Anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e Xenografts Zebrafish

Aqui, apresentamos o rastreio pré-clínico de cumarinas anticâncer usando zebrafish e cultura 3D.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da descoberta de medicamentos para identificar o efeito anticancerígeno e obter uma melhor visão mecanicista de novas moléculas usando sistemas de cultura 3D in vitro e in vivo. A principal vantagem desta técnica são as variedades de efeito farmacológico dos compostos em um modelo in vivo mais fisiologicamente relevante. Para começar, coloque 20.000 células A549 por centímetro quadrado em 15 mililitros de meio de cultura de células RPMI 1640, suplementado com 10% de FBS e 1% de antibióticos, em um frasco de 75 centímetros quadrados.

Incubar a cultura a 37 graus Celsius e 5% de CO2. No dia do experimento, use um hemocitômetro para determinar a concentração celular. Colete 50.000 células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro por centrifugação a 400g por sete minutos e ressuspenda as células em 100 microlitros de PBS 1x estéril.

Usando uma pipeta múltipla, dispense 1,1 mililitros de meio semissólido à base de metilcelulose, ou MCBM, em tubos, preparando um tubo para cada condição. Em seguida, adicione 110 microlitros de FBS a cada tubo. Em seguida, economize 1000 células por mililitro.

Em seguida, pipete 2,4 microlitros da solução de célula estoque nos tubos de MCBM e FBS. Depois de adicionar as células, segure os tubos verticalmente e os vortex na velocidade mais alta por um minuto para misturar completamente o MCBM e as células. Agora, adicione o composto de teste OT48 sozinho ou em combinação com A1210477 às amostras.

Prepare um tubo separado como controle para o solvente usado, como DMSO. Em seguida, vortex as amostras por um minuto. Para cada ensaio, pipete um mililitro da mistura no poço central de uma placa de cultura de células de 12 poços.

Em seguida, use um mililitro de água estéril ou PBS para encher os poços vazios. Incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 10 dias. Em seguida, adicione 200 microlitros de uma solução estoque de MTT de cinco miligramas por mililitro a cada poço.

Depois de incubar as placas por dez minutos, verifique se há colônias viáveis que ficarão violetas. Usando uma placa de fundo branco, capture imagens usando as seguintes configurações:Para método, escolha digitalizar. Para o tipo de exposição, escolha precisão.

Para o tempo de exposição, escolha manual e um segundo. Para sensibilidade e resolução, escolha alta resolução. Em seguida, salve as imagens capturadas no formato TIFF.

Com o software ImageJ, quantifique as colônias viáveis selecionando o menu imagem, tipo, 8 bits. Selecione o ajuste e o limite do menu. Defina o limite para controlar e mantê-lo constante para todas as condições.

Em seguida, selecione o menu analisar, analisar partículas. Salve os dados e analise-os com um software estatístico para representação gráfica. Depois de preparar os reagentes de estoque de acordo com o protocolo de texto, separe uma fêmea e um macho em um tanque divisório cheio de água da torneira esterilizada e filtrada por UV a 28,5 graus Celsius e coloque-os no escuro.

Após 24 horas de separação, remova a partição para iniciar o acasalamento. Transfira os ovos fertilizados do tanque de acasalamento para uma placa de Petri contendo cinco mililitros de solução fresca de Danios. Use cinco mililitros de solução de Danios para lavar os ovos três vezes usando uma pipeta para aspirar cuidadosamente os ovos e transferi-los para cinco mililitros de solução fresca.

Em seguida, incube os ovos a 28,5 graus Celsius por oito horas. Mude para a solução Danios contendo 0,03% PTU para inibir a pigmentação e separar os ovos opacos não fertilizados para evitar contaminação. 24 horas após a fertilização, use uma pinça afiada para descorionar os embriões.

Em seguida, incube os embriões em solução de Danios com PTU até 48 horas após a fertilização. Após semear as células A549 e incubá-las com compostos de acordo com o protocolo de texto, 24 horas antes do final do tratamento, adicione quatro micromolares do corante rastreador de células fluorescentes, CM-Dil, para corar as células e incubá-las por duas horas. Após a incubação, use 0,05% de tripsina-EDTA para tripsinizar as células.

Em seguida, dilua dez até a sexta células em 50 microlitros de solução PBS de vermelho de fenol antes da injeção. Para realizar a microinjeção de células cancerígenas, puxe um capilar de vidro de 1,0 milímetro usando as seguintes configurações do programa:Use uma seringa para cortar o capilar para produzir uma borda afiada. Em seguida, carregue o microcapilar com 20 microlitros da solução de vermelho de fenol celular.

Depois de anestesiar o peixe-zebra de acordo com o protocolo de texto, injete de 100 a 200 células no saco vitelino injetando de seis a dez nanolitros por meio de três a cinco injeções. As microinjeções devem ser feitas com muito cuidado e precisão para garantir que o volume correto das células seja injetado e a lesão por injeção seja mínima e a pressão de dióxido de carbono seja ideal para evitar uma fissura lateral. Após a injeção, deixe o peixe se recuperar por dez a 30 minutos em cinco mililitros de solução fresca de Danios contendo PTU.

Transfira o peixe para placas de 24 poços com um mililitro de solução Danios PTU e incube-os a 28,5 graus Celsius por 72 horas. Após a incubação, após anestesiar os peixes de acordo com o protocolo de texto, imobilizá-los em uma lâmina de vidro com uma gota de 3% de metilcelulose. Tire imagens fluorescentes 5x em um comprimento de onda de 620 a 750 nanômetros.

Use o software ImageJ para quantificar o tamanho dos tumores de fluorescência selecionando analisar e medir. Em seguida, salve os valores de fluorescência e analise-os com um software de estatística para representação gráfica. Neste experimento, a linhagem celular de câncer de pulmão A549 foi semeada em MCBM para formar colônias após o tratamento com OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimético, A1210477, na concentração vista aqui.

Os resultados mostraram que a combinação reduziu significativamente o número, tamanho e área de superfície total das colônias após dez dias de incubação. Aqui, após o tratamento com OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimético, A1210477, as células foram autorizadas a formar esferóides usando a técnica da placa de fundo em U. Após uma incubação de três dias, os esferóides foram fotografados e quantificados, e imagens 3D foram geradas.

Esta figura ilustra o potencial inibitório de OT48 e/ou A1210477 na formação de tumores a partir da quantificação de tumores fluorescentes gerados quando as células tratadas foram injetadas no saco vitelino de peixe-zebra. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter o número de peixes para cada condição em torno de dez ou mais para evitar as variações importantes que afetam a avaliação estatística dos dados. Após este procedimento, outros métodos, como a análise histológica, podem ser realizados para avaliar a expressão da proteína-alvo no xenoenxerto de peixe-zebra.

Essa técnica abre caminho para que pesquisadores no campo da descoberta de medicamentos explorem a eficácia de compostos em um microambiente in vivo em xenoenxerto de peixe-zebra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como validar a eficácia do medicamento em um ambiente de cultura 3D.