Name: Avaliação pré-clínica da Bioatividade da OT48 de cumarina Anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e Xenografts Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Aprenda a avaliar a bioatividade anticâncer da cumarina OT48 usando esferoides, ensaios de formação de colônia e xenotransplantes em Danio rerio. Este método combina cultura 3D e modelos in vivo para descoberta de fármacos.

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Pesquisa no SNU é suportada por Fundação Nacional de pesquisa (NRF), pela MEST da Coreia para concessão de Tumor microambiente Global Core Research Center (GCRC), [número de concessão 2011-0030001]; por o Seul National University Research Grant e pelo cérebro Coreia (BK21) e mais o programa.

1. colônia formação ensaios
<ol><li>Células de cultura A549 em uma concentração de 20.000 células/cm2 em 15 mL de RPMI1640 celular cultura suplementado com 10% FBS (soro Fetal bovino) e 1% antibióticos num balão de2 75 cm numa incubadora de CO2 a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>No dia do experimento, determine a concentração de células usando um hemocytometer. Coletar 50.000 células por centrifugação a 400 x g durante 7 min em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e ressuspender as células em 100 µ l de 1 x PBS estéril (fosfato Buffered Saline) em tubos de 1,5 mL.</li>
	<li>Dispense a 1,1 mL de meio de baseada em metilcelulose semi-sólidos (MCBM) em tubos de 15 mL com um multipipette. Prepare um tubo para cada condição.</li>
	<li>Adicione 110 µ l de FBS a 1,1 mL de MCBM utilizando uma micropipeta P200.</li>
	<li>Células de sementes a 1.000 células/mL. Coletar 2.4 µ l de suspensão de células a partir da solução estoque (50.000 células em 100 µ l de PBS 1x) com uma micropipeta de P2 e adicionar a 1,1 mL de MCBM suplementado com 10% FBS.</li>
	<li>Depois de adicionar as células, vórtice os tubos por 1 min, segurando-os verticalmente na velocidade máxima a mistura MCBM e células bem.</li>
	<li>Adicione compostos de teste (OT48 sozinho ou em combinação com A1210477). Prepare um tubo separado como um controle para o solvente utilizado (aqui dimetilsulfóxido (DMSO)). Dependendo da concentração de compostos e o volume adicionado para cada condição, o solvente controle incluirá a maior concentração de solvente utilizado para as diluições de composto, o teste para avaliar os efeitos adversos causados pelo solvente.</li>
	<li>Tubos de vórtice para 1 minuto.</li>
	<li>Para cada ensaio, adicione 1 mL da mistura com uma micropipeta P1000 ao centro de uma placa de cultura de células de 12-bem.</li>
	<li>Preencha o vazios poços com 1 mL de água estéril ou 1X PBS para estabilizar a umidade.</li>
	<li>Incube as placas de cultura por 10 dias em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	<li>Após 10 dias de incubação, adicione 200 µ l de uma solução-mãe MTT (brometo de methylthiazolyldiphenyl-tetrazólio) (5 mg/mL) a cada poço para atingir uma concentração final de 1 mg/mL.</li>
	<li>Incube 10 min em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Vão virar colônias viáveis violeta.</li>
	<li>Capture a imagem usando uma câmera digital, usando a placa de fundo branco (bandeja de LAS diâmetro branco). Use as seguintes configurações: método, digitalizar; Tipo de exposição, precisão; Tempo de exposição, manual, 1 segundo; Sensibilidade/resolução, alta resolução. Salve a imagem no formato tiff.</li>
	<li>Quantificar as colónias viáveis usando software ImageJ. Seleccionar o menu "imagem | Tipo | 8 bits". Seleccionar o menu "ajuste | Limite". Definir o limiar para controlar e manter constante para todas as condições; Seleccionar o menu "Analyze | Analise as partículas". Salvar os dados e analisar com um software de estatísticas para a representação gráfica.</li>
</ol>2. spheroid formação ensaio
<ol><li>Células de cultura A549 em uma concentração de 20.000 células/cm2 frascos de 75 cm2 com 15 mL de RPMI 1640 suplementado com antibióticos FBS e 1% de 10%.</li>
	<li>No dia do experimento, preparar um 96 bem U-parte inferior da placa.</li>
	<li>Placa de 10.000 células em um poço que já contém o composto de interesse (aqui 50 µM de OT48) e/ou 20 µ m de A1210477. Ajuste o volume final de 100 µ l de meio de cultura celular. O número de células que formam os esferoides uniformes com um limite exterior intacto é considerado adequado para esferoides de formulário.</li>
	<li>Incube durante 3 dias na incubadora a 37 ° C e em 5% CO2.</li>
	<li>Após 3 dias de incubação, capture imagens dos esferoides usando um microscópio com ampliação de 4x.</li>
</ol>3. Zebrafish xenoenxertos ensaio
Nota: Esta abordagem técnica é visualizada como um esquema (Figura 1).
<ol><li>
Preparação de reagentes de estoque
	<ol>
<li>Preparar 1 L de solução do Danieau de 30x: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM de MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2e 150 mM HEPES. Ajuste o pH do buffer usando um medidor de pH de 7,6.</li>
		<li>Preparar a solução a 1% (50 x) tricaina: dissolver 20 mg de Metanossulfonato de 3-aminobenzoato de etilo (tricaina) em 2 mL de água destilada.</li>
		<li>Prepare-se 1% solução de vermelho de fenol-PBS: adicionar 2 µ l da solução de sal de sódio fenol vermelho a 198 µ l de solução de PBS esterilizada em um tubo de 1,5 µ l.</li>
		<li>Prepare-se 3% metilcelulose: Adicionar 3 g de metilcelulose a 100 mL de solução do Danieau de 1x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubação e produção de ovos de Zebrafish
	<ol>
<li>Separe um feminino e um masculino zebrafish em um tanque de partição preenchido com água da torneira filtrada e UV-esterilizados a 28,5 ° C, no escuro. Após 24h de separação, misture peixes de ambos os sexos para iniciar o acasalamento. Transferi ovos fertilizados do tanque de acasalamento para uma placa de Petri contendo 5 mL de solução de Danieau fresco.</li>
		<li>Lave os ovos três vezes com 5 mL de solução de Danieau. Para a lavagem, Aspire cuidadosamente com os ovos com uma pipeta e transferência para 5 mL de solução fresca. Incubar durante 8 h a 28,5 ° C.<ol>
<li>Após 8 h de incubação em solução do Danieau, altere a solução do Danieau contendo 0,03% 1-fenil-2-tioureia (PTU) para inibir a pigmentação. Classificar ovos opaco (não fertilizados ou contendo embriões subdesenvolvidos) para evitar a contaminação.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dechorionation embrião
	<ol>
<li>24h pós fertilização (hpf), dechorionate zebrafish embriões utilizando Pinças afiadas. Incubar os embriões para incubação em solução do Danieau com 0,03% PTU a 28,5 ° C até 48 hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da pilha de composto-tratados
	<ol>
<li>Células de A549 semente a 20.000 células/cm2 em frascos de cultura 25 cm2 . Após 24h de semeadura, adicionar compostos (aqui OT48 em 50 µM e e/ou A1210477 a 20 µM) por 24 h na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Configurar o tempo de tratamento para cada composto para manter a viabilidade das células mas para cometê-los para a morte celular. Desta vez ponto precisa ser configurado individualmente com base na viabilidade celular, morfologia e marcadores moleculares.</li>
		<li>2 h antes do final do tratamento, mancha de células com 4 µM de rastreador celular fluorescente tingem CM-Dil em 37 ° C e 5% de CO2. Após 2 h de incubação, trypsinize células com 0,05% do trypsin-EDTA e diluir 106 células em 50 µ l de solução de vermelho de fenol-PBS antes da injeção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microinjeção de células cancerosas para formação de enxerto heterólogo
	<ol>
<li>Anestesia o zebrafish em uma solução de metanosulfonato de 0,02% por 5 min até eles se acalmarem em uma placa de ágar.</li>
		<li>Puxe um 1.0 mm (fora o capilar de vidro de diâmetro (OD)) por um puxador de micropipeta (configurações do programa: p: 300, calor: 260, puxar: 60, VEL: 50 e o tempo: 200). Corte a conta com uma seringa para produzir uma borda afiada. Carregar microcapilares com 20 µ l de célula/vermelho de fenol-solução de PBS. Definir pressão de injeção e tempo para dispensar 2 nL por injecção.</li>
		<li>Injetar o saco vitelino por injetar 6 a 10 células de 100 – 200 nL através de injeções de 3 a 5. Após a injeção, permitir que peixes recuperar-se de 10 a 30 min em 5 mL de solução de Danieau fresco contendo solução PTU. Expedição peixe em placas de 24 poços com 1 mL de solução de Danieau contendo solução PTU é e incube por 72 h a 28,5 ° C.</li>
		<li>Após 72 h de incubação, anestesiar o peixe em uma solução de metanosulfonato de 0,02% e imobilizar em um slide de vidro com uma queda de 3% de metilcelulose. Tirar 5 fotos de x por microscopia de fluorescência no comprimento de onda de 620 a 750 nm.</li>
		<li>Quantificar o tamanho de tumores fluorescentes pelo software ImageJ. Seleccionar o menu "Analyze | Medida". Salvar os valores correspondentes ao sinal fluorescente e analisar com um software de estatísticas para a representação gráfica.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li>
<li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li>
<li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models%3A+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li>
<li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+3D+culture+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289(2015).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li>
<li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis%284-hydroxy-2H-chromen-2-one%29%3A+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406473">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER%2FGolgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li>
<li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li>
<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).</li>
<li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li>
<li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

As taxas de formação de colônia obtidos com MCBM depende do tipo de célula. Geralmente, para as células não-aderentes, o número de colônias é muito mais alto em comparação com células aderentes. Observamos que as células A549 formaram colônias de 30 a 40 após 10 dias. Anteriormente informamos para as células de leucemia diferente que o número de colônias é entre 200 a 2509. Nossos resultados mostraram que OT48 sozinho não produziu uma diminuição significativa do número de colônias sozinhos. No ent...

Câncer é causada por mutações celulares e consequentemente sinalização de caminhos bioquímicos são rompidos, provocando a divisão celular descontrolada e resistência à morte celular. Tumores interferem com as funções fisiológicas do aparelho digestivo, nervoso, circulatório e posteriormente vizinhas tecidos1. Apesar dos esforços de pesquisa extensiva, cancro continua a ser a doença fatal mais prevalente no mundo2. Medicina de precisão tem sido reconhecida como o fundamento da terapêutica do câncer futuro. Novas entidades moleculares são testadas rotineiramente em combinação com drogas existentes para melhorar os resultados clínicos.
No entanto, uma das significativas limitações associadas com o desenvolvimento de novas terapias alvo eficientes é o fracasso dos ensaios comumente usados para simular o resultado biológico exato da droga exposição3. Descoberta de drogas câncer ainda principalmente se baseia em testar a eficácia de agentes terapêuticos em células cancerosas no culto em culturas 2D monocamada, que são difíceis de validar em ensaios clínicos4. Portanto, há um interesse crescente para desenvolver modelos de câncer melhor que melhor imitam as características nativas de tumores em vivo5. Nos últimos anos, um crescente interesse em modelos 3D cultura resultou no desenvolvimento de metodologias melhoradas para produzir tumor 3D modelos5.
Aqui, apresentamos uma abordagem com três técnicas de cultura celular 3D diferentes permitindo melhorar o entendimento da potência da Hidroxicumarina OT486 em combinação com BH3 mimetics anterior mais em profundidade no vivo ensaios. Nosso método consiste em combinar colônia e SFAs com um in vivo tumor formação teste baseado em um modelo de zebrafish de validar a eficácia da combinação de OT48 e BH3 mimetics em células de câncer de pulmão e monitorar a progressão do câncer na vida organismo.
Ensaios de formação de colônia são rotineiramente usados para avaliar a eficácia de agentes anticancerígenos para cânceres sólidos tanto hematopoiéticas. O ensaio determina a capacidade de uma célula para proliferar indefinidamente e formam colônias7. O efeito de um agente anticâncer sobre a capacidade das células formadoras é determinado pela diminuição do número e/ou tamanho das colônias.
Esferoides representam modelos de tumor em vitro e servem como uma plataforma de triagem de baixo custo para agentes anticancerígenos. Esferoides são agregados de células crescendo em suspensão ou incorporado em uma matriz 3D. Esta abordagem é amplamente utilizada para triagem de drogas e estudos de tumor crescimento, proliferação e imune interação8.
Para compreender as propriedades de um novo fármaco, é essencial para realizar experimentos na vivo em roedores. No entanto, esse método convencional é caro e demorado. Nos últimos anos, o peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se um organismo de laboratório amplamente estudados que é mais barato e mais rápido para levantar. Tumores desenvolvem na abordagem de cultura de células no zebrafish representam um 3D, mas dentro do ambiente na vivo de um vertebrado9.
No total, aqui usamos três abordagens diferentes cultura 3D, incluindo APC, SFAs e zebrafish na vivo formação de tumor para demonstrar a capacidade anticancerígena de Hidroxicumarina OT48 em um modelo de célula do pulmão câncer A549 em combinação com mimetics BH3.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiais necessários para ensaios de formação de colônias</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Balão de cultura de células T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solução</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>tubo de 1,5ml</td><td>Tubo Extragene-170-C</td><td>RT</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 15 ml</td> Placa de 12 poços <td>Hyundai Micro</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 bem</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>MethoCult</td><td>StemCell technologies</td><td>4230-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Brometo de Tetrazólio Azul de Tiazolil (pó MTT)</td> <td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>Materiais necessários para o ensaio de formação de esferoides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Balão de cultura celular T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solução</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>Placa de 96 poços Corning costar ultra low attachemnt</td><td></td><td>Microscopia Corning</td><td>3474</td> RT</tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>Materiais necessários para xenoenxertos de peixe-zebra</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Lonza</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Balão de cultura de células T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>Balão de cultura de células T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>Balão de cultura de células T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td>RT</td></tr><tr><td>Tubo de 1,5 ml</td><td>Tubo Extragene</td><td>Tube-170-C</td><td>RT</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>SPL</td><td>30024</td><td>RT</td></tr><tr><td>Petrídico</td><td>SPL</td><td>10100</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS solução</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>Nitrato de cálcio tetrahidratado (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>Solução HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato (Tricaine)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>Solução de Fenol Vermelho</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-fenil-2-tioureia (PTU)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td>RT</td></tr><tr><td>CM-Dil corante</td><td>Invitrogen</td><td>C7001-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>Capilar de vidro</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micropipeta extrator</td><td>Instrumento de obturador, EUA</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro injetor</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>KOVAX</td><td>1ml</td><td>RT</td></tr><tr><td>Micro carregador</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>Lâmina de vidro</td><td>Marienfeld</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>Microscopia de fluorescência</td><td>Leica</td><td>DE / DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

avaliação pré-clínica da bioatividade da ot48 de cumarina anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e xenografts zebrafish

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

Rastreio pré-clínico in vitro e em vivo de novos agentes terapêuticos são uma ferramenta essencial na descoberta da droga de cancro. Apesar de linhas de células cancerosas humanas respondem aos compostos terapêuticos em culturas de células 2D monocamada (dimensional), sistemas de cultura 3D foram desenvolvidos para compreender a eficácia de drogas em modelos mais fisiologicamente relevantes. Nos últimos anos, observou-se uma mudança de paradigma na pesquisa pré-clínica para validar a potência de novas moléculas nos sistemas de cultura 3D, mais precisamente, imitando o microambiente do tumor. Estes sistemas caracterizam o estado de doença de uma forma mais fisiologicamente relevante e ajudam a obter melhor visão mecanicista e compreensão da potência farmacológica de uma determinada molécula. Além disso, com a tendência atual na melhoria na vivo modelos de câncer, o zebrafish tem emergido como um importante modelo de vertebrados para avaliar a formação de tumor na vivo e estudar o efeito de agentes terapêuticos. Aqui, nós investigamos o efeito terapêutico de Hidroxicumarina OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimetics em linhagem de células de câncer de pulmão A549 usando três sistemas diferentes de cultura 3D, incluindo ensaios de formação de Colônia (CFA), ensaio de formação de esferoide (SFA) e na vivo xenografts zebrafish.

Na Figura 2, câncer de pulmão de células linha A549 foi semeada em MCBM que formam colônias após o tratamento com OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimética A1210477 nas concentrações indicadas. Os resultados mostraram que a combinação significativamente reduzido número, tamanho e área de superfície total das colônias após 10 dias de incubação.
Na Figura 3, A549 cél...

Aqui, apresentamos o rastreio pré-clínico de cumarinas anticâncer usando zebrafish e cultura 3D.

Avaliação pré-clínica da Bioatividade da OT48 de cumarina Anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e Xenografts Zebrafish

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da descoberta de medicamentos para identificar o efeito anticancerígeno e obter uma melhor visão mecanicista de novas moléculas usando sistemas de cultura 3D in vitro e in vivo. A principal vantagem desta técnica são as variedades de efeito farmacológico dos compostos em um modelo in vivo mais fisiologicamente relevante. Para começar, coloque 20.000 células A549 por centímetro quadrado em 15 mililitros de meio de cultura de células RPMI 1640, suplementado com 10% de FBS e 1% de antibióticos, em um frasco de 75 centímetros quadrados.Incubar a cultura a 37 graus Celsius e 5% de CO2. No dia do experimento, use um hemocitômetro para determinar a concentração celular. Colete 50.000 células em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro por centrifugação a 400g por sete minutos e ressuspenda as células em 100 microlitros de PBS 1x estéril.Usando uma pipeta múltipla, dispense 1,1 mililitros de meio semissólido à base de metilcelulose, ou MCBM, em tubos, preparando um tubo para cada condição. Em seguida, adicione 110 microlitros de FBS a cada tubo. Em seguida, economize 1000 células por mililitro.Em seguida, pipete 2,4 microlitros da solução de célula estoque nos tubos de MCBM e FBS. Depois de adicionar as células, segure os tubos verticalmente e os vortex na velocidade mais alta por um minuto para misturar completamente o MCBM e as células. Agora, adicione o composto de teste OT48 sozinho ou em combinação com A1210477 às amostras.Prepare um tubo separado como controle para o solvente usado, como DMSO. Em seguida, vortex as amostras por um minuto. Para cada ensaio, pipete um mililitro da mistura no poço central de uma placa de cultura de células de 12 poços.Em seguida, use um mililitro de água estéril ou PBS para encher os poços vazios. Incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 10 dias. Em seguida, adicione 200 microlitros de uma solução estoque de MTT de cinco miligramas por mililitro a cada poço.Depois de incubar as placas por dez minutos, verifique se há colônias viáveis que ficarão violetas. Usando uma placa de fundo branco, capture imagens usando as seguintes configurações:Para método, escolha digitalizar. Para o tipo de exposição, escolha precisão.Para o tempo de exposição, escolha manual e um segundo. Para sensibilidade e resolução, escolha alta resolução. Em seguida, salve as imagens capturadas no formato TIFF.Com o software ImageJ, quantifique as colônias viáveis selecionando o menu imagem, tipo, 8 bits. Selecione o ajuste e o limite do menu. Defina o limite para controlar e mantê-lo constante para todas as condições.Em seguida, selecione o menu analisar, analisar partículas. Salve os dados e analise-os com um software estatístico para representação gráfica. Depois de preparar os reagentes de estoque de acordo com o protocolo de texto, separe uma fêmea e um macho em um tanque divisório cheio de água da torneira esterilizada e filtrada por UV a 28,5 graus Celsius e coloque-os no escuro.Após 24 horas de separação, remova a partição para iniciar o acasalamento. Transfira os ovos fertilizados do tanque de acasalamento para uma placa de Petri contendo cinco mililitros de solução fresca de Danios. Use cinco mililitros de solução de Danios para lavar os ovos três vezes usando uma pipeta para aspirar cuidadosamente os ovos e transferi-los para cinco mililitros de solução fresca.Em seguida, incube os ovos a 28,5 graus Celsius por oito horas. Mude para a solução Danios contendo 0,03% PTU para inibir a pigmentação e separar os ovos opacos não fertilizados para evitar contaminação. 24 horas após a fertilização, use uma pinça afiada para descorionar os embriões.Em seguida, incube os embriões em solução de Danios com PTU até 48 horas após a fertilização. Após semear as células A549 e incubá-las com compostos de acordo com o protocolo de texto, 24 horas antes do final do tratamento, adicione quatro micromolares do corante rastreador de células fluorescentes, CM-Dil, para corar as células e incubá-las por duas horas. Após a incubação, use 0,05% de tripsina-EDTA para tripsinizar as células.Em seguida, dilua dez até a sexta células em 50 microlitros de solução PBS de vermelho de fenol antes da injeção. Para realizar a microinjeção de células cancerígenas, puxe um capilar de vidro de 1,0 milímetro usando as seguintes configurações do programa:Use uma seringa para cortar o capilar para produzir uma borda afiada. Em seguida, carregue o microcapilar com 20 microlitros da solução de vermelho de fenol celular.Depois de anestesiar o peixe-zebra de acordo com o protocolo de texto, injete de 100 a 200 células no saco vitelino injetando de seis a dez nanolitros por meio de três a cinco injeções. As microinjeções devem ser feitas com muito cuidado e precisão para garantir que o volume correto das células seja injetado e a lesão por injeção seja mínima e a pressão de dióxido de carbono seja ideal para evitar uma fissura lateral. Após a injeção, deixe o peixe se recuperar por dez a 30 minutos em cinco mililitros de solução fresca de Danios contendo PTU.Transfira o peixe para placas de 24 poços com um mililitro de solução Danios PTU e incube-os a 28,5 graus Celsius por 72 horas. Após a incubação, após anestesiar os peixes de acordo com o protocolo de texto, imobilizá-los em uma lâmina de vidro com uma gota de 3% de metilcelulose. Tire imagens fluorescentes 5x em um comprimento de onda de 620 a 750 nanômetros.Use o software ImageJ para quantificar o tamanho dos tumores de fluorescência selecionando analisar e medir. Em seguida, salve os valores de fluorescência e analise-os com um software de estatística para representação gráfica. Neste experimento, a linhagem celular de câncer de pulmão A549 foi semeada em MCBM para formar colônias após o tratamento com OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimético, A1210477, na concentração vista aqui.Os resultados mostraram que a combinação reduziu significativamente o número, tamanho e área de superfície total das colônias após dez dias de incubação. Aqui, após o tratamento com OT48 sozinho ou em combinação com BH3 mimético, A1210477, as células foram autorizadas a formar esferóides usando a técnica da placa de fundo em U. Após uma incubação de três dias, os esferóides foram fotografados e quantificados, e imagens 3D foram geradas.Esta figura ilustra o potencial inibitório de OT48 e/ou A1210477 na formação de tumores a partir da quantificação de tumores fluorescentes gerados quando as células tratadas foram injetadas no saco vitelino de peixe-zebra. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter o número de peixes para cada condição em torno de dez ou mais para evitar as variações importantes que afetam a avaliação estatística dos dados. Após este procedimento, outros métodos, como a análise histológica, podem ser realizados para avaliar a expressão da proteína-alvo no xenoenxerto de peixe-zebra.Essa técnica abre caminho para que pesquisadores no campo da descoberta de medicamentos explorem a eficácia de compostos em um microambiente in vivo em xenoenxerto de peixe-zebra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como validar a eficácia do medicamento em um ambiente de cultura 3D.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

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Xenoenxerto derivado de paciente de peixe-zebra (zPDX): um modelo de câncer

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Ensaio de formação de colônias: avaliando a eficácia de agentes anticancerígenos em células de câncer de pulmão formadoras de colônias

Este vídeo descreve o ensaio de xenoenxerto de peixe-zebra para avaliar a formação de tumores in vivo e estudar o efeito de agentes terapêuticos.

Ensaio de Xenoenxerto de Peixe-Zebra: Um Método para Avaliar a Eficácia Anticancerígena da Terapêutica na Tumorigenicidade em Peixe-Zebra In Vivo

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Transgênese baseada em vetor miniCoopR: uma técnica para rastrear genes indutores de melanoma em modelo de tumor de peixe-zebra

Uma forma rápida de tela para modificadores de melanoma, utilizando um modelo de tumor zebrafish autóctone é apresentado. Leva vantagem de o vector miniCoopR que permite a expressão de genes candidatos de melanoma nos melanócitos. Um método para obtenção das curvas de sobrevida livre de melanoma, um ensaio de invasão, um protocolo para a coloração de anticorpos de melanócitos de escala e um ensaio de transplante de melanoma são descritos.

Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone

Este método utiliza embriões de peixe-zebra para testar de forma eficiente a capacidade invasiva de células de cancro vascular. células cancerosas fluorescentes são injectados para dentro do seio precardiac ou saco vitelino de embriões em desenvolvimento. invasão vascular e celular do cancro do extravasamento é avaliada através de microscopia de fluorescência da região da cauda de 24 a 96 horas mais tarde.

Teste da capacidade Vascular invasiva das células cancerosas no peixe-zebra (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Modelos de xenoenxerto de zebrafish permitem a triagem de medicamentos de alto risco e imagens fluorescentes de células cancerígenas humanas em um microambiente in vivo. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para a triagem de medicamentos automatizados em larga escala em amostras de leucemia derivada do paciente em zebrafish usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência automatizada.

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Aqui, fornecemos um protocolo passo-a-passo, com dicas para gerar xenoenxertos e diretrizes para análise de comportamento tumoral, imunofluorescência de montagem total e quantificação de imagens confocal.

Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

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Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade

O presente protocolo descreve a geração de modelos de cultura tumoral 3D a partir de células cancerosas primárias e a avaliação de sua sensibilidade a drogas por meio de ensaios de viabilidade celular e exames microscópicos.

Estabelecendo esferoides tridimensionais de amostras tumorais derivadas de pacientes e avaliando sua sensibilidade a drogas

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Triagem de pequenas moléculas e testes de toxicidade em larvas de peixe-zebra em estágio inicial

Aprenda a avaliar a bioatividade anticâncer da cumarina OT48 usando esferoides, ensaios de formação de colônia e xenotransplantes em Danio rerio. Este método combina cultura 3D e modelos in vivo para descoberta de fármacos.

Avaliação pré-clínica da Bioatividade da OT48 de cumarina Anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e Xenografts Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal

Avaliação pré-clínica da Bioatividade da OT48 de cumarina Anticancer esferoides, ensaios de formação de colônia e Xenografts Zebrafish

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