Um pequeno modelo Animal de perfusão de fígado normotérmica Ex Vivo

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do transplante e preservação de órgãos. As aplicações deste método incluem o teste de novos perfusato e aditivos de perfusato, teste de software projetado para avaliação de órgãos e realização de experimentos projetados para reparar órgãos. A principal vantagem dessa técnica é que o modelo normotérmico de perfusão hepática ex vivo aqui apresentado é simples, facilmente replicável, de baixo custo e tem uma ampla gama de aplicações.

Comece preparando o manguito portal de calibre 16. Corte uma seção de cinco milímetros de tubulação e determine o ponto médio da seção medindo 2,5 milímetros. Incisar no ponto médio e remover a metade anterior do tubo.

Use um hemostático para esmagar essa parte agora plana. Use um isqueiro para derreter a outra extremidade do angiocateter para criar um lábio. Em seguida, prepare a cânula do ducto biliar cortando a porta de injeção de um angiocateter de calibre 27, deixando apenas o cateter.

Conecte-o a uma seção de 10 centímetros de tubo de cânula de calibre 27. Posicione um rato anestesiado com o nariz no cone do nariz de anestesia e as quatro extremidades imobilizadas. Monitore os sinais vitais conectando o monitor à extremidade traseira esquerda.

Faça uma pinça do dedo do pé para confirmar a profundidade apropriada da anestesia. Pulverize o abdômen do animal com álcool isopropílico a 70% e deixe secar. Coloque uma cortina estéril sobre o animal.

Então, depois de fazer uma incisão na linha média do xifóide ao púbis usando uma tesoura afiada, entre suavemente no peritônio e faça uma incisão no músculo. Estenda a incisão lateralmente para a esquerda e para a direita para formar uma cruz ao nível da borda inferior do fígado. Neste ponto, diminua a anestesia com isoflurano para 2% Retraia o processo xifóide usando uma pinça de mosquito curva e as costelas usando afastadores de costela.

Em seguida, use uma tesoura afiada para cortar os ligamentos falciforme, frênico e gastro-hepático. Localize e amarre a veia frênica com uma sutura 7-0 o mais próximo possível de sua origem para evitar vazamentos. Em seguida, use um aplicador de ponta de algodão umedecido estéril para eviscerar o rato.

Envolva o intestino em gaze umedecida com solução salina normal a 0,9%, tomando cuidado para não esticar a vasculatura. Em seguida, disseque sobre a veia cava inferior para remover o excesso de tecido. Dissecar atrás da VCI logo acima da bifurcação e passar uma alça de uma sutura de seda 4-O para uso posterior.

Em seguida, retraia o rim direito para fornecer exposição à veia adrenal direita e retraia o lobo direito do fígado superiormente com gaze. Amarre a veia adrenal direita com uma sutura de seda 7-0 o mais próximo possível da VCI e cauterize sobre ela distal à gravata. Em seguida, disseque cuidadosamente a veia esplênica.

Amarre com dois pontos de seda 7-0 e corte-o entre as duas suturas. Depois de dissecar ao redor da artéria gastroduodenal, amarre a artéria gastroduodenal com uma sutura de seda 7-0 e ligue. Em seguida, disseque ao redor da artéria hepática e coloque frouxamente uma gravata de sutura de seda 7-0 ao redor dela.

Em seguida, disseque o ducto biliar. Em seguida, verifique o comprimento do ducto biliar, amarre-o na extremidade distal e coloque um laço de sutura ao redor do ducto biliar e proximalmente possível. Use uma tesoura pequena para cortar um orifício com metade do diâmetro do ducto e coloque um cateter de calibre 27 no ducto biliar proximalmente.

Amarre o cateter no lugar usando uma sutura de gravata de sandália romana. Em seguida, use uma agulha de calibre 27 para injetar 0,5 mililitros de heparina na veia peniana, ou VCI. Em seguida, prenda e amarre a VCI usando a sutura de seda 4-0 previamente colocada e amarre a artéria hepática usando a sutura de seda 7-0 colocada anteriormente.

Agora, use um clipe microcirúrgico para prender a veia porta. Canule a veia porta usando um angiocateter de calibre 22 e lave com 60 mililitros de solução salina normal a 0,9% fria contendo 100 unidades de heparina até o fígado clarear. Depois de lavar o fígado, exponha a VCI supra-hepática e corte-a o mais alto possível no peito.

Realize a hepatectomia cortando ao redor do diafragma e, em seguida, cortando a artéria hepática, a VCI, a veia porta e quaisquer ligamentos adicionais. Retire o fígado e coloque uma solução salina normal a 0,9% gelada. Por fim, coloque o manguito vascular de calibre 16 na veia porta e conecte o fígado ao circuito de perfusão hepática normotérmica ex vivo.

Antes de iniciar cada perfusão, a inspeção visual do circuito deve ser realizada para identificar e danificar ou acumular nos componentes do circuito ou na tubulação. Se houver acúmulo de bactérias ou outras substâncias no circuito, as peças devem ser substituídas ou limpas. Comece fluindo o perfusato a dois mililitros por minuto.

Observe o monitor quanto a picos na pressão da veia porta, pois isso pode indicar que o vaso ficou ocluído e exigir o reposicionamento da cânula. Insira a cânula da veia protal na veia porta com balonete para o fluxo de retorno do perfusato e suture usando uma sutura de seda 7-0. Uma vez que ambas as cânulas estejam no lugar, comece a aumentar o fluxo do perfusato em um mililitro por minuto até que a pressão fisiológica na faixa de 10 a 16 centímetros de água seja atingida.

Remova amostras de um mililitro do pré-porto e pós-porto durante a perfusão. Divida cada amostra de um mililitro em duas amostras de 0,5 mililitro. Congele uma das alíquotas de 0,5 mililitro em tubos criogênicos em nitrogênio líquido e execute uma análise de gases no sangue arterial usando os 0,5 mililitros restantes de perfusato.

Em seguida, meça o pH e tampone o perfusato conforme necessário para retornar ao pH 7,4. Após quatro horas de perfusão, desconecte o fígado do circuito de perfusão. Divida o fígado em segmentos de 0,5 grama, transfira para tubos criogênicos e congele em nitrogênio líquido.

A ALT foi medida em zero, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 e 240 minutos de perfusão. Há significativamente menos ALT no grupo perfusato de base mais PEG-CAT em comparação com o perfusato de base, que é mostrado em preto em 150, 180, 210 e 240 minutos. O ATP tecidual foi mantido no grupo perfusato de base mais PEG-CAT em comparação com o grupo de perfusato de base isolado.

A produção de MDA tecidual foi significativamente maior no grupo perfusato base do que no grupo perfusato base mais PEG-CAT. O GSH total foi mantido no perfusato de base mais PEG-CAT em comparação com o grupo de perfusato de base isolado. Cada aplicação proposta de perfusão hepática ex vivo normotérmica precisará ser metodicamente testada em modelos animais antes de ser testada em órgãos humanos descartados e depois em fígados humanos.

O modelo aqui apresentado é ideal, pois é facilmente replicável, elimina testes estranhos e é de baixo custo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como executar um modelo de perfusão hepática ex vivo normotérmica barata e facilmente replicável usando ratos.