Colheita de toxinas de veneno de barbeiros e outros insetos Heteropteran

Embora muitos insetos da subordem Heteroptera (Insecta: Hemiptera) são venenosa, sua composição de veneno e as funções das suas toxinas de veneno em sua maioria são desconhecidas. Este protocolo descreve métodos para colher heteropteran venenos para mais de caracterização, utilizando a eletroestimulação, assédio e dissecação da glândula.

Os insetos assassinos são um grupo de insetos que usam veneno para paralisar e pré-digerir suas presas. No entanto, apesar dos venenos de animais serem de interesse como novos medicamentos, inseticidas e ferramentas científicas, as toxinas que eles produzem são quase totalmente descaracterizadas. Uma razão para isso é que os insetos assassinos são menos conhecidos em comparação com artrópodes venenosos icônicos, como aranhas e escorpiões.

Outra razão é que, até recentemente, poucas informações estavam disponíveis sobre como colher suas toxinas. Neste vídeo, apresentaremos métodos que permitirão aos pesquisadores colher com sucesso toxinas de veneno de insetos assassinos e também de insetos relacionados, como insetos aquáticos gigantes que matam peixes. O protocolo um descreve como colher veneno por eletroestimulação.

Primeiro, colete insetos adequados. Adultos e ninfas grandes são os mais fáceis de trabalhar. Usar insetos dois a sete dias após a alimentação é ideal, para garantir que os insetos tenham acumulado estoques de veneno, mas não morram de fome.

Prepare um par de pinças com eletrodos nas pontas e conecte-as a uma fonte de eletricidade. Idealmente, esse suprimento deve ser um eletroestimulador capaz de fornecer pulsos de cinco milissegundos a cinco Hertz. Use tensões de pico entre 15 e 25 volts para insetos pequenos ou grandes, respectivamente.

Se um eletroestimulador não estiver disponível, use tensões constantes de cinco a 12 volts. Contenha o inseto usando elásticos e uma plataforma de espuma. Coloque a tromba do inseto em um tubo coletor.

Um tubo de pipeta P200 é ideal para a maioria dos insetos assassinos. Opcionalmente, uma pequena quantidade de água pode ser adicionada à ponta antes da colheita, para garantir a máxima recuperação do veneno. Aplique gel condutor nos eletrodos, ligue a fonte de alimentação e aplique a pinça eletrificada no inseto.

Experimente uma variedade de pontos de contato enquanto monitora a expulsão de veneno da tromba. Armazene o veneno em temperaturas congelantes para evitar a digestão autoproteolítica. Repita a eletroestimulação com um novo tubo de pipeta até que não haja mais veneno

O protocolo dois descreve como colher veneno provocando uma reação defensiva. Prepare e contenha um bug conforme descrito acima, inserindo a tromba em uma ponta de coleta. Assedie suavemente o inseto para provocar uma reação defensiva, sem ferir o animal.

Às vezes, simplesmente conter o animal ou inserir a tromba no tubo de coleta pode provocar uma reação defensiva acompanhada de expulsão de veneno da tromba. Caso contrário, toque suavemente o animal no tórax, pernas, abdômen e, especialmente, nas antenas, para provocar veneno. No protocolo três, na forma escrita deste artigo, também descrevemos como colher veneno de espécies que cospem veneno defensivamente.

O protocolo quatro descreve como colher veneno diretamente das glândulas de veneno por dissecação. Anestesiar os animais por exposição ao dióxido de carbono por 10 minutos. Insira três pinos na parte posterior do abdômen para segurar o inseto sem perfurar as glândulas de veneno.

Corte uma pequena incisão na linha média na superfície ventral do abdômen usando um bisturi em miniatura. Use uma tesoura em miniatura para estender a linha média na direção anterior à cabeça, tomando cuidado para cortar apenas o exoesqueleto e não danificar as estruturas internas. Para expor as estruturas internas, faça vários cortes laterais que se estendem da incisão da linha média até o lado do inseto.

O exoesqueleto ventral entre cada dois cortes pode então ser fixado para trás para revelar as estruturas internas. Inunde a bandeja de dissecção usando uma solução salina até que o inseto esteja submerso, permitindo que as estruturas internas flutuem e sejam mais facilmente visualizadas. As glândulas de veneno aparecerão como estruturas alongadas translúcidas que se estendem em cada lado do canal alimentar.

Usando uma pinça e microtesoura, remova cuidadosamente o tecido conjuntivo e nervoso e a traqueia, tentando não romper o canal alimentar ou as glândulas de veneno. A glândula principal é reconhecível devido à sua estrutura característica, com lobos anterior e posterior, e dois ductos que se encontram no hilo. Para insetos assassinos, e talvez outros heterópteros, quase todas as toxinas são armazenadas nos lúmens dos dois lobos da glândula principal.

Portanto, depois de liberar a glândula principal da traqueia e do tecido conjuntivo, os dois dutos que saem do hilo podem ser cortados e a glândula de veneno principal coletada. Se a glândula acessória também for desejada, geralmente é oposta ao intestino e pode ser identificada de forma inequívoca traçando os ductos do hilo. Em qualquer caso, tome cuidado para não quebrar as glândulas prematuramente e perder o veneno para a solução salina circundante.

Se os lobos da glândula principal forem separados, faça-o rapidamente após a remoção da solução salina e proceda imediatamente à colheita do conteúdo dos lúmens da glândula, conforme descrito nas etapas 4.6 e 4.7 do manuscrito escrito. Os resultados variam dependendo do subprotocolo exato e da espécie de inseto usada. O primeiro e o segundo subprotocolos apresentados neste vídeo mostraram como colher toxinas do veneno por eletroestimulação e assédio, respectivamente.

Ambos os métodos normalmente produzem um líquido concentrado contendo aproximadamente 50 a 250 miligramas por mil de proteína e mais de 100 componentes à base de proteínas, incluindo enzimas, toxinas formadoras de poros e peptídeos. A principal vantagem de ambos os protocolos é que eles são rápidos, não letais e o veneno não é contaminado pelo tecido glandular. A maior desvantagem da colheita por eletroestimulação ou assédio é que a fonte glandular do veneno obtido é desconhecida, e o teor de proteína do veneno colhido pode ser diferente, dependendo do protocolo.

Além disso, a eletroestimulação e o assédio não são eficazes para todas as espécies predadoras de heterópteros. No último subprotocolo, mostramos como dissecar as glândulas de veneno ingurgitadas para coletar toxinas diretamente. Essa técnica também produz um coquetel de diversas proteínas, embora, neste caso, as toxinas do veneno possam apresentar alguma contaminação com o tecido glandular.

No entanto, uma vantagem da coleta de toxinas de glândulas dissecadas é que o compartimento glandular de origem é conhecido exatamente. Em conclusão, encorajamos os pesquisadores a selecionar um método de colheita apropriado para sua questão de pesquisa. Por exemplo, investigações sobre a biologia do uso de veneno dentro de uma espécie se beneficiarão do emprego de várias técnicas de colheita.

Para estudos de bioprospecção, um único método de colheita de venenos de várias espécies pode ser mais econômico, dependendo do desenho experimental específico. Esperamos que este vídeo e o artigo escrito que o acompanha facilitem os pesquisadores a colher veneno de insetos assassinos e outros insetos heterópteros, o que é um pré-requisito para entender sua composição, bioatividade e evolução.