Análise metabólica do melanogaster da drosófila Larval e adulto cérebros

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o metabolismo cerebral da Drosophila e como a proliferação excessiva de células gliais afeta a reprogramação metabólica, se a dieta ou o comportamento alteram o metabolismo. A principal vantagem dessa técnica é que os cérebros das moscas podem ser analisados metabolicamente como um tecido intacto inteiro com resultados reprodutíveis obtidos medindo apenas um cérebro por vez. Embora esse método possa fornecer informações sobre o metabolismo do cérebro da mosca, ele também pode ser aplicado a outros tecidos e sistemas modelo, como discos imaginários e C.elegans, respectivamente.

Para preparar as restrições de microtecido, no recipiente de armazenamento, selecione uma restrição de microtecido por cérebro que está sendo medido, mais pelo menos três para uso como controles somente de contenção. Usando uma cesta de malha e uma placa de seis poços, enxágue as restrições com etanol a setenta por cento e lave-as com água desionizada três vezes, cada vez por dois minutos. Realize lavagens adicionais com água se as restrições ainda exalarem odor de álcool.

Lave as restrições de micro-tecido em meios de ensaio e deixe-as na solução até que estejam prontas para uso. Para dissecar o cérebro larval de Drosophila melanogaster, selecione as larvas do final do terceiro ínstar de um frasco de moscas do Órgão R cultivadas. Coloque a larva no poço de uma placa de dissecação limpa contendo 500 microlitros de 1x PBS.

Em seguida, lave a larva sacudindo-a suavemente no poço e transfira-a para outro poço limpo. Em seguida, coloque a placa pontual sob o microscópio de dissecação. Segure a larva em sua barriga com uma pinça enquanto segura os ganchos dos olhos com uma segunda pinça.

Puxe a larva com cuidado e suavidade em direções opostas usando os dois conjuntos de pinças. Visualize o cérebro que normalmente fica preso aos ganchos oculares e geralmente tem discos antenais oculares presos a ele. Usando os ganchos oculares para manter o cérebro no lugar, remova cuidadosamente os tecidos adicionais.

Por fim, separe os ganchos oculares do cérebro. Em seguida, use uma pinça para transferir o cérebro dissecado para um novo poço contendo 1x PBS. Para adicionar os cérebros dissecados a uma placa de ensaio metabólico de 96 poços, primeiro adicione 50 microlitros de meio de ensaio a todos os poços, incluindo os poços experimental, controle, somente restrição e de fundo.

Em seguida, coloque cuidadosamente um cérebro em cada poço. Sob o microscópio de dissecação, use uma microssonda de agulha dobrada para pressionar os cérebros no fundo do poço. Posicione suavemente os cérebros no meio das três esferas elevadas usando a sonda.

Para adicionar uma restrição de microtecido à placa de ensaio metabólico de 96 poços, primeiro coloque-a na borda. Sob um microscópio, oriente-o com o anel de plástico voltado para baixo e a malha na parte superior. Em seguida, remova a placa do microscópio.

Use a pinça para segurar a restrição em ambos os lados e solte-a suavemente no poço. Use uma microssonda de agulha dobrada para pressionar a restrição no poço. As restrições de microtecidos devem ser posicionadas adequadamente sobre o cérebro centrado em cada poço para que esta técnica forneça resultados significativos.

Sob o microscópio, verifique se o cérebro dissecado pode ser visto através da restrição do tecido e se está centralizado no poço e repita o procedimento para todos os poços que serão usados no ensaio. Adicione cuidadosamente 130 microlitros de meios de ensaio a cada um dos poços experimentais, de controle e somente de restrição. Verifique se os cérebros e as restrições de microtecidos não se moveram ao adicionar a mídia.

Em seguida, adicione 180 microlitros de meios de ensaio aos quatro poços de canto para uso como controle de fundo. Neste procedimento, remova a placa de utilidade e adicione a placa celular sem a tampa na mesma orientação do analisador metabólico. Selecione Carregar placa de célula "para que o instrumento pegue a placa de célula e feche a bandeja e, em seguida, inicie o ensaio.

Quando o ensaio estiver concluído, remova a placa celular e o cartucho ejetados. Usando um microscópio de dissecação, verifique se os cérebros e as restrições de microtecidos ainda estão posicionados corretamente no poço após a conclusão do ensaio e exclua quaisquer poços com anormalidades da análise. Quando as condições otimizadas são seguidas, os ensaios com os cérebros larvais e adultos resultam em leituras de OCR ligeiramente superiores a 150 picomoles por minuto no sexto ponto de tempo estabilizado, cerca de 25 minutos após o início do ensaio.

Essa taxa é mantida por pelo menos 30 minutos e até duas horas. O ECAR é ligeiramente menor em cérebros adultos do que em cérebros larvais no sexto ponto de tempo e é mantido por pelo menos 30 minutos. Esse achado corresponde a um aumento da glicólise durante os estágios larvais para apoiar o crescimento.

Uma injeção com um inibidor mitocondrial, como a oligomicina, reduz as leituras de OCR para revelar a respiração dependente de ATP e o tratamento adicional com rotenona e antimicina A reduz o OCR para revelar o consumo de oxigênio não mitocondrial. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de centralizar os cérebros e garantir que a restrição do microtecido esteja presa no lugar antes de executar o ensaio e durante a análise. Após este procedimento, outros métodos, como PCR quantitativo e análise de western blot, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como a expressão gênica contribui para o fenótipo metabólico observado.