Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto

Eletroporação é uma abordagem eficaz para entregar genes de interesse em células. Aplicando-se esta abordagem na vivo sobre os neurônios do gânglio de raiz dorsal do rato adulto (DRG), descrevemos um modelo para estudo de regeneração do axônio em vivo.

Este método fornece uma técnica de transfecção de genes in vivo para manipular a expressão gênica em neurônios sensoriais de camundongos adultos para estudos futuros de exo-regeneração de mamíferos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é menos trabalhosa e demorada, e pode superexpressar e derrubar os genes-alvo simultaneamente e separadamente. Para iniciar este procedimento, marque ambos os lados da crista ilíaca de um camundongo anestesiado com um marcador fino.

Desenhe uma linha conectando dois pontos da crista ilíaca para facilitar a identificação das posições dos DRGs L5. Em seguida, faça uma incisão de três centímetros ao longo da linha média da região lombar com uma microtesoura. Em seguida, descole os músculos paraespinhosos, como o músculo multífido e o músculo longíssimo lombar, dos processos espinhosos L3 a S1 e exponha a articulação da fáscia de L4-5 e L5-6.

Em seguida, use um micro rongeur para remover as articulações da fáscia do L4-5 e L5-6. Posteriormente, remova o arco neural esquerdo de L4 e L5, para expor o lado dorsal dos DRGs. Para injeção de DRG, carregue os plasmídeos de DNA ou oligos de RNA na pipeta capilar de vidro.

Em seguida, insira a ponta da pipeta de vidro capilar, cuidadosamente, no DRG e injete gradualmente uma solução de microlitro de plasmídeos de DNA ou oligos de RNA usando o sistema de distribuição de microinjeção intracelular. Para eletroporação, aperte o DRG alvo com os eletrodos suavemente e aplique cinco pulsos elétricos quadrados com o sistema de eletroporação. Posteriormente, feche o músculo e, em seguida, as camadas de pele com suturas de náilon.

Dois ou três dias após a eletroporação do DRG, anestesiar o camundongo por via intraperitoneal, prender seus membros na placa de cortiça e fazer uma incisão de um centímetro 0,5 centímetros para o lado esquerdo ao longo da linha média. Em seguida, corte os músculos, como o músculo glúteo máximo e o músculo piriforme, longitudinalmente. Em seguida, exponha o segmento do nervo ciático entre o forame ciático maior e a incisura ciática.

Esmague o nervo com uma pinça de microcirurgia por 12 segundos e marque o local do esmagamento com uma sutura epineural de náilon. Em seguida, feche as camadas muscular e cutânea com sutura de náilon. Após a profusão, separe os DRGs junto com as raízes nervosas e o nervo ciático, cuidadosamente, com microtesoura e microfórceps sob o microscópio de dissecção.

Em seguida, transfira o nervo ciático diretamente em 4% de PFA durante a noite a quatro graus Celsius. Para obter imagens e medir os axônios sensoriais marcados com fluorescência sob o microscópio de dissecação, retire cuidadosamente o tecido e a membrana anexados no nervo ciático fixo com microtesouras e micropinças. Em seguida, lave o nervo com PVS três vezes.

Em seguida, coloque o nervo ciático em uma lâmina e mantenha-o reto. Adicione 80 microlitros de solução anti-desbotamento ao redor do nervo e, em seguida, coloque uma lamínula sobre ele. Achate todo o tecido montado com pressão.

Em seguida, coloque o tecido achatado sob o microscópio de epifluorescência invertida, equipado com um acessório para aquisição de mosaico e processamento de imagens. Ao medir o comprimento dos axônios regenerados, rastreie todos os axônios marcados com fluorescência identificáveis no nervo ciático, desde o local do esmagamento até as extremidades distais dos axônios. Ao aplicar o método atual de eletroporação in vivo para estudar a regeneração axonal, o nervo ciático foi achatado e fotografado.

Cada axônio regenerado com trajetória distinta e extremidade do axônio distal reconhecível pode ser rastreado a partir do local de esmagamento indicado pelo nó de sutura. A ponta da seta branca, a seta e a estrela indicam três extremidades distintas do axônio, todas as quais se estendem do local do esmagamento. Além disso, os DRGs foram eletroporados com plasmídeos EGFP e a medula espinhal foi colhida.

Os axônios da coluna dorsal marcados com EGFP, na medula espinhal, foram fotografados e identificados nas imagens de projeção longitudinal e sagital. Aqui está uma visão detalhada dos axônios na coluna dorsal e aqui está uma visão detalhada dos axônios na zona de entrada da raiz dorsal. Esta imagem mostra a projeção sagital dos axônios marcados com EGFP dentro da coluna dorsal.

Alternativamente, as imagens confocais podem ser processadas com software de visualização de microscopia para reconstruir uma imagem 3D. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de posicionar os DRGs L4 e L5 corretamente e fazer um nó na membrana dural sem empalar o nervo ciático, enquanto rotula o local do esmagamento com um nó de sutura. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da regeneração de axônios explorarem genes necessários para PNS, regeneração natural de axônios ou genes que podem promover ainda mais a regeneração em camundongos adultos in vivo.