Name: Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprenda a realizar imagem in vivo de dois fótons no córtex cerebral de camundongos neonatais. Este método permite analisar mudanças morfológicas em neurônios vivos e estudar dinâmicas de desenvolvimento neural em tempo real.

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Os autores agradecer T. Sato, M. Kanbayashi e S. Kouyama para sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant números JP15K14322 e JP16H06143, a Takeda Science Foundation, Fundação Memorial Uehara e o Collaborative Research projeto de Niigata University cérebro Research Institute 2017-2923 (H.M) e KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 e JP15H04263 e Grant-em investigação científica nas áreas de inovação "Regulamento dinâmico da função cerebral por Scrap & Build System" (JP16H06459) do MEXT (T.I.).

Experimentos devem ser realizados de acordo com as normas de bem-estar animal prescritas pela instituição do experimentador.
1. preparação dos filhotes para a imagem latente
Nota: Filhotes com escassamente rotulados neurônios corticais podem ser obtidos por no utero eletroporação (IUE) de Supernova vetores5,6. O sistema de Supernova consiste dos seguintes dois vetores: TRE-Cre e CAG-loxP-STOP-loxP-Gene X-ires-tTA-WPRE. Neste sistema, rotulagem esparsas depende de escapamento do TRE. Em uma população dispersa de neurônios transfectadas, TRE dirige a fraca expressão da Cre e tTA. Posteriormente, apenas nestas células, a expressão do gene X é facilitada por um feedback positivo dos ciclos de tTA-TRE. O alcançado esparsas e brilhantes rotulagem permite a visualização de detalhes morfológicos de neurônios individuais em vivo. Detalhes do procedimento de IUE não são descritos no presente protocolo, desde que eles foram descritos em outro lugar7,8,9,10,11.
<ol><li>Prepare-se ratos grávidas cronometrado para IUE.</li>
	<li>Prepare uma solução de DNA para IUE. Para a rotulagem esparsas com RFP, use uma solução contendo pK031:TRE-Cre (5 ng / µ l) e pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µ g / µ l) ou uma solução contendo pK031:TRE-Cre (5 ng / µ l) e pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µ g / µ l). Nota: Várias proteínas podem ser expressos nos neurônios etiquetados usando diferentes combinações de vetores. Além disso, vários genes podem ser batido para baixo ou eliminado especificamente em pilhas etiquetadas5,6 (por exemplo, uma série de vetores para o sistema de Supernova estão disponíveis de RIKEN BioResource Research Center e de Addgene).</li>
	<li>Execute regular IUE7,8,9,10,11 para rotular os neurônios corticais. Para a rotulagem de neurônios da camada 4, use embriões embrionários do dia-14.</li>
	<li>Espere para o crescimento e a entrega do filhote.</li>
</ol>2. cirurgia
<ol><li>Anestesia o pós-Natal dia-5 (P5) filhote usando gás de isoflurano (1,0%). Execute um teste de cauda-pitada para verificar o nível de anestesia. Se o filhote responde para o aperto, aumentar a concentração de isoflurano (até 2,0%) ou esperar até que a resposta desaparece. Manter a temperatura do corpo do filhote durante a cirurgia, usando uma almofada de aquecimento.</li>
	<li>Por via subcutânea injete um analgésico (carprofeno, 5 mg/kg).</li>
	<li>Esterilize a pele do filhote cobrindo o crânio por limpá-lo com etanol a 70% três vezes.</li>
	<li>Remova aproximadamente 20 mm2 da pele cobrindo o crânio com uma tesoura esterilizada com 70% de etanol (figura 1A).</li>
	<li>Retire a fáscia do crânio usando Pinças esterilizadas e um cotonete de algodão limpas e esterilizadas (figura 1A).</li>
	<li>Aplique o adesivo de tecido usando dicas de carregamento à superfície da pele incisão para parar o sangramento. Não aplique adesivo de tecido para a área de imagem (figura 1B) porque isso dificulta a abertura do crânio.</li>
	<li>Coloque o filhote em uma bolsa de água quente (37 ° C) e deixe-o recuperar da anestesia. Espere até que o adesivo de tecido tem secado e solidificado (cerca de 30 min).</li>
	<li>Se necessário, aplique mais tecido adesivo e esperar que seque e solidificar.</li>
</ol>3. craniana janela preparação
<ol><li>Anestesiar o filhote usando isoflurano (1,0% - 2,0%) e verificar o nível de anestesia por um teste de cauda-pitada.</li>
	<li>Abra cuidadosamente o crânio com uma lâmina de barbear esterilizada, deixando a dura-máter intacta (1 mm de diâmetro) (Figura 1). Use uma esponja de gelatina (cortadas em pedaços pequenos, aproximadamente 2mm <3, usando a tesoura esterilizada e aplicá-las usando uma pinça) embebido no córtex reserva12 (125 mmol/L de NaCl, 5 mmol/L KCl, glicose 10 mmol/L, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl2 e 2 mmol/L de MgSO4; pH 7,4; 300 mOsm/L; temperatura ambiente) para parar o sangramento. Ao abrir o crânio, aplica um buffer de córtex para manter a superfície do cérebro húmido.</li>
	<li>Remova qualquer buffer e o sangue da superfície dural usando uma esponja gelatinosa. Aplica dicas uma fina camada de 1,0% de agarose de baixo ponto de fusão (dissolvido em tampão de córtex) usando amarelo. Usando uma máquina de bloco de calor, manter a temperatura da solução de agarose a 42° C até o aplicativo. Nota: A drenagem do buffer e o sangue deve ser realizada do lado da craniotomia enquanto cuida que a esponja de gelatina seca não entra em contacto com a dura-máter. A não observância pode causar danos a dura-máter.</li>
	<li>Aplique uma lamela de vidro redonda (n º 1, 3mm de diâmetro) na camada de gel de agarose. Remova todas as bolhas entre a lamínula e a camada de gel de agarose derramando o excesso de gel de agarose entre eles. Remova o excesso de gel salientes debaixo da lamela usando uma pinça (Figura 1 e 1E).</li>
	<li>Fixe a lamela usando cimento dental (Figura 1F).</li>
	<li>Misture o pó de cimento e o líquido do cimento. Aplique a mistura usando pontas amarelas antes que torna-se solidificado. Não aplique cimento dental sobre a dura-máter, porque isso pode danificar o cérebro.</li>
	<li>Anexar um estéril titânio bar (feito, cerca de 30 mg, ver Figura 1) no osso craniano usando cimento dental. Alinhe a barra de titânio e a lamela (na superfície da dura-máter) em paralelo para facilmente capturar imagens.</li>
	<li>Cobrir o crânio exposto com cimento dental (Figura 1 H).</li>
	<li>Recupere o filhote de anestesia. Mantê-lo em um aquecedor (37 ° C) até que o cimento dental tem solidificado (1h).</li>
</ol>4. dois fotões de imagem
Nota: As imagens na vivo na Figura 2 foram adquiridas usando um microscópio de dois fotões com um laser de titânio-safira (feixe de diâmetro [1/e2]2: 1,2 mm).
<ol><li>Defina o comprimento de onda do laser de dois fotões. Para a excitação de RFP, uso 1.000 nm (450 mW/mm2 a 400 µ m de profundidade). Nota: A potência do laser deve ser reduzida, como o z-posição move para cima.</li>
	<li>Limpe a superfície da lamela com etanol a 70%.</li>
	<li>Anestesiar o filhote usando isoflurano (1.5-2.0%) e verificar o nível de anestesia utilizando um teste de cauda-pitada.</li>
	<li>Anexe o filhote para a placa de titânio no palco de imagens usando uma barra de titânio na cabeça do pup (Figura 2A e 2B). Ajuste a cabeça de tal que a lamela é paralela da lente objetiva usando fase goniômetro (Figura 2B). Manter a temperatura corporal do filhote usando uma almofada de aquecimento (37 ° C).</li>
	<li>Defina a concentração de isoflurano para 0,7% - 1,0%. Nota: Uma concentração de isoflurano muito alta pode causar a morte acidental do filhote durante a imagem latente.</li>
	<li>Coloque o palco de imagens sob a lente objetiva (20 X, at 1.0), o microscópio de dois fotões (Figura 2B e 2C).</li>
	<li>Aplique uma gota de água no sentido da lamela. Use o epi-fluorescência para localizar os neurônios rotulado de proteína fluorescentes na área onde foi exposta a dura-máter.</li>
	<li>Adquira imagens de z-pilha em intervalos de 1,4 µm. Para a camada 4 neurônio de imagem, definir o z-width para 150-300 µm a imagem inteira morfologia dendrítica (Figura 2D e 2E). Uso lento digitalização e em média para obter imagens nítidas, mostrando a morfologia neuronal (geralmente leva > 20 min para adquirir a morfologia dendrítica inteira). Nota: Os parâmetros a seguir são recomendados para tratamento de imagens. Comprimento de onda de excitação: 1.000 nm, scanner: tipo galvanômetro, espelho dicroico: 690 nm, emissão filtro: 575-620 nm bandpass, detector: tipo GaAsP, ganho 100 > configuração, imagem tamanho > 512 x 512 µm, campo de visão > 600 x 600 µm, pixel resolução < 1.2 µm.</li>
</ol>5. recuperação e enfermagem
<ol><li>Desanexe o filhote desde a fase de imagem.</li>
	<li>Coloque o filhote em um aquecedor (37 ° C) e deixe-o recuperar (15 min).</li>
	<li>Alimente o filhote leite morno usando uma micropipeta em intervalos de 2-h e estimular suavemente o estômago para permitir a excreção. Confirme que o filhote está a beber leite, medindo o peso do seu corpo.</li>
</ol>6. re-imaging
<ol><li>Anestesiar o filhote com isoflurano (1.5-2.0%) e verificar o nível de anestesia utilizando um teste de cauda-pitada. Anexá-lo à fase de imagem.</li>
	<li>Localize os imagens anteriormente neurônios e adquirir uma imagem de z-pilha. A identificação de neurônios é fácil devido à sua rotulagem esparsas com Supernova.</li>
	<li>Repita as etapas de 5,1-6,2 até imagem é concluída. Nota: O filhote pode ser fotografado até 18 h sem perder peso. 
</li>
</ol>

<ol><li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li>
<li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).</li>
<li>Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+translocation+establishes+the+winner+in+cerebellar+climbing+fiber+synapse+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biology. , e272(2005).</li>
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<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+and+post-synaptic+neuronal+activity+supports+the+axon+development+of+callosal+projection+neurons+during+different+post-natal+periods+in+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex.</a> European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024(2011).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patchwork-Type+Spontaneous+Activity+in+Neonatal+Barrel+Cortex+Layer+4+Transmitted+via+Thalamocortical+Projections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections.</a> Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).</li>
<li>Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+double+markers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with double markers in mice.</a> Cell. 121 (3), 479-492 (2005).</li>
<li>Young, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+with+inducible+Cre-mediated+knockout+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Repeated+Exposure+to+Isoflurane+not+Sevoflurane+in+Mice+Reversibly+Impaired+Spatial+Cognition+at+Juvenile-Age%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age.</a> Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).</li>
<li>Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+hippocampus+without+cortical+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22eLIFE%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion.</a> eLIFE. 6, e26839(2017).</li>
<li>Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+dynamics+of+cortical+neuron+dendritic+trees+revealed+by+long-term+in+vivo+imaging+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates.</a> Nature Communications. 9 (1), 3106(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Passos críticos no protocolo e solução de problemas:
O passo mais importante do protocolo é a remoção do crânio (passo 3.2 do protocolo). Mediante a inserção, a lâmina de barbear frequentemente adere a dura-máter, causando sangramento dural e danos ao cérebro. Isto pode ser evitado adicionando uma gota de buffer de córtex no crânio e removendo o crânio no buffer do córtex.
Sangramento da dura e a pele após preparação janela cranial leva a oclusão da janela. Para evitar...

A fiação precisa de circuitos neuronais no córtex cerebral é essencial para funções superiores do cérebro incluindo a percepção, cognição e aprendizagem e memória. Circuitos corticais são dinamicamente refinados durante o desenvolvimento pós-natal. Estudos têm investigado o processo de formação de circuito cortical usando histológico e em vitro análises de cultura. No entanto, a dinâmica da formação do circuito em mamíferos viventes manteve-se na maior parte inexplorada.
Microscopia de dois fotões tem sido amplamente utilizada para as análises em vivo dos circuitos neuronais no cérebro do rato adulto1,2. No entanto, devido a desafios técnicos, somente um número limitado de estudos abordaram a formação do circuito neuronal em ratos recém-nascidos. Por exemplo, Carrillo et al realizaram a lapso de tempo imagem de fibras no cerebelo na segunda semana pós-parto3de escalada. Porteira-Cailliau et al relataram a imagem dos axônios na camada cortical 1 na primeira semana pós-natal4. No presente estudo, resumimos um protocolo para a observação de neurônios corticais de camada 4 e suas dendrites em camundongos recém-nascidos. Os resultados obtidos através da aplicação do presente protocolo, que inclui duas metodologias, são relatados em nossa recente publicação5. Primeiro, usamos a Supernova vetor sistema5,6 para rotular os neurônios individuais no cérebro neonatal. No sistema de Supernova, as proteínas fluorescentes usadas para rotular neuronal são knockdown exchangeable e etiquetados célula específica do gene e edição/nocaute análises também são possíveis. Em segundo lugar, descrevemos um procedimento cirúrgico para a preparação de janela cranial em camundongos neonatais frágil. Juntas, essas metodologias permitem a observação na vivo de neurônios individuais no cérebro neonatal.

<table><tbody><tr><td>pK031. Autores TRE-Cre</td><td></td> <td>-</td> <td>Disponível em RIKEN BRC e Addgene</td></tr><tr><td>pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE</td><td></td> <td>Autores-Disponível</td> <td>em RIKEN BRC e Addgene</td></tr><tr><td>pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE</td><td></td> <td>Autores-Disponível</td> <td>dos autores</td>:</tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Wako</td><td>099-06571</td><td></td></tr><tr><td>410 Unidade de Anestesia (máquina de gás isoflurano)</td><td>Univentor</td><td>8323101</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (adesivo tecidual)</td><td>3M</td><td>084-1469SB</td><td></td></tr><tr><td>M&micro; ltiFlex Round (ponta de carregamento)</td><td>Sorenson</td><td>13810</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam (esponja de gelatina)</td><td>Pfizer</td><td>09-0353-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9793</td><td>Baixo ponto de fusão</td></tr><tr><td>Lamínula em forma redonda</td><td>Matsunami-Custom</td><td></td> <td>made</td></tr><tr><td>Unifast 2 (cimento dentário)</td><td>GC-Barra</td> <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>titânio</td><td></td> <td>Autores-Custom</td><td> feito (ver Figura 1G)</td></tr><tr><td>Rimadyl (carprofeno)</td><td>Zoetis-Microscópio</td><td></td> <td>injetável</td></tr><tr><td>de 2 fótons</td><td>Zeiss</td><td>LSM7MP</td><td></td></tr><tr><td>Laser de titânio-safira</td><td>Spertra-Physics</td><td>Mai-Tai eHPDS</td><td></td></tr><tr><td>Placa de titânio</td><td></td> <td>Autores-Custom</td> <td>made (ver Figura 2A)</td></tr><tr><td>IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro</td><td>BITPLANE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estágio do goniômetro</td><td>Thorlabs</td><td>GN2/M</td><td></td></tr></tbody></table>

na vivo imagem de dois fotões de neurônios cortical em camundongos neonatais

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Imagem de dois fotões é uma poderosa ferramenta de análise de circuitos neuronais do cérebro de mamíferos na vivo . No entanto, um número limitado de no vivo de imagem métodos existe para examinar o tecido do cérebro de mamíferos recém-nascidos ao vivo. Aqui resumimos um protocolo para imagens individuais neurônios corticais em camundongos neonatais vivos. Este protocolo inclui as seguintes duas metodologias: (1) o sistema de Supernova para esparsas e brilhantes rotulagem dos neurônios corticais no cérebro em desenvolvimento e (2) um procedimento cirúrgico para o crânio neonatal frágil. Este protocolo permite a observação de mudanças temporais de neuritos corticais individuais durante estágios neonatais com uma alta relação sinal-ruído. Silenciamento de genes de células específicas rotuladas e nocaute também podem ser alcançados pela combinação da Supernova com interferência do RNA e gene CRISPR/Cas9 sistemas de edição. Este protocolo pode, assim, ser utilizado para analisar a dinâmica do desenvolvimento dos neurônios corticais, mecanismos moleculares que controlam a dinâmica neuronal e mudanças na dinâmica neuronal em modelos de doenças.

Figuras 2D - 2F mostrar resultados representativos da imagem latente de lapso de tempo de dois fotões de neurônios corticais de camada 4 usando o presente protocolo. Para efeitos de análise, selecione os neurônios com morfologia dendrítica claro durante os períodos de imagem. Analisamos a morfologia dendrítica de neurônios imagens usando software de análise morfológica. Reconstrução de morfologia dendrítica representativa é mostrada na <strong class="xfig...

Apresentamos um na vivo dois fotões protocolo para o córtex cerebral de ratos neonatais de imagem de imagem. Este método é adequado para analisar a dinâmica do desenvolvimento dos neurônios corticais, os mecanismos moleculares que controlam a dinâmica neuronal e as mudanças na dinâmica neuronal em modelos de doenças.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na neurociência, especialmente aquelas relacionadas à formação de soquetes de neurônios. A principal vantagem dessa técnica é que os pesquisadores podem analisar as alterações morfológicas dos neurônios individuais em camundongos neonatais vivos. Comece com um filhote anesthetizado pós-natal 5 e prossiga apenas na ausência de uma reação ao teste de pinça de cauda.Primeiro, esterilize o couro cabeludo limpando-o com 70% de etanol. Em seguida, use uma tesoura esterilizada com 70% de etanol para remover aproximadamente 20 milímetros quadrados da pele que cobre o crânio. Em seguida, use fórceps estéreis e um cotonete limpo encharcado em tampão de córtex, para remover a fáscia do crânio.Use uma ponta de carregamento para aplicar adesivo de tecido na superfície da pele incisiva para parar o sangramento, evitando que a área seja imageada. Coloque o filhote em outra almofada de aquecimento, fixada em 37 graus Celsius, e permita que ele se recupere da anestesia. Aguarde aproximadamente 30 minutos até que o adesivo de tecido tenha secado e solidificado.Uma vez que o adesivo de tecido tenha secado, comece a preparação da janela craniana no

in-vivo-two-photon-imaging-of-cortical-neurons-in-neonatal-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Para entender a dinâmica da rede de microcircuitos no neocórtex, é essencial para gravar simultaneamente a atividade de um grande número de neurônios. In-vivo de dois fótons de imagens de cálcio é o único método que permite registrar a atividade de uma densa população neuronal com uma única célula de resolução.

Vivo em 2-Photon Imagens de cálcio na camada 2 / 3 dos Ratos

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Imagem de dois fótons de neurônios corticais em camundongos neonatais. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo mostra a microscopia de dois fótons sendo usada para obter imagens de neurônios no cérebro de um filhote de camundongo transgênico anestesiado. O laser de dois fótons permite imagens mais profundas com alta resolução espacial e dispersão mínima de luz, permitindo a captura detalhada da morfologia neuronal, incluindo projeções dendríticas.

Microscopia de dois fótons para imagem da morfologia neuronal em um filhote de camundongo

Source:&lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/53582/quantificação-da-arquitetura-vascular-cerebral-usando-microscopia-de-dois-fótons-em-um-modelo-de-camundongo-de-neuroinflamação-induzida-por-HIV'&gt; Nishimura, C. et al. Quantificação da Arquitetura Vascular Cerebral usando Microscopia de Dois Fótons em um Modelo de Camundongo de Neuroinflamação Induzida pelo HIV. J. Vis. Exp. (2016). Este vídeo demonstra a visualização in vivo de capilares corticais no cérebro de...

 Microscopia de dois fótons para imagens in vivo de microvasculatura cerebral de camundongos 

Fonte: Kamei, R., et. al., Imagem crônica de dois fótons in vivo da microglia no hipocampo de camundongos. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra o processo de configuração e imagem para microscopia in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo CA1 (Cornu ammonis 1) e giro denteado, garantindo o alinhamento óptico ideal e a avaliação da integridade estrutural.

Imagem in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo de camundongos

É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.

Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

Experiência dependentes de alterações moleculares nos neurônios são essenciais para a capacidade do cérebro de se adaptar em resposta aos desafios comportamentais.

Vivo em dois fótons de imagem de experiência dependentes de alterações moleculares em neurônios corticais

A imagem de lapso de tempo no animal vivo fornece informações valiosas sobre a reorganização estrutural no cérebro intacto. Aqui, apresentamos uma preparação de crânio afinado que permite imagens transcranianas de estruturas sinápticas marcadas com fluorescência no córtex de camundongo vivo por microscopia de dois fótons.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de espinhas dendríticas no Rato Cortex Usando um desbaste-crânio Preparação

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

Este método descreve uma preparação crônica que permite o acesso óptico ao hipocampo de camundongos vivos. Esta preparação pode ser utilizada para realizar imagens ópticas longitudinais de plasticidade estrutural neuronal e plasticidade celular evocada por atividade ao longo de um período de várias semanas.

Imagem latente longitudinal do dois-fotão do hipocampal dorsal CA1 em ratos vivos

Este trabalho descreve um método para observação crônica in vivo da microglia em repouso no CA1 do hipocampo de camundongos usando cirurgia precisamente controlada e microscopia de dois fótons.

In vivo Imagem crônica de dois fótons da microglia no hipocampo de camundongos

As áreas sensoriais primárias no neocórtex exibem atividades espontâneas únicas durante o desenvolvimento. Este artigo descreve como visualizar atividades de neurônios individuais e áreas sensoriais primárias para analisar atividades síncronas específicas de área em camundongos neonatais in vivo.

Visualização in vivo da atividade espontânea no córtex sensorial de camundongos neonatais com resolução de neurônio único

Aprenda a realizar imagem in vivo de dois fótons no córtex cerebral de camundongos neonatais. Este método permite analisar mudanças morfológicas em neurônios vivos e estudar dinâmicas de desenvolvimento neural em tempo real.

Na Vivo Imagem de dois fotões de neurônios Cortical em camundongos Neonatais

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