Name: Design e síntese de um Rack de acordeão de DNA reconfigurável (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a projetar e sintetizar um rack de acordeão de DNA reconfigurável usando o software Cadnano e simulação OxDNA. Este protocolo avança a nanotecnologia de DNA e aplicações em nano medicina.

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Esta pesquisa foi parcialmente suportada pelo Global Research Center programa de desenvolvimento através do nacional Research Foundation de Korea(NRF) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (MSIT) (2015K1A4A3047345) e Nano· Programa de desenvolvimento de tecnologia de material através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da ciência e TIC (MSIT) (2012M3A7A9671610). O Instituto de pesquisa de engenharia na Universidade Nacional de Seul desde instalações de pesquisa para este trabalho. Os autores reconhecem gratitude para Yoon Tae-Young (Ciências Biológicas, Universidade Nacional de Seul) em relação a espectroscopia de fluorescência para a análise de traste.

1. projeto do 6 por 6 DNA acordeão Rack com circunflexo14
<ol><li>Baixe e instale o circunflexo 2.0 software14 para projetar um rack de acordeão de DNA (circunflexo 2.5 também está disponível em https://github.com/cadnano/cadnano2.5). Abra o circunflexo14 e clique na Ferramenta de Praça para adicionar uma nova parte com uma malha quadrada.</li>
	<li>O número de cada feixe do acordeão rack e desenhar no painel esquerdo da estrutura do circunflexo14 (Figura 2).</li>
	<li>Clique na ferramenta lápis e desenhar cada feixe no painel Editar direito sobre o circunflexo14. Pausa feixes cada 32 bp, que é para articulações entre vigas adjacentes. Coloque o grampos cruzamentos na mesma posição que as articulações. Use a Ferramenta lápis e a Ferramenta inserir no circunflexo14 deixar as articulações ter adicionais single-stranded cruzamentos.</li>
	<li>Clique na Ferramenta lápis e conectar as articulações. Cada feixe tem sete articulações.</li>
	<li>Gere os cruzamentos de andaime para mesclar os andaimes para o único loop usando o andaime relatado anteriormente roteamento algoritmo11. Não deixe que o domínio de ligação mínima entre vertentes andaime e grampo ser menor que 8 bp (Figura 3).</li>
	<li>Coloque os andaimes que não são usados na montagem nos vértices localizados em lados opostos do acordeão rack, conforme mostrado na Figura 3.</li>
	<li>Clique a quebrar a ferramenta. Quebre os fios de fibras descontínuas aonde circular ou mais de 60 bp.</li>
	<li>Desenha a bloqueio de DNA.<ol>
<li>Clique a quebrar a ferramenta. Pausa 8 bp de uma região de DNA descontínuas para fazer uma parte pegajosa e excluir 8 bp de uma região de DNA descontínuas. Existem 18 partes pegajosas (Figura 1) no rack acordeão 6 por 6.</li>
		<li>Coloque sequências que são inversa complementar às partes pegajosas em ambas as extremidades de fechamento cordões e conectá-los por uma região de ponte, que consiste de cadeias de poli T do comprimento desejado (figura 1B).</li>
		<li>Para a reconfiguração, adicionar 8 bp de sequências de ponto de apoio no final do DNA bloqueia para deslocamento de vertente. A sequência de suporte usada é na tabela 2.</li>
		<li>Prepare-se fios de poli A que são reverse complementar à região da ponte.</li>
		<li>Vertentes do projeto que são reverse complementares para as fechaduras de DNA para o experimento de reconfiguração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clique na Ferramenta de sequência e clique em DNA de andaime. Escolha o cadafalso como padrão M13mp18. Clique na Ferramenta de exportação e salvar a sequência no formato csv (tabela 1).</li>
</ol>2. simular a estrutura com o oxDNA
<ol><li>Baixe e instale o oxDNA16,17. O código-fonte mais recente está disponível em https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.</li>
	<li>Fazer arquivos de configuração inicial do arquivo de14 circunflexo usando python script 'cadnano_interface.py', que é fornecido no pacote oxDNA16,17 . O uso é a seguinte: 'python cadnano_interface.py cadnano_file.json sq'. O arquivo de topologia e o arquivo de configuração agora são gerados. Nota: O arquivo de topologia inclui quantos fios e nucleotídeos são na estrutura e informações sobre ligações de backbone-espinha dorsal entre nucleotídeos. O arquivo de configuração inclui informações gerais tais como temporais, energia e tamanho da caixa. Informações de orientação como vector de posição, espinha dorsal da base vetorial, vetor normal, velocidade e velocidade angular de nucleotídeos são também incluída (Figura 4).</li>
	<li>Altere as informações no arquivo de configuração e topologia de circunflexo14 para fazê-los refletir as informações estruturais reais do acordeão rack. Todas as vigas são arranjadas em paralelo quando os arquivos de topologia e configuração do circunflexo14 são visualizados. No entanto, o acordeão rack é uma estrutura de treliça assim a distância entre nucleotídeos ligados são longe para simulação (Figura 5).<ol>
<li>Girar e mover cada feixe para a estrutura da estrutura desejada. As nove colunas à esquerda no arquivo de configuração são o vector de posição, espinha dorsal da base vetorial e vetor normal (Figura 4). Para girar um feixe, todos de posição, gire vetores base de espinha dorsal e normais, usando a transformação de rotação. Em seguida, mova um feixe alterando o vector de posição para localizá-lo, como mostrado na Figura 5.</li>
		<li>Relaxe a estrutura usando o script fornecido no pacote oxDNA (ver exemplo em $oxDNA/exemplos/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION para mais informações).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute a simulação de dinâmica molecular para 10 milhões passos usando o arquivo de configuração relaxados. O uso é a seguinte: '. / oxDNA &lt; entrada &gt;' salvar dados todos os passos de 5000 ou 10000.</li>
	<li>Visualização Nota: As estruturas foram visualizadas usando cogli.<ol>
<li>Baixe e instale a versão mais recente do cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).</li>
		<li>Execute o cogli com os arquivos de configuração e topologia de simulação oxDNA. O uso é a seguinte: '. / cogli1 -t &lt; arquivo de topologia &gt;&lt; arquivo de configuração &gt;'.</li>
		<li>Esconda a caixa pressionando b.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. síntese da estrutura
Nota: O método de síntese é adaptado do anterior protocolo15,18.
<ol><li>Compre os grampos de DNA projetados de um provedor do oligonucleotide.</li>
	<li>Ajuste a concentração destes grampos de DNA a 100 μM usando água livre de nuclease.<ol>
<li>Cada cadeia de DNA que constitui uma estrutura de 'free estado' em um tubo do pool e ajustar a concentração de 2 μM para cada vertente.</li>
		<li>Bloqueio de DNA piscina vertentes pelo comprimento e número de sites de bloqueio nos tubos e ajustar a concentração de 2 μM para cada vertente. sites de bloqueio 4, 9 e 18 são usados. Adicione fios de A poli, que são complementares à região ponte na mesma concentração.</li>
		<li>Vertentes de piscina que são inverter complementares ao DNA trancar fios pelo comprimento em tubos e ajustam a concentração de 2 μM para cada vertente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar a solução de MgCl2 de 300 nM, misturando 70 μL de água livre de nuclease e 30 µ l da solução de2 1 μM MgCl. Prepare uma solução de EDTA Tris de 5x misturando 95 μL de água livre de nuclease e 5 μL de solução de EDTA Tris de 100x.</li>
	<li>Adicione 2 μL de DNA, 1.1 μL de MgCl2 solução de grampo, 2 μL de solução de EDTA Tris, 7.6 μL de água livre de nuclease e 7.3 μL de DNA de andaime de que a concentração é 110 nM tornar 20 μL de caldo misto. Definir a concentração final de cadafalso DNA de 40 nM, grampear o DNA de 200 nM, MgCl2 a 16 mM e solução de Tris-EDTA a 0,5 x.</li>
	<li>Aqueça rapidamente a solução-mãe misturada em um termociclador a 80 ° C e esfriar a 60 ° C, a uma taxa de 4 min por ° C e frio de 60 ° C a 4 ° C, a uma taxa de 40 min por ° C.</li>
</ol>4. purificação da estrutura
Nota: As amostras de todas as estruturas foram purificadas antes da análise. Nesta seção, descrevemos o protocolo de purificação de PEG, que é adaptado a partir de literatura anterior19. A amostra também pode ser purificada por eletroforese em gel, conforme descrito em anterior literatura15,18.
<ol><li>Prepare-se 5m de NaCl e 100 x Tris-EDTA.</li>
	<li>Prepare o buffer de precipitação misturando 150 μL de PEG 8000, 500 μL de 100 x Tris EDTA e 101 μL de 5 M NaCl e 249 μL de água livre de nuclease.</li>
	<li>Prepare o buffer de destino misturando 5.5 μL de solução de 300 nM MgCl2 da secção 3.3, 10 μL de solução de EDTA Tris x 5 da secção 3.3 e 84.5 μL de água livre de nuclease.</li>
	<li>Mix 20 μL da estrutura sintetizada da seção 3 e 20 μL de tampão-precipitação da seção 4.2. Em seguida, girar o estoque misturado a 16000 x g a 4 ° C. Remover o sobrenadante e dissolver a pelota no buffer de destino da seção 4.3.</li>
</ol>5. reconfiguração do acordeão Rack de um estado' livre' para um 'estado bloqueado'
<ol><li>Sintetiza a estrutura sem bloqueios de DNA para a experiência de configuração.</li>
	<li>Prepare o bloqueio de DNA da seção 3.</li>
	<li>Adicione 2 μL de cadeias de ADN bloqueio do comprimento desejado em 20 μL da estrutura sintetizada. Concentração do bloqueio de DNA é cinco vezes maior do que a estrutura.</li>
	<li>Incubar a amostra de 0, 10, 25, 50 ou 100 minutos para ver como a rápida reconfiguração ocorre.<ol>
<li>Para a incubação de 100 minutos, incubar a amostra a 50 ° C durante 30 minutos e deixe esfriar lentamente até 25 ° C, a uma taxa de 0,33 ° C/minuto.</li>
		<li>Para a incubação de 50 minutos, incubar a amostra a 50 ° C por 15 minutos e deixe esfriar lentamente até 25 ° C, a uma taxa de 0,66 ° C/minuto.</li>
		<li>Para a incubação de 25 minutos, incubar a amostra a 50 ° C para 7,5 minutos e deixe esfriar lentamente até 25 ° C, a uma taxa de 1,32 ° C/minuto.</li>
		<li>Para a incubação de 10 minutos, incubar a amostra a 50 ° C por 3 minutos e deixe esfriar lentamente até 25 ° C, a uma taxa de 3,3 ° C por minuto.</li>
		<li>Para a incubação de 0 minutos, armazene a amostra à direita de 4 ° C após fechamentos de DNA é adicionadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Logo após a etapa de fixação, esfria rapidamente a amostra a 4 ° C para evitar a desnaturação indesejada.</li>
</ol>6. reconfiguração do acordeão Rack de um estado 'bloqueado' para um 'estado livre'
<ol><li>Sintetiza a estrutura com bloqueios de DNA do comprimento desejado para a experiência de configuração.</li>
	<li>Prepare o reversos costas complementares da seção 3.</li>
	<li>Adicione 2 μL de cordões que são inverter complementares para as vertentes de bloqueio do comprimento desejado em 20 μL da estrutura sintetizada. Concentração do bloqueio de DNA é cinco vezes maior do que a estrutura.</li>
	<li>Incubar a amostra para 0, 12, 60, 120, 240 minutos para ver como a rápida reconfiguração ocorre.<ol>
<li>Para o 12, 60, 120, incubação de 240 minutos, aqueça rapidamente a amostra a 40 ° C e esfriar lentamente até 20 ° C para o tempo correspondente a cada uma. Logo após a etapa de desmontar, esfria rapidamente a amostra a 4 ° C para evitar a desnaturação indesejada.</li>
		<li>Para a incubação de 0 minutos, armazene a amostra à direita de 4 ° C depois reversos costas complementares são adicionadas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. TEM imagem
Nota: O protocolo de imagem TEM foi adaptado do anterior literatura18,20.
<ol><li>Prepare a solução de NaOH 1,25 M misturando 87,5 μL de água livre de nuclease e 12,5 μL de solução de NaOH 10 M.</li>
	<li>Adicione 1 μL de solução de NaOH 1,25 M para 50 μL de solução de formiato de uranilo a 2%.</li>
	<li>Vórtice a solução durante 3 minutos e centrifugar a velocidade máxima durante 3 minutos. Depositar 3 μL da amostra purificada na grelha TEM brilho-alta por 3 minutos e lavar rapidamente com papel de filtro.</li>
	<li>Deposite 7 μL de solução de formiato de uranilo preparado por 30 segundos e lavar rapidamente com papel de filtro.</li>
	<li>Medir o comprimento e o ângulo da estrutura acordeão fotografada pela TEM.</li>
</ol>8. FRET análise
<ol><li>Use Atto 550 e Atto 647N corante, para que a distância de Förster é 6.5 nm. Substitua grampo 58 e 117 de grampo na tabela 1 fluorescente etiquetados cordões. Então, sintetiza a estrutura com vertentes fluorescente rotulados pelo método descrito na seção 3.</li>
	<li>Medir a concentração da amostra purificada.</li>
	<li>Normalize a amostra de 10 μL 50 nM e carga para as 384 microplacas bem.</li>
	<li>Excitar a amostra com doador e aceptor de corantes em 550 nm e medir o espectro de fluorescência de 570 nm para 800 nm com um dados.</li>
	<li>Medir o espectro de fluorescência da amostra somente doador da mesma forma.</li>
	<li>Excitar as tinturas da amostra a 650 nm e o espectro de fluorescência e medida de 670 nm para 800 nm. Isto é para medir a concentração do aceitador.</li>
	<li>Obter os desvios-padrão, repetindo o mesmo experimento com três amostras, que são sintetizados e purificados separadamente.</li>
	<li>Calcule a eficiência do traste com a relação de um método, conforme descrito pela equação abaixo de21. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58364/58364eq1.jpg"> DA550: intensidade de fluorescência de pico aceitador da amostra com doador e aceptor no 550 excitação nm. D550: intensidade de fluorescência na faixa de emissão aceitador da amostra do doador somente em 550 excitação nm. DA650: intensidade de fluorescência de pico aceitador da amostra com doador e aceptor na excitação de nm 650.</li>
</ol>

<ol><li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li>
<li>Cha, T. -G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26151085">Design principles of DNA enzyme based walkers: Translocation kinetics and photo-regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (29), 9429-9437 (2015).</li>
<li>Gerling, T., Wagenbauer, K. F., Neuner, A. M., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+DNA+devices+and+assemblies+formed+by+shape-complementary%2C+non-base+pairing+3D+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic DNA devices and assemblies formed by shape-complementary, non-base pairing 3D components.</a> Science. 347 (6229), 1446-1452 (2015).</li>
<li>Pinheiro, A. V., Han, D., Shih, W. M., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+for+structural+DNA+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities for structural DNA nanotechnology.</a> Nature nanotechnology. 6 (12), 763-772 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+speed+limit+of+toehold+exchange+with+a+cartwheeling+DNA+acrobat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Exploring the speed limit of toehold exchange with a cartwheeling DNA acrobat.</a> Nature Nanotechnology. 1, (2018).</li>
<li>Krishnan, Y., Simmel, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+based+molecular+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid based molecular devices.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (14), 3124-3156 (2011).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+tweezer-actuated+enzyme+nanoreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">A DNA tweezer-actuated enzyme nanoreactor.</a> Nature communications. 4, 2127(2013).</li>
<li>Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+logic-gated+nanorobot+for+targeted+transport+of+molecular+payloads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads.</a> Science. 335 (6070), New York, N.Y. 831-834 (2012).</li>
<li>Kuzyk, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmat4031">Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules.</a> Nature Materials. 13 (9), 862-866 (2014).</li>
<li>Zhou, C., Duan, X., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmonic+nanorod+that+walks+on+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">A plasmonic nanorod that walks on DNA origami.</a> Nature communications. 6, 8102(2015).</li>
<li>Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Reconfigurable+DNA+Accordion+Rack%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">A Reconfigurable DNA Accordion Rack.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Mechanical+Properties+of+DNA+Origami+Tiles+and+Controlling+the+Kinetics+of+their+Folding+and+Unfolding+Reconfiguration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Understanding the Mechanical Properties of DNA Origami Tiles and Controlling the Kinetics of their Folding and Unfolding Reconfiguration.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (19), 6995-7005 (2014).</li>
<li>Han, D., Pal, S., Liu, Y., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+and+cutting+DNA+into+reconfigurable+topological+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Folding and cutting DNA into reconfigurable topological nanostructures.</a> Nature Nanotechnology. 5 (10), 712-717 (2010).</li>
<li>Douglas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+3D+DNA-origami+shapes+with+caDNAno%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno.</a> Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).</li>
<li>Castro, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+to+scaffolded+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A primer to scaffolded DNA origami.</a> Nature methods. 8 (3), 221-229 (2011).</li>
<li>Ouldridge, T. E., Louis, A. A., Doye, J. P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Nanotweezers+Studied+with+a+Coarse-Grained+Model+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">DNA Nanotweezers Studied with a Coarse-Grained Model of DNA.</a> Physical Review Letters. 104 (17), 178101(2010).</li>
<li>Snodin, B. E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Simulation+of+the+Self-Assembly+of+a+Small+DNA+Origami%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct Simulation of the Self-Assembly of a Small DNA Origami.</a> ACS Nano. 10 (2), 1724-1737 (2016).</li>
<li>Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+and+Characterization+of+a+Bio-responsive+Robot+from+DNA+Origami%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e51272(2015).</li>
<li>Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+and+Scalable+Preparation+of+Pure+and+Dense+DNA+Origami+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Facile and Scalable Preparation of Pure and Dense DNA Origami Solutions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).</li>
<li>Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+Complex+Two-dimensional+Shapes+from+Single-stranded+DNA+Tiles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52486(2015).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods in enzymology. 211, 353-388 (1992).</li>
<li>Kopperger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-assembled+nanoscale+robotic+arm+controlled+by+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A self-assembled nanoscale robotic arm controlled by electric fields.</a> Science. 359 (6373), New York, N.Y. 296-301 (2018).</li>
<li>Lauback, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+magnetic+actuation+of+DNA+nanodevices+via+modular+integration+with+stiff+micro-levers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Real-time magnetic actuation of DNA nanodevices via modular integration with stiff micro-levers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1446(2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

Este protocolo apresenta todo o processo de design, simulação, síntese e análise do básico 2D DNA acordeão rack. O projeto modificado e regras de simulação têm sido descritas porque a regra do projeto difere do padrão origami de DNA, em que a cremalheira de acordeão de DNA tem nucleotídeos adicionais em crossovers para flexibilidade14,15. A partir disso, esperamos que o protocolo pode acelerar várias pesquisas usando acordeão cremalheiras de DNA. Além disso, o pr...

Sistemas mecânicos baseados em nanoestruturas de DNA ou ADN nanomáquinas1,2,3,4,5 são exclusivos porque eles produzem movimento complexo nanoescala em 2D e 3D no nanômetros para Ångström-resolução, de acordo com vários biomolecular estímulos2,3,6. Anexar materiais funcionais sobre estas estruturas e controlando as suas posições, estas estruturas podem ser aplicadas a diversas áreas. Por exemplo, as nanomáquinas de DNA têm sido propostas para um reator molecular7, droga entrega8e nanoplasmonic sistemas9,10.
Anteriormente, nós introduzimos o rack acordeão reconfigurável de DNA, que pode manipular a uma rede de nanoescala 2D ou 3D de elementos11 (figura 1A). Ao contrário de outras DNA nanomáquinas que apenas alguns elementos de controle, a plataforma pode coletivamente manipular periodicamente matriz elementos 2D ou 3D em várias fases. Nós antecipamos que uma rede programável reação química e biológica ou um sistema de computação molecular pode ser construído de nosso sistema, aumentando o número de elementos controláveis. O rack de acordeão de DNA é uma estrutura, em que a rede de múltiplos feixes de ADN está ligada a articulações compostas de DNA de cadeia simples (figura 1B). O acordeão rack gerado por vigas do DNA é reconfigurado pelos bloqueios de DNA, que hibridizam à parte pegajosa de vigas e alterar o ângulo entre os feixes de acordo com o comprimento da ponte parte dos bloqueios (estado bloqueado). Além disso, várias etapa reconfiguração é demonstrada adicionando novas fechaduras após a formação do estado livre removendo bloqueios de DNA através da vertente baseada no ponto de apoio deslocamento12,13.
Neste protocolo, descrevemos o todo processo de design e síntese do rack acordeão DNA reconfigurável. O protocolo inclui design, simulação, molhado-laboratório experimentos e análise para a síntese de rack acordeão DNA de 6 por 6 malhas e uma reconfiguração desses. A estrutura coberta no protocolo é o modelo básico da pesquisa anterior11 e 65 nm em 65 nm de tamanho, constituído por 14 vigas. Em termos de projeto e simulação, o projeto estrutural do acordeão rack é diferente do convencional ADN origami14,15 (ou seja, hermeticamente embalados). Portanto, a regra de projeto e simulação molecular foram modificados dos métodos tradicionais. Para demonstrar, mostramos a técnica de desenho usando a abordagem modificada de circunflexo14 e a simulação do acordeão rack usando oxDNA16,17 com scripts adicionais. Finalmente, os dois protocolos de temperatura e FRET para análise de estruturas de cremalheira acordeão configurados são descritos.

<table><tbody><tr><td>M13mp18 DNA de fita simples</td><td>NEB</td><td>N4040s</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl2 Solução</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Tampão Tris-EDTA</td><td>Biosesang</td><td>T2142</td><td></td></tr><tr><td>Água Livre de Nuclease</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de sódio 5M</td><td>Biosesang</td><td>s2007</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>10N NaOH</td><td>Biosesang</td><td>S2038</td><td></td></tr><tr><td>Formato de uranilo</td><td>Thomas Science</td><td>C993L42</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador C1000</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodropic 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM (LIBRA 120)&nbsp; &nbsp;</td><td>Centrífuga Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer Enspire 2300</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Labogene</td><td>LZ-1580</td><td></td></tr></tbody></table>

design e síntese de um rack de acordeão de dna reconfigurável

Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

Sistemas mecânicos baseados em nanostructure de DNA ou DNA nanomáquinas, que produzem movimento complexo nanoescala em 2D e 3D no nanômetro a resolução ångström, mostram grande potencial em vários campos da nanotecnologia como os reactores moleculares, administração de medicamentos, e sistemas de nanoplasmonic. O rack acordeão reconfigurável de DNA, que coletivamente pode manipular a uma rede de nanoescala 2D ou 3D de elementos, em múltiplos estágios em resposta às entradas do DNA, é descrito. A plataforma tem potencial para aumentar o número de elementos que DNA nanomáquinas podem controlar a partir de alguns elementos para uma escala de rede com múltiplos estágios de reconfiguração.
Este protocolo, descreveremos todo o processo experimental do rack acordeão DNA reconfigurável de malhas de 6 por 6. O protocolo inclui um procedimento de regra e simulação de projeto de estruturas e uma experiência de molhado-laboratório de síntese e reconfiguração. Além disso, a análise de estrutura de temperatura (microscopia eletrônica de transmissão) e FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência) está incluído no protocolo. Os métodos de projeto e simulação romance cobertos neste protocolo ajudará pesquisadores a utilizar o cesto de acordeão de DNA para novas aplicações.

O rack de acordeão de DNA 6 projetado por 6 é simulado a partir do oxDNA16,17 , e os resultados são mostrados na Figura 6. O resultado da simulação, foi confirmado que a estrutura se destina é formada sem distorção da estrutura.
As imagens TEM na Figura 7 são imagens de estruturas configuradas com um comprimento...

Descrevemos o protocolo detalhado para projeto, simulação, molhado-laboratório experimentos e análise para um rack de acordeão de DNA reconfigurável de malhas de 6 por 6.

Design e síntese de um Rack de acordeão de DNA reconfigurável

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo das nanomoléculas, como a tecnologia nano de DNA, circuitos nanomoleculares e nanomedicina. A principal vantagem dessa técnica é que ela aumenta drasticamente a categoria de controle de elementos irados periodicamente em duas e três dimensões. Para começar, baixe e instale o software Cadnano para projetar um rack de acordeão DNA.Abra o Cadnano e clique na ferramenta quadrada para adicionar uma nova peça com uma retícula quadrada. Clique na ferramenta lápis e desenhe cada viga no painel de edição direito do Cadnano. Quebre vigas a cada 32 pares de bases para juntas entre vigas adjacentes.Coloque os cruzamentos de grampos na mesma posição que as juntas. Use a ferramenta de inserção e a ferramenta de lápis no Cadnano para permitir que as juntas tenham cruzamentos de fita simples adicionais. Agora, clique na ferramenta de quebra.Quebre os fios onde os fios de grampo são circulares ou com mais de 60 pares de bases. Para projetar as fitas de bloqueio de DNA, clique na ferramenta de quebra. Quebre oito pares de bases de uma região de DNA de grampo para fazer uma parte pegajosa e exclua oito pares de bases de uma região de DNA de grampo.Existem 18 peças adesivas no rack de acordeão de seis por seis. Coloque sequências que são complementares reversas às partes adesivas em ambas as extremidades dos fios de trava e conecte-as por uma região de ponte, que consiste em fios T poli do comprimento desejado. Para a reconfiguração, adicione oito pares de bases de sequências de apoio no final das travas de DNA para deslocamento da fita.Projete fitas que são complementares reversas aos bloqueios de DNA para o experimento de reconfiguração. Gere um arquivo de topologia e um arquivo de configuração usando o OxDNA, conforme descrito no protocolo de texto. O arquivo de topologia inclui quantas fitas e nucleotídeos estão na estrutura e informações sobre ligações de espinha dorsal entre os nucleotídeos.O arquivo de configuração inclui informações gerais, como intervalo de tempo, tamanho da caixa e energia. Informações de orientação, como vetor de posição, vetor de base de espinha dorsal, vetor normal, velocidade e velocidade angular de nucleotídeos também estão incluídas. Altere as informações no arquivo de topologia e configuração do Cadnano para que reflitam as informações estruturais reais do rack sanfonado.Em seguida, execute o programa de dinâmica molecular conforme descrito no protocolo de texto. Para visualizar as estruturas, execute o programa Cogli com os arquivos de topologia e configuração da simulação OxDNA. Esconda a caixa pressionando B.Compre os grampos de DNA de design e prepare-os conforme descrito no protocolo de texto.Combine DNA de grampo, solução de cloreto de magnésio, solução de tris EDTA, água livre de nuclease e DNA de andaime para fazer 20 microlitros de estoque misto com as concentrações finais listadas no protocolo de texto. Agora, aqueça rapidamente a solução de estoque misturado em um termociclador a 80 graus Celsius. Resfrie a solução a 60 graus Celsius, a uma taxa de quatro minutos por grau Celsius.Em seguida, resfrie de 60 graus Celsius a quatro graus Celsius a uma taxa de 40 minutos por grau Celsius. Para purificar a estrutura, misture 20 micro litros da estrutura sintetizada em 20 micro litros de tampão de precipitação. Em seguida, gire o estoque misto a 16.000 vezes G e quatro graus Celsius.Remova o sobrenadante e dissolva o pellet no tampão alvo. Para reconfigurar o rack de acordeão de um estado livre para um estado bloqueado, primeiro adicione dois micro litros de fitas de DNA do comprimento desejado em 20 micro litros da estrutura sintetizada. Incube a amostra por 100 minutos a 50 graus Celsius por 30 minutos e esfrie lentamente até 25 graus Celsius a uma taxa de 0,33 graus Celsius por minuto.Para reconfigurar o rack sanfonado de um estado bloqueado para um estado livre, adicione dois micro litros de fios que são complementares reversos aos fios travados do comprimento desejado em 20 microlitros de estrutura sintetizada. Incube a amostra por 12, 60, 120 e 240 minutos, aquecendo-a rapidamente a 40 graus Celsius e resfriando lentamente até 20 graus Celsius pelo tempo correspondente a cada um. Logo após a etapa de descolamento, resfrie rapidamente a amostra a quatro graus Celsius para evitar a desnaturação indesejada.Para realizar a análise de FRET, sintetize a estrutura como antes, espere com fitas marcadas com fluorescência. Medir a concentração da amostra purificada. Depois de normalizar a amostra para 10 nano molar, carregue 50 micro litros em um poço em uma microplaca de 384 poços.Meça a fluorescência da amostra com corantes doadores e aceitadores, bem como a amostra somente doadora, excitando a 550 nanômetros e medindo o espectro fluorescente de 570 nanômetros a 800 nanômetros com um fluorômetro. Para medir a concentração do aceptor, excite os corantes da amostra a 650 nanômetros e meça o espectro fluorescente de 670 nanômetros a 800 nanômetros. Em seguida, calcule a eficiência do FRET conforme descrito no protocolo de texto.Um resultado de simulação do OxDNA é visualizado aqui pela Cogli. O rack sanfonado é mostrado com fechaduras de DNA, dos quais os comprimentos são dois, oito, 13 e 20 pares de bases. O ângulo do rack sanfonado, composto por seis por seis malhas, foi controlado pelo comprimento das travas de DNA.Ao adicionar bloqueios de DNA com comprimentos de dois, oito, 13 e 20 pares de bases às 18 miras de travamento do rack de acordeão, o ângulo é configurado como visto na microscopia eletrônica de transmissão representativa, ou imagens TEM. O par de corantes é anexado à estrutura para análise de eficiência FRET. Aqui são mostradas imagens TEM representativas de racks de acordeão de DNA configurados de seis por seis com diferentes comprimentos de bloqueio de DNA.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da nanotecnologia de DNA explorarem as interações de diferentes moléculas em um sistema controlado coletivamente.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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Aprenda a projetar e sintetizar um rack de acordeão de DNA reconfigurável usando o software Cadnano e simulação OxDNA. Este protocolo avança a nanotecnologia de DNA e aplicações em nano medicina.

Design e síntese de um Rack de acordeão de DNA reconfigurável

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