Name: O peptídeo de40 MUB para uso na detecção de eventos inflamação mediada por neutrófilos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Aprenda a detectar neutrófilos em amostras de tecido usando o peptídeo MUB40, que se liga à lactoferrina em grânulos celulares. Este método permite rotulamento específico em amostras vivas e fixadas para estudar a inflamação.

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Este trabalho foi apoiado pela Fondation Laurette Fugain (se-2015-15) (B.S.M.) e ANR JCJC concede (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

Todos os métodos descritos aqui foram revistos e aprovados pelas organizações francesas modificaes (Comité de Recherche Clinique), CPP (des Personnes de Comité de proteção) e CNIL (Commission Nationale Informatique et Liberté).
1. neutrófilos no tecido histopatologia com a coloração fluorescente rotulados MUB40
<ol><li>Para obter o tecido para histopatologia, corrigi secções de tecido/biopsia em um volume adequado de paraformaldeído 4% (PFA) por 30 min até 4 h dependendo da espessura da amostra. Coloca as amostras em um frigorífico de 4 ° C durante a fixação. Nota: Fixação alternativos métodos/horários pode ser substituídos com base em necessidades específicas do usuário.<ol>
<li>Remover o PFA, adicionar solução de sacarose 16% com volume suficiente para cobrir completamente a amostra e colocar a amostra a 4 ° C por 4 h até durante a noite.</li>
		<li>Remover a solução de sacarose de 16% e adicionar a solução de sacarose de 30% em um volume grande o suficiente para cobrir completamente a amostra e colocá-lo em 4 ° C por 4 h até durante a noite.</li>
		<li>Remover a solução de sacarose de 30% e borre fora solução em excesso de tecido com uma toalha de papel. Coloque a secção de tecido na mídia de corte óptima temperatura (OCT) e snap-freeze em 2-methylbutane resfriado em um banho de gelo seco-etanol (-72 º C). Uma vez congelado (depois de ~ 2 min), remover blocos do 2-methylbutane e coloque-os em gelo seco, até que todos os blocos são acabados e prontos para o armazenamento a longo prazo. Armazene os blocos congelados a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na véspera de blocos de tecido devem ser cortadas, removê-los do congelador a-80 ° C e colocá-los a-20 ° C durante a noite para equilibrar.<ol>
<li>Usando um criostato, cortar tecido incorporado no OCT 10 - a 30 μm de espessura fatias e adsorver para lâminas de vidro de alta qualidade. Nota: Fatias mais finas ou mais grossas podem ser usadas dependendo das exigências experimentais.</li>
		<li>Com uma caneta de cera ou outro método hidrofóbico, desenhe uma caixa ao redor do pedaço de tecido sobre a lâmina de vidro e deixe secar.</li>
		<li>Preparar a solução de coloração, realizando uma diluição de 1:1,000 de MUB40-Cy5 (ou outra versão de40MUB fluorescente, 1 mg/mL de solução) em solução de saponina-PBS 0,1%. A concentração de40 MUB final ideal deve ser de 1 μg/mL. Nota: Concentrações finais podem ser utilizadas (0,1-0,01 μg/mL), mas pode levar a baixa intensidade de sinal. Cuidado: O pó de saponina pode causar irritação de respiração. Certifique-se de pesar saponina em uma área protegida ou armário. Métodos de permeabilização alternativo podem ser usados como Triton. Adicionar marcadores adicionais em concentrações recomendadas fabricante (EG., 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), faloidina, anticorpos fluorescentes).</li>
		<li>Delicadamente, mergulhe a lâmina de vidro em uma solução de 0.1% saponina-PBS três vezes.</li>
		<li>Cuidadosamente, borre fora excesso de líquido ao redor da seção de tecido e adicionar suficiente solução coloração para cobrir completamente a secção de tecido. Coloque o slide em uma câmara de umidade para evitar a evaporação e incube-lo por 1h à temperatura ambiente. Mantê-lo protegido da luz.</li>
		<li>Mergulhe delicadamente o slide em solução de saponina-PBS 0,1% 3 x. Em seguida, delicadamente mergulhe o slide em solução de PBS 3 x. Finalmente, delicadamente mergulhe o slide em água destilada H2O 3 x. Seca cuidadosamente excesso líquido do slide.</li>
		<li>Adicione uma pequena quantidade (~ 20 μL) do meio de montagem (20 mM Tris pH 8.0, N-propil galato de 0,5%, 90% de glicerol) junto a fatia de tecido e delicadamente estabelecer uma lamela de vidro na parte superior da lâmina de vidro. Delicadamente e uniformente prima a lamela na seção de tecido e, usando uma toalha de papel, remova cuidadosamente qualquer mídia de montagem que extrusão em torno das bordas da lamela.</li>
		<li>Coloque o slide montado em um armário escuro por 24 h permitir que os meios de montagem solidificar. Como alternativa, coloque o slide montado a 37 ° C por 1h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>As fatias de tecido em um microscópio fluorescente de acordo com o método de aquisição desejada da imagem.</li>
</ol>2. visualização de ativação dos neutrófilos com Retro-Inverso-MUB40-peptídeo Cy5
<ol><li>Obter usando o seguinte protocolo de neutrófilos humanos. Preparar as seguintes soluções e colocá-los em um pernoite anóxico do armário. Exposição ao oxigênio vai começar a ativar os neutrófilos e mais induzir célula morte16,17. Nota: Os neutrófilos podem ser alternativamente purificados "no banco" para MUB40-rotulagem de experimentos; no entanto, esteja ciente de que a exposição do oxigênio começará a afetar a ativação de neutrófilos.<ol>
<li>Prepare a seguinte solução: Solução 1 [0,9% de cloreto de sódio (NaCl)]: adicionar 4,5 g de NaCl a 500 mL de H2O. filtrar a solução. Solução 2 (6% de dextran): Adicionar 6 g de dextran em solução de NaCl 0,9% 100 ml. Solução 3 (tampão de lavagem): dissolver o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em pH de PBS 7.2 a uma concentração final de EDTA de 2 mM. Imediatamente antes da utilização, dissolva albumina de soro bovino (BSA) em solução de PBS/EDTA, tal que a concentração de BSA a final é 10% w/v.</li>
		<li>Centrifugar tubos de colheita de sangue a 650 x g por 20 min sem pausas.</li>
		<li>Sem interromper o sangue separado, transferi os tubos de coleta de sangue para um frações anóxica do armário e coletar plasma (topo) em um tubo cónico de 50 mL.</li>
		<li>Retire o tubo contendo plasma do gabinete anóxico e centrifugar 2.900 x g por 20 min com intervalos para as plaquetas de Pelotas.</li>
		<li>Sem interromper as plaquetas peletizadas, transferi cuidadosamente o tubo de plasma volta para o armário anóxico e pipetar o plasma pobre de plaquetas em um tubo de 50 mL (a seguir designado por "plasma").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Separação de células vermelhas do sangue de leucócitos<ol>
<li>Usando os tubos contendo as células vermelhas do sangue (hemácias) da etapa 2.1.3., combinar as hemácias em um tubo cónico de 50 mL (5 sangue coleção tubo conteúdo por tubo de 50 mL).</li>
		<li>Adicione NaCl 0,9%, até que o volume total atinge 44 mL. Adicione 6 mL de dextran 6% (último).</li>
		<li>Misture suavemente a mistura de sangue/dextran por inversão do tubo 10 - 20 vezes. Deixe o sedimento do tubo pelo menos 30 min.</li>
		<li>Enquanto estiver ocorrendo a sedimentação, prepare um gradiente de Percoll, acrescentando 4,2 mL de solução de Percoll a 5,8 mL de plasma em um tubo cônico de 15 mL e misture bem por inversão do tubo.</li>
		<li>Colete a fração superior do dextran tentando evitar pipetagem de glóbulos vermelhos.</li>
		<li>Aperte a tampa de rosca, retire o tubo de dextrano da câmara anóxica e centrifugar o tubo a 300 x g por 10 min com intervalos.</li>
		<li>Cuidadosamente coloque o tubo de volta para a câmara anóxica sem perturbar as células peletizadas e remover o líquido através de pipetagem.</li>
		<li>Delicadamente Ressuspender o pellet de células em 1 mL de plasma e muito lentamente, adicionar à parte superior da solução Percoll. Tenha cuidado para não induzir a mistura das camadas quando pipetagem das células na parte superior.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o tubo de solução de Percoll da câmara anóxica (evitando a mistura) e centrifugar 800 x g por 20 min sem pausas. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) permanecerá na superfície da solução de Percoll e neutrófilos serão pelota com as hemácias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remoção de contaminantes hemácias<ol>
<li>Prepare a 14 mL de solução tampão de lavagem adicionando 700 µ l PBS + 10% de BSA a 14 mL de tampão de lavagem.</li>
		<li>Coloca o tubo de solução de Percoll volta para a câmara anóxica. Remova o Percoll e PBMCs através de pipetagem e ressuspender as células peletizadas em 1 mL de solução tampão de lavagem. A pelota para ser re-suspenso terá uma cor vermelha devido a contaminantes de hemácias.</li>
		<li>Adicionar 200 μL de grânulos magnético anti-CD235a (glucoforina) para as células re-suspensas, misture suavemente e incubar durante um mínimo de 15 min. Esta etapa carrega as hemácias contaminantes com grânulos magnéticos para que eles podem ser removidos.</li>
		<li>Lavar a coluna de separação com 2 mL de lavagem buffer 3x.</li>
		<li>Mantendo um tubo cônico de 15 mL sob a coluna de separação, pipete lentamente a mistura de neutrófilos/RBC para o topo da coluna. Como fluem através de, colete as células no tubo cônico de 15 mL. A passagem deve ser nublado e perder a sua cor vermelha devido as RBCs restantes acoplado à coluna.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de tampão para o topo da coluna de lavagem e recolher no mesmo tubo cônico de 15 mL. No final da lavagem de 2 mL, a passagem deve ser clara, significando que todos os neutrófilos foram recolhidos.</li>
		<li>Misture suavemente o tubo para assegurar uma distribuição uniforme dos neutrófilos e coletar 10 μL para a contagem de células. Anote o volume final para fins de contagem de célula. Enumere o número total de células com qualquer célula padrão método de contagem.</li>
		<li>Remover o tubo de neutrófilos da câmara anóxica e centrifugue os neutrófilos a 300 x g por 20 min com intervalos.</li>
		<li>Coloque a câmara anóxica sedimentados neutrófilos e remover o tampão de lavagem através de pipetagem. Ressuspender o sedimento dos neutrófilos no plasma, com uma densidade celular máxima de 107 PMN/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enumeração de neutrófilos purificados e visualização usando MUB40<ol>
<li>Adicionar 1 μL de RI-MUB40-Cy5 (1 mg/mL) a 1 mL de meio de Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sem vermelho de fenol. Misture pipetando bem.</li>
		<li>Para efeitos do presente protocolo, o resultado tem sido descrito como se um potente neutrófilos ativando reagente, N-formylmethionyl-leucyl-fenilalanina (FMLP), é adicionado. Adicionar 1 μm de FMLP os RPMI/RI-MUB40-tubo de Cy5 e mistura através de pipetagem para cima e para baixo. Nota: Cada procedimento experimental será diferente daqui para frente, dependendo as questões a ser tratadas.</li>
		<li>Transferir a 1 mL RPMI/RI-MUB40-Cy5/FMLP mistura para um prato de microscopia de fundo de vidro. Para este prato, adicione um volume de células purificadas, correspondente a 106 total neutrófilos. Misture suavemente pipetando.</li>
		<li>Coloque o prato em um microscópio fluorescente invertido e iniciar a aquisição de imagens. Por exemplo, recomenda-se adquirir imagens de linha de base antes da adição de um reagente de ativação de neutrófilos como FMLP ou bactérias. Neste exemplo, iniciar a aquisição de RPMI/RI-MUB40-Cy5/neutrófilos e em um Commit depois, pipetar o reagente de ativação de neutrófilos para o prato de vidro e continuar a aquisição de imagens. Nota: Modificações para estas etapas podem ser feitas com baseadas nas necessidades científicas.</li>
		<li>Processo adquiriu imagens/time-lapse filmes como pertence ao microscópio específico usado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
<li>Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+Homeostasis%2C+Immunity%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li>
<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+cancer%3A+neutral+no+more%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li>
<li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li>
<li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology & Medicine. , (2018).</li>
<li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9160655">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ly6C%2FLy6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li>
<li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6G%2B+neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li>
<li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li>
<li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+biology%22%5BJournal%5D)">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li>
<li>Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li>
<li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).</li>
<li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).</li>
<li>Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc%CE%B3RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li>
<li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li>
<li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li>
</ol>

B.S.M. é listado como um inventor na MUB40 patentes:
MUB40: EP11290403.2 de patente europeia, 09/09/2011.
RI-MUB40: EP patente europeia n. º 17306746.3, 12/11/17.

Aqui, dois ensaios são descritos em que o peptídeo de40 MUB é usado para estudar a ativação e inflamação dos neutrófilos. Mostramos como MUB40 pode revelar os neutrófilos presentes nas seções de histopatologia ou mostram seu estado de ativação usando neutrófilos purificados ao vivo. As etapas críticas para usar MUB40 como um reagente de coloração são os mesmos que com qualquer outro método de deteção fluorescente. Deve ter cuidado para garantir a compatibilidade de sinais fluorescentes e ...

Os neutrófilos são um dos principais braços do sistema imune inato e rotineiramente são recrutados para os locais de inflamação ao redor do corpo. O estudo de neutrófilos foi em grande parte prejudicado por sua vida curta em vitro (menos de 8 h) e ferramentas de detecção limitada em condições basais ou após a ativação. Aqui, apresentamos um protocolo bem testado para a detecção de amplo e específico de neutrófilos mamíferos em amostras fixas/permeabilizado. Nós também fornecemos um protocolo detalhado para coloração de neutrófilos ao vivo com MUB40. Usando o protocolo de coloração dos neutrófilos ao vivo, o calendário e a localização da ativação de neutrófilos podem ser identificados. Este protocolo é ideal para os investigadores que desejem estudar a liberação de ativação ou grânulos neutrófilos. Além de suas funções antimicrobianas, neutrófilos agora são apreciados como imunomodulador células envolvidas em uma ampla gama de doenças e respostas imunes (inata e adaptativa)1,2. Os neutrófilos estão presentes em tecidos mais inflamatórios, em números elevados em tecidos infectados, em tumores inflamatórios3, durante a IBS e Crohn flare-ups4e em áreas de inflamação não-infecciosa, tais como a sinóvia de artrite reumatoide ( RA) pacientes5. Os neutrófilos contêm quatro classes de grânulos pré-formados, chamado azurophil (α), específicas (β1), grânulos de terciário (β2) e vesículas secretoras (γ)6. Após a migração para um site inflamatória, recrutados os neutrófilos se tornar ativados e sequencialmente secretam grânulo conteúdo (composto por adesão, compostos antimicrobianos e imunomoduladores moléculas), que promove ainda mais recrutamento e contribui para infecção de resolução (mas também de danos aos tecidos do hospedeiro)7. Enquanto os neutrófilos são considerados um aspecto crítico da imunidade inata, até à data, lá são alguns reagentes de detecção disponíveis para estudá-los, e ainda menos que pode ser usado para avaliar o estado de ativação de neutrófilos vivos.
Atuais métodos de detecção de neutrófilos dependem de anticorpos monoclonais gerados contra antígenos de superfície expostos, como Ly - 6G2 ou proteínas especificamente armazenadas nos grânulos neutrófilos em condições basais (por exemplo, mieloperoxidase lactoferrina). Vantagens de anticorpos monoclonais incluem sua forte ligação, sensibilidade e versatilidade em diversas condições de ensaio. No entanto, existem várias desvantagens ao uso de anticorpos monoclonais e anti-Ly - 6G em particular. Essas desvantagens incluem a especificidade, como Ly - 6G está presente na maioria das células mieloides, na medula óssea e em todos os granulócitos incluindo eosinófilos; Portanto, decifrar os neutrófilos de eosinófilos com este marcador requer mais complexos se aproxima de8. Outra troca frequente com anticorpos monoclonais é sua gama de especificidade de hospedeiros muitas vezes limitada, dificultando estudos de comparação com mais de uma espécie animal. Uma terceira desvantagem dos métodos de detecção de anticorpos, especialmente quando se utiliza células vivas ou in vivo, é o seu potencial para perturbar a função celular ou levar a ativação de células. Por exemplo, a administração de anti-Ly - 6G para ratos é comumente aplicada a depleção de neutrófilos e neutropenia transitória9. Além disso foi demonstrado que a injeção de anticorpos pode estimular neutrófilos função antitumoral10. Finalmente, pesquisa de anticorpos de neutrófilos não revela o estado de ativação da célula.
Nós identificamos um 40-amino peptídeo ácido chamado MUB,40, que pode ser usado em um número de ensaios para rotular os neutrófilos em condições em vitro e em vivo , bem como o status de ativação de neutrófilos ao vivo11de ensaios. MUB40 é derivado de MUB7012, um domínio do Lactobacillus reuteri superfície muco-proteína originalmente descrita por sua capacidade de vincular o muco13,14. MUB40 interage com lactoferrina glicosilados que está presente em altas concentrações em grânulos neutrófilos específicos e terciários. MUB40 pode ser exposto a estes grânulos através de etapas de permeabilização padrão presentes na histopatologia ou fluorescência-ativado da pilha protocolos (FACS) para coloração robusto de neutrófilos fixos de classificação. Quando os neutrófilos ao vivo são mantidos em um estado inativado, o peptídeo de40 MUB é excluído do conteúdo do grânulo, e células não mancha positivas com o marcador. Após a ativação, MUB40 pode vincular a lactoferrina exposta e levar a coloração robusto com o peptídeo. Assim, MUB40 pode ser usado para determinar o estado de ativação de neutrófilos purificados, tornando-se um marcador atraente para seguir o processo infeccioso. A capacidade de se ligar a viver os neutrófilos ativados também permite MUB40 ser usado como uma ferramenta para detectar áreas de inflamação dos neutrófilos em modelos animais vivos (por exemplo, um rato artrite modelo15). Os protocolos detalhadamente este manuscrito como fluorescente etiquetado MUB40 podem ser usados para revelar os neutrófilos em histologia tecidos e como a ensaiar a ativação de neutrófilos purificado ao vivo em vitro.

<table><tbody><tr><td>MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Peptídeo fluorescente MUB40 (disponível com outros fluoróforos conjugados)</td></tr><tr><td>RI-MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>Peptídeo MUB40 fluorescente retro-inverso. Sintetizado com D-aminoácidos e resistente a proteases (disponível com outros fluoróforos conjugados)</td></tr><tr><td>Parformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td>Fixador para histologia</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td>Solução usada para remover o excesso de PFA</td></tr><tr><td>Composto de Temperatura de Corte Ótima (OCT)</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>Usado para congelar tecido antes do seccionamento do criostato</td></tr><tr><td>2-Metilbutano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td>Usado para congelar tecidos antes do seccionamento do criostato</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00974</td><td>Usado para banho de gelo seco para congelar tecidos</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1520</td><td>Usado para seccionar tecidos</td></tr><tr><td>Lâminas de microscopia de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-101</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td>Thor Labs</td><td>CG15CH</td><td>Caneta de alta precisão</td></tr><tr><td>Dako</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>Usado para prevenir a perda de líquido durante a coloração de tecidos</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>Usado para permeabilizar células para coloração IF</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>Colore DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 Faloidina&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Liga-se à actina</td></tr><tr><td>Prolongar o antifade de ouro Mountant</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Prolonga o sinal IF e a resistência ao fotobranqueamento</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>Vários</td><td>Vários</td><td>Usado para obter imagens de lâminas IF</td></tr><tr><td>Gabinete Anóxico</td><td>Vários</td><td>Vários</td><td>Usado para a purificação de neutrófilos vivos inativados</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio NaCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>Componente de tampão de lavagem</td></tr><tr><td>MACS BSA buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>Componente de tampão de lavagem</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td>Gradiente para purificação de neutrófilos</td></tr><tr><td>CD235a glicoforina microesferas magnéticas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-501</td><td>Usado para remover hemácias contaminantes</td></tr><tr><td>Colunas LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Usado na remoção de hemácias de neutrófilos</td></tr><tr><td>RPMI-1640 sem Vermelho de Fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8755</td><td>Usado para ensaios de neutrófilos</td></tr></tbody></table>

o peptídeo de40 mub para uso na detecção de eventos inflamação mediada por neutrófilos

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

Aqui, nós fornecemos um protocolo que envolve a utilização de MUB40, um peptídeo sintetizado com a capacidade de se ligar a lactoferrina glicosilados armazenada em concentrações elevadas em grânulos específicos e terciários de neutrófilos. Este detalhes de protocolo como MUB40 conjugado diretamente com um fluoróforo pode ser usado para manchar os neutrófilos nos tecidos fixo/permeabilizado, bem como a forma como isso pode ser usado em imagens de viver-pilha a ensaiar para a granulação e ativação de neutrófilos. Métodos de deteção dos neutrófilos são limitados a espécie anticorpos monoclonais, que nem sempre são adequados para determinadas aplicações. MUB40 não penetra a membrana celular e, portanto, é excluído da lactoferrina armazenada em neutrófilos não-ativado/não-permeabilizado. MUB40 tem o benefício adicionado de reconhecer lactoferrina de um leque amplo acolhimento, tornando-se especialmente útil para comparar resultados em estudos envolvendo vários modelos de pesquisa, reduzindo o número de reagentes duplicados e simplificando os protocolos através de coloração de etapa única.

Resultados de MUB40-tecidos manchados de slides histopatologia tipicamente revelam células individuais espalhadas por todo o tecido. MUB40 manchas de lactoferrina, que está presente nos grânulos neutrófilos e compartimentada. Assim, tipicamente vistos são punctate manchas ou vários grandes áreas separadas do sinal vindo de neutrófilos individuais (Figura 1). É útil adicionar um segundo marcador de célula como DAPI para ajudar a localizar...

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar a presença de neutrófilos em seções fixas/permeabilizado histologia e avaliar o estado de ativação de neutrófilos purificados ao vivo. Em particular, o peptídeo de40 MUB vincula lactoferrina presente nos grânulos neutrófilos específicos e terciários. Exposição do conteúdo do grânulo através de permeabilização ou ativação de neutrófilos permite a marcação de neutrófilos.

O peptídeo de40 MUB para uso na detecção de eventos inflamação mediada por neutrófilos

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 é um novo marcador de neutrófilo, que se liga à lactoferrina e permite uma detecção específica em humanos e em todas as amostras de tecido de mamíferos testadas até agora. Rotular neutrófilos com MUB40 é fácil, rápido e específico. Agora é amplamente utilizado em nosso laboratório e a implicação dessa técnica se estende para o diagnóstico de doenças inflamatórias.Para começar, prepare as soluções um, dois e três de acordo com o protocolo de texto, e coloque-as em um gabinete anoxico durante a noite. Em seguida, centrifugar os tubos de sangue coletado a 650 g por 20 minutos para separar as células da fração de plasma. Sem perturbar o sangue separado, transfira os tubos para o armário anoxico e transfira as frações de plasma para um tubo cônico de 50 mililitros.Depois disso, remova o tubo de plasma do armário anoxico e centrífuga-o a 2900 g por 20 minutos. Tomando cuidado para não interromper as plaquetas pelleted, transferir o tubo para o armário anoxico e pipeta o plasma pobre plaqueta em um tubo fresco de 50 mililitros. Usando os tubos de coleta de sangue, combine os glóbulos vermelhos em um tubo cônico de 50 mililitros.Em seguida, adicione 0,9% de solução de cloreto de sódio até que o volume total atinja 44 mililitros e adicione seis mililitros de 6% de dextran. Inverta o tubo 10 a 20 vezes para misturar suavemente a mistura de sangue e dextran, e deixe o tubo sedimentar por pelo menos 30 minutos. Enquanto os sedimentos do tubo, prepare um gradiente percoll adicionando 4,2 mililitros de solução Percoll a 5,8 mililitros de plasma, e inverta o tubo para misturar.Em seguida, colete o neutrófilo contendo fração superior do dextran, tomando cuidado para não pipetizar glóbulos vermelhos. Aperte a tampa do parafuso, retire o tubo dextran do armário anoxico e centrífugue o tubo a 300 g por 10 minutos. Tomando cuidado para não perturbar as células pelleted, colocar o tubo de volta no armário anoxic.Em seguida, remova o líquido por pipetação. Levemente resuspensar a pelota em um mililitro de plasma. Adicione lentamente as células resuspended aos topos da solução Percoll.Remova cuidadosamente o tubo de solução Percoll do armário anoxico e centrífuga-o a 800 g por 20 minutos para separar os PBMCs dos neutrófilos. Em seguida, prepare 14 mililitros de solução de tampão de lavagem de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, coloque o tubo Percoll no armário anoxico.Use uma pipeta para remover os Percoll e PBMCs e resuspenque o neutrófilo contendo pelota em um mililitro de solução tampão de lavagem. Em seguida, adicione 200 microliters de contas magnéticas às células resuspended. Misture suavemente e incuba as células e as contas por pelo menos 15 minutos.Depois disso, lave duas vezes uma coluna de separação, com dois mililitros de tampão de lavagem. Enquanto segura um novo tubo cônico de 15 mililitros sob a coluna, pipeta lentamente a mistura de glóbulos vermelhos neutrófilos através da coluna. O fluxo da coluna deve ser nublado e perder sua cor vermelha, confirmando a separação total dos neutrófilos dos glóbulos vermelhos restantes.Adicione dois mililitros de tampão de lavagem na parte superior da coluna e colete o fluxo através no mesmo tubo. Até o final desta lavagem, o fluxo deve ser claro. Misture suavemente o tubo de coleta para garantir que os neutrófilos sejam distribuídos uniformemente.Em seguida, coletou 10 microliters do fluxo através da contagem celular. Depois disso, remova o tubo de neutrófilo do armário anoxico e centrífuga o tubo a 300 g por 20 minutos. Coloque os neutrófilos sedimentados de volta no armário anoxico e remova o tampão de lavagem através de pipet.Então, resuspense a pelota no plasma. Adicione um microliter de RI-MUB40-Cy5 a um mililitro de meio RPMI-1640, sem vermelho fenol, e misture através de pipetagem. Em seguida, adicione um microliter de solução FMLP e pipeta para misturar.Transfira a mistura para um prato de microscopia de fundo de vidro. Em seguida, adicione um volume apropriado de células purificadas ao prato. Por fim, coloque o prato em um microscópio fluorescente invertido e inicie a aquisição de imagens.Neste protocolo, o MUB40 foi usado em células vivas para detectar secreção de neutrófilos após simulação com FMLP. A dinâmica do lançamento do conteúdo do grânulo, incluindo lactoferrina, pode ser visualizada ao longo do tempo, aqui em magenta. MUB40 pode ser usado adicionalmente em neutrófilos fixos.Aqui, phagocytizando contas fluorescentes em uma série cronometrado. O conteúdo do grânulo de neutrófilo é rotulado aqui em azul. Os neutrófilos mostraram pouca ou nenhuma coloração celular nos primeiros pontos de tempo e gradualmente, a rotulagem RI-MUB40 aumentou ao longo do tempo, tanto na membrana plasmática quanto na superfície das contas.MUB40 também pode ser usado em tecidos inflamatórios fixos para detectar neutrófilos especificamente, como mostrado nas figuras de texto. Descrevemos aqui o procedimento de purificação de neutrófilos, aplicado rotineiramente em nosso laboratório. Qualquer outro método é adequado, a rotulagem MUB40-Cy5 ainda funcionará.O neutrófilo pode ser especificamente rotulado com MUB40 após a purificação, ou diretamente em tecido inflamado de pacientes ou modelos animais. Vários derivados MUB40 foram projetados para ampliar seu uso. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para o pesquisador no campo da inflamação, explorar o recrutamento neutrófilo e a ativação em doenças inflamatórias.

the-mub40-peptide-for-use-detecting-neutrophil-mediated-inflammation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra um ensaio de degranulação de grânulos azurofílicos em neutrófilos de camundongos, envolvendo a estimulação de neutrófilos para liberar grânulos azurofílicos contendo mieloperoxidase. A reação enzimática subsequente é empregada para quantificar os níveis de mieloperoxidase, fornecendo informações sobre a ativação de neutrófilos.

Um ensaio para monitorar a degranulação de grânulos azurofílicos em neutrófilos após ativação

Nós descrevemos um método de imagem não-invasivo para distinguir as fases inflamatórias. Administração sistêmica de luminol revela áreas de inflamação aguda dependentes atividade da MPO em neutrófilos. Em contraste, a injeção de lucigenina permite a visualização de inflamação crônica dependente de atividade Phox em macrófagos.

No método de imagem in vivo Distinguir inflamação aguda e crônica

Lipídios são conhecidos por desempenhar um papel importante nas funções celulares. Aqui, descrevemos um método para determinar a composição lipídica de neutrófilos, com ênfase sobre o nível de colesterol, usando tanto HPTLC e HPLC para obter uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes da formação armadilha extracelular de neutrófilos.

Métodos de estudo de lipídios Alterações nos neutrófilos ea subsequente formação de neutrófilos Extracelular Traps

Aqui, apresentamos três métodos para avaliar a migração de neutrófilos e infiltração tanto in vivo quanto in vitro. Esses métodos podem ser usados para descobrir terapêuticas promissoras visando a migração de neutrófilos.

Detectando migração e infiltração de neutrófilos em camundongos

Os protocolos aqui descritos fornecem um guia para visualizar e quantificar a atividade de proteases neutrófilos na escarro humana. As aplicações dessa análise abrangem desde a avaliação de tratamentos anti-inflamatórios, até validação de biomarcadores, triagem de medicamentos e grandes estudos clínicos de coorte.

Monitoramento de Elastase e Cathepsin G Atividade em Amostras de Espiuma Humana

Apresenta-se aqui um protocolo para a indução e análise de armadilhas extracelulares (TNEs) de neutrófilos in vitro . A quantificação do DNA, da catelicidina (LL37) e da atividade enzimática produziu dados que mostram a variabilidade na composição e morfologia dos TNEs induzidos por estímulos microbianos e químicos em condições controladas semelhantes.

Análise morfológica e composicional de armadilhas extracelulares de neutrófilos induzidas por estímulos microbianos e químicos

Apresentamos um protocolo para uma técnica modificada de ensaio imunoenzimático em sanduíche para medir quantitativamente dois componentes de remanescentes de armadilhas extracelulares de neutrófilos, complexos de DNA conjugado à mieloperoxidase e DNA conjugado à elastase neutrofílica, derivados de neutrófilos ativados.

Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado

Este protocolo apresenta um conjunto de ensaios funcionais de neutrófilos para ser usado como um método de triagem para cobrir funções de diferentes vias de sinalização. O protocolo inclui uma avaliação inicial e simples da viabilidade celular, pureza, produção de espécies reativas de oxigênio, migração em tempo real, fagocitose e uma sugestão preliminar de armadilhas extracelulares para neutrófilos.

Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

Este protocolo descreve um teste de biomarcador sintético de urina multianalito mediado por CRISPR-Cas que permite o diagnóstico de câncer no ponto de atendimento por meio da análise ex vivo das atividades de protease associadas ao tumor.

Teste de Biomarcador Sintético de Urina Multianalito Mediado por CRISPR-Cas para Diagnóstico Portátil

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Os neutrófilos de baixa densidade (LDN) aumentam significativamente em várias doenças. Os LDN são geralmente isolados por meio de classificação de células. Apresentamos um método prático para obter LDN puro e viável. Após a centrifugação do sangue periférico com gradiente de densidade, as células são incubadas com microesferas magnéticas e, em seguida, o LDN é separado por meio de colunas magnéticas.

Método rápido de microesferas magnéticas para purificação eficiente de neutrófilos de baixa densidade

Aprenda a detectar neutrófilos em amostras de tecido usando o peptídeo MUB40, que se liga à lactoferrina em grânulos celulares. Este método permite rotulamento específico em amostras vivas e fixadas para estudar a inflamação.

O peptídeo de₄₀ MUB para uso na detecção de eventos inflamação mediada por neutrófilos

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