Name: Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a imagem quimioluminescente de espécies reativas de oxigênio em feridas murinas usando L-012. Este método não invasivo permite monitorar ROS em tempo real para estudar regeneração tecidual.

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Estamos gratos ao núcleo pré-clínicos Imaging a NYU School of Medicine, com agradecimento especial a Orlando Aristizabal e Youssef Zaim Wadghiri. O núcleo é um recurso compartilhado, parcialmente apoiado pela Laura e Isaac Perlmutter Cancer Center suporte Grant NIH/NCI 5P30CA016087 e NIBIB biomédica Technology Resource Center Grant NIH P41 EB017183. Este trabalho foi apoiado pela Associação Americana de Diabetes "Caminho para parar de Diabetes" D.C. [número de concessão 1-16-ACE-08] e NYU aplicado apoio fundo de investigação para relações públicas.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comitê da New York University School of Medicine. Todos os ratos estão alojados atrás de uma barreira e todo o pessoal usa equipamento de protecção adequado.
1. dia 0: Preparação do modelo murino de cicatrização Excisional
<ol><li>Anestesia o diabéticos ratos (Leprdb/db), com idades entre 8 a 12 semanas, com isoflurano inalatório de 2%. Confirme que cada rato tem sido devidamente anestesiado utilizando o teste do beliscão pé almofada. Aplique lubrificante ocular esterilizada para cada olho para evitar a irritação do ressecamento. Pesquisadores devem seguir as orientações do seu pessoal veterinário institucional ao anestesiar animais utilizando isoflurano.</li>
	<li>Pesar os ratos e registar o peso corporal de cada rato. Confirme o estado diabético de animais gravando a glicose no sangue de cada animal utilizando um glicosímetro.</li>
	<li>Desinfecte o equipamento de anestesia e espaço de trabalho processual. Remover os pelos dorsais dos ratos usando uma máquina de cortar cabelo, seguido pela aplicação de loção de cabelo remoção limpe o excesso de pelos fora. Utilize toalhetes com álcool para limpar a pele exposta, duas vezes e deixe para secar.</li>
	<li>Crie duas feridas de espessura total de 10 mm estendendo-se através da carnosus panículo usando socos de biópsia estéril de 10 mm de acordo com uma ferida excisional bem-estabelecida cura técnica7,8. Use luvas estéreis para todas as cirurgias de sobrevivência. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos em sacos antes da cirurgia e aberto apenas no campo cirúrgico.</li>
	<li>As feridas abrir usando uma folha de silicone grossa de 0,5 mm com recortes circulares de 10 mm e fixe os stents no lugar usando o splint interrompido suturas de seda 4-0.</li>
	<li>Seguir cirurgia, remover os animais da anestesia e coloque no aquecimento pad para facilitar a recuperação adequada. Digno de nota, se a temperatura do corpo do animal diminui durante o procedimento, o animal pode ser transportado para a almofada de aquecimento mais cedo para minimizar a perda de calor do corpo sob anestesia. Monitore os animais até que estejam acordados e móveis.</li>
	<li>Depois de totalmente recuperado, volte os animais para gaiolas individuais, contendo alimentos e água (certifique-se de que comida está no chão da gaiola para enriquecimento no pós-operatório). Fornece toalhas de papel picado adicional material de nidificação por 2 semanas. Não faz casa animais que se submeteram à cirurgia com outros animais, para evitar interações adversas e alterações de status de cura de feridas.</li>
	<li>Para alívio da dor pós-operatória, injete ratos por via subcutânea com buprenorfina em 0,1 mg/kg de peso corporal duas vezes por dia, começando imediatamente após o procedimento, durante 3 dias.</li>
</ol>2. dia 1: Preparação de siRNA Keap1
Nota: Prepare todos os tratamentos dentro de um armário de biossegurança.
<ol><li>Prepare-se diluição de siRNA combinando 37,5 µ l de meio de soro reduzida com 12,5 µ l de 20 µM Keap1 siRNA (siKeap1) (250 pmol) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL no gelo.</li>
	<li>Prepare a diluição de lipossoma combinando 25 µ l de meio de soro reduzida com 25 µ l de mistura de lipossomas em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l da diluição de siRNA para 50 µ l lipossoma diluição gota a gota (volume de 1:1) e misture suavemente.</li>
	<li>Incube durante 20 minutos em temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de gel de metilcelulose 2% em água e misture suavemente pipetando para cima e para baixo.</li>
	<li>Tratar cada animal com um si de bobagemNS (controle) ou siKeap1 (experimental). Aplique o gel para o topo da ferida. Envolva o tronco do animal com curativo de filme transparente para manter o gel no local, mantendo os membros livres para manter a mobilidade.</li>
</ol>3. dia 3: Preparação da solução L-012
Nota: Prepare todos os reagentes em um armário de biossegurança.
<ol><li>Em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga, prepare L-012 em 1X PBS numa concentração de 0,5 mg/100 mL.</li>
	<li>Manualmente o vórtice do tubo de microcentrifugadora. O L-012 não completamente se dissolve na PBS, porém deve ser uniformemente suspensa no líquido. Digno de nota, não tente dissolver L-012 na água para evitar perturbador fisiológica de eletrólitos depois da injeção.</li>
	<li>Transferi a solução para uma seringa de 1 mL, utilizando uma agulha de 27G. Nota: Certifique-se de proteger a solução de L-012 de luz.</li>
</ol>4. dia 3: In Vivo Imaging de feridas diabéticas
<ol><li>ANESTHETIZE ratos com isoflurano inalatório de 2%. Pesquisadores devem seguir as orientações do seu pessoal veterinário institucional ao anestesiar animais utilizando isoflurano. Confirme que cada rato tem sido devidamente anestesiado utilizando o teste do beliscão pé almofada. Aplique lubrificante ocular esterilizada para cada olho para evitar a irritação do ressecamento.</li>
	<li>Suavemente retire o curativo de filme transparente os ratos sem perturbar as feridas.</li>
	<li>Coloque os ratos no hemiciclo de imagens em seus respectivos pedidos. Para manter níveis adequados de2 O na câmara, defina a entrada de sistema de imagem e os níveis de2 indução câmara O a 1,0 L/min.</li>
	<li>Os ratos de bioluminescência e fotografia na linha de base antes da injeção do composto L-012 da imagem.</li>
	<li>Limpe o abdômen com toalhetes com álcool e deixe para secar. Realize uma injeção intraperitoneal da solução de L-012 de 5 mg por peso de 200 g, utilizando uma agulha de calibre 27. Por exemplo, um mouse com 20 g deve receber 0,5 mg de L-012.</li>
	<li>Imediatamente após a injeção de L-012, coloque os ratos em seus respectivos locais na câmara de imagens. Os ratos da imagem ao longo de 60 minutos, durante 1 minuto com intervalos de 4 minutos. Defina a ferida de 10 mm como a região de interesse para a determinação do nível de ROS.</li>
	<li>Seguir cirurgia, remover os animais da anestesia e coloque no aquecimento pad para facilitar a recuperação adequada. Monitore os animais até que estejam acordados e móveis.</li>
	<li>Depois de totalmente recuperado, volte os animais para gaiolas individuais, mantendo o mesmo ambiente de enriquecimento pós-operatória descrito anteriormente no 1.6. Não faz casa animais que se submeteram à cirurgia com outros animais, para evitar interações adversas e alterações de status de cura de feridas.</li>
</ol>

<ol><li>Nishinaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+sensitive+chemiluminescence+probe%2C+L-012%2C+for+measuring+the+production+of+superoxide+anion+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).</li>
<li>Daiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+NAD%28P%29H+oxidase-derived+superoxide+with+the+luminol+analogue+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measurement of NAD(P)H oxidase-derived superoxide with the luminol analogue L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 36 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Imada, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+reactive+oxygen+species+generated+by+neutrophils+using+a+chemiluminescence+probe+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of reactive oxygen species generated by neutrophils using a chemiluminescence probe L-012.</a> Analytical Biochemistry. 271 (1), 53-58 (1999).</li>
<li>Sohn, H. Y., Gloe, T., Keller, M., Schoenafinger, K., Pohl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+superoxide+detection+in+vascular+cells+by+the+new+chemiluminescence+dye+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sensitive superoxide detection in vascular cells by the new chemiluminescence dye L-012.</a> Journal of Vascular Research. 36 (6), 456-464 (1999).</li>
<li>Fuchs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Hypoxia+PET+Imaging+Quantifies+the+Severity+of+Arthritic+Joint+Inflammation+in+Line+with+Overexpression+of+Hypoxia-Inducible+Factor+and+Enhanced+Reactive+Oxygen+Species+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo Hypoxia PET Imaging Quantifies the Severity of Arthritic Joint Inflammation in Line with Overexpression of Hypoxia-Inducible Factor and Enhanced Reactive Oxygen Species Generation.</a> The Journal of Nuclear Medicine. 58 (5), 853-860 (2017).</li>
<li>Asghar, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in murine colitis.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 20 (8), 1435-1447 (2014).</li>
<li>Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+reproducible+murine+model+of+excisional+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 12 (4), 485-492 (2004).</li>
<li>Soares, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+Nrf2+Signaling+Normalizes+the+Regenerative+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Restoration of Nrf2 Signaling Normalizes the Regenerative Niche.</a> Diabetes. 65 (3), 633-646 (2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+ROS+signaling+in+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging ROS signaling in cells and animals.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (8), 917-927 (2013).</li>
<li>Kielland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radical Biology and Medicine. 47 (6), 760-766 (2009).</li>
<li>Balke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Oxidative+Cellular+Stress+Induced+by+Nanoparticles+in+the+Subcytotoxic+Range+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Visualizing Oxidative Cellular Stress Induced by Nanoparticles in the Subcytotoxic Range Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Small. , (2018).</li>
<li>Zielonka, J., Lambeth, J. D., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+use+of+L-012%2C+a+luminol-based+chemiluminescent+probe%2C+for+detecting+superoxide+and+identifying+inhibitors+of+NADPH+oxidase%3A+a+reevaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">On the use of L-012, a luminol-based chemiluminescent probe, for detecting superoxide and identifying inhibitors of NADPH oxidase: a reevaluation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 65, 1310-1314 (2013).</li>
<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signalling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants & Redox Signalling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Nrf2+activation+therapy+with+RTA+408+enhances+regenerative+capacity+of+diabetic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Targeted Nrf2 activation therapy with RTA 408 enhances regenerative capacity of diabetic wounds.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 139, 11-23 (2018).</li>
<li>Rabbani, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lipoproteoplex+delivers+Keap1+siRNA+based+gene+therapy+to+accelerate+diabetic+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Novel lipoproteoplex delivers Keap1 siRNA based gene therapy to accelerate diabetic wound healing.</a> Biomaterials. 132, 1-15 (2017).</li>
</ol>

Nós temos nenhum divulgações para o relatório.

Técnicas comuns de medição ROS tem sido limitadas pela protocolos complexos que requerem a extração do tecido ou da mesma forma técnicas invasivas. Nos últimos anos, as medidas de estresse oxidativo têm sido relatadas com base nas modalidades de imagem inovadoras, permitindo assim que para avaliações spatiotemporal9,10,11. L-012 tem várias vantagens, como uma sonda quimioluminescente relativo MCLA1,<...

Metabólitos de oxigênio gerados através de processos inflamatórios contribuam para diversas cascatas de sinalização, bem como alteração destrutiva de componentes celulares1. Utilizando técnicas sensíveis e específicas para medir ROS é crítico para estudar processos inflamatórios e caracterizar os efeitos do estresse oxidativo. Imagem latente na vivo é valioso devido à sua capacidade para fornecer dados de dinâmicos espaciais e temporais em tecido vivo. L-012 é uma sonda quimioluminescente sintética que é altamente sensível para ânions superóxido e produz uma intensidade de luz mais elevada do que outras sondas fluorescentes em células, tecidos e sangue total1,2,3, 4. tem sido empregado com sucesso para a imagem latente na vivo em modelos murino para estudar várias doenças inflamatórias, incluindo artrite e colite5,6. Ainda tem que ser empregado numa ferida cutânea estabelecida modelo de cura. Medição de ROS gerado é igualmente relevante para avaliar a progressão da cicatrização de feridas em condições diferentes. A sensibilidade e a natureza não-invasiva deste método torna uma técnica promissora para estudar a cicatrização de feridas em modelos murino.
Nrf2 é um grande condutor da resposta antioxidante e um fator transcricional com especificidade para o elemento de resposta antioxidante (são) comum às regiões promotor de várias enzimas de antioxidante8. Na ausência de estresse oxidativo, Nrf2 é sequestrado no citoplasma por Keap1, que posteriormente provoca sua ubiquitination e degradação. Desequilíbrio da via Nrf2/Keap1 tem sido implicado na homeostase redox inapropriado e posterior cicatrização no cenário de maior estresse oxidativo9. Anteriormente mostramos que a supressão de Keap1 estimula o aumento da atividade Nrf2 e promove resgate da cicatrização de feridas cutâneas patológica no diabético feridas9.
Aqui descrevemos um protocolo que utiliza bioluminescência L-012-assistida de imagem para medir os níveis ROS em um modelo de cura ferida cutânea excisional, que é fundamental para destacar a associação entre ROS e cicatrização de feridas. Esta técnica demonstra alterações em tempo real em carga oxidativa dentro feridas e periferia imediata. Além disso, este método permite rápida avaliação de intervenções e mecanismos de manipulação de redox que afetam. Aqui usamos um modelo de Keap1 nocaute para a restauração da homeostase redox para avaliar a aplicabilidade da nossa estratégia. Porque nossa técnica é não-invasivo e feridas são imperturbadas, o mesmo animal pode ser usado para mais confirmação análises com base em lysates histologia ou célula.

<table><tbody><tr><td>Bks. Camundongos Cg-Dock7m+/+ Leprdb/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000642</td><td></td></tr><tr><td>13 cm x 18 cm Folha de silicone (0,6 mm)</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>665581</tr><tr><td>Curativos de Filme Transparente Tegaderm 3M</td><td>3M</td><td>88-1626W</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente de Transfecção</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>11668027</tr><tr><td>Keap1 Stealth siRNA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1299001</td><td></td></tr><tr><td>Silencer controle negativo&nbsp;</td><td>Thermofisher Scientific&nbsp;</td><td>AM4635</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Soro Reduzido</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Metil-celulose&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9004-67-5</td><td></td></tr><tr><td>L-012</td><td>Wako Chemicals</td><td>120-04891</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III XR Sistema de Imagem In Vivo&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

na vivo imagens de espécies reativas de oxigênio em um murine ferida modelo

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

A geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) é uma característica dos processos inflamatórios, mas em excesso, estresse oxidativo é amplamente envolvido em várias patologias como câncer, aterosclerose e diabetes. Mostramos anteriormente que a disfunção do fator Nuclear (eritroide-derivado 2)-tipo 2 (Nrf2) / eritroide Kelch-como derivado de células proteína 1 (Keap1) sinalização percurso leva ao extremo desequilíbrio ROS durante cutânea cicatrização em diabetes. Desde que os níveis ROS são um importante indicador da progressão da cicatrização, técnicas de quantificação específica e precisos são valiosas. Têm sido descritos vários ensaios em vitro para medir ROS em células e tecidos; no entanto, eles apenas fornecem uma única medida cumulativa por amostra. Mais recentemente, o desenvolvimento de indicadores baseados em proteína e as modalidades de imagem permitiram análises spatiotemporal exclusivas. L-012 (C13H8ClN4NaO2) é um derivado de luminol que pode ser usado tanto em vivo e em vitro quimioluminescente deteção de ROS gerado pelo oxidase NAPDH. L-012 emite um sinal mais forte do que outras sondas fluorescentes e tem se mostrado sensível e confiável para a detecção de ROS. A aplicabilidade de lapso de tempo de L-012-facilitou a imagem fornece informações valiosas sobre processos inflamatórios, reduzindo a necessidade de sacrifício e globalmente, reduzindo o número de animais de estudo. Aqui, descrevemos um protocolo utilizando L-012-facilitado na vivo por imagens para quantificar o estresse oxidativo em um modelo de cicatrização de feridas excisional usando ratos diabéticos com localmente disfuncional Nrf2/Keap1.

Três dias depois de criar feridas bilaterais de acordo com um modelo estabelecido ferida excisional (figura 1A), ratos diabéticos estão posicionados na câmara de imagens. Uma fotografia inicial e uma medida de bioluminescência são tomadas antes da injeção de L-012 a conta para o sinal de fundo (figura 1B). Após injeção intraperitoneal com a solução de L-012, os ratos são reposicionados na câmara e bioluminescência é visualizada e...

Descrevemos um não-invasivo na vivo de imagem protocolo que é simplificada e custo-benefício, utilizando o L-012, um analógico-luminol quimioluminescente, para visualizar e quantificar as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas em um modelo do rato excisional ferido.

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de reparação e regeneração de tecidos sobre as associações entre as vias citoprotetores, o estresse oxidativo e a resposta de cicatrização da ferida. A principal vantagem desta poderosa técnica é que você pode medir espécies reativas de oxigênio em uma ferida, em tempo real, para determinar seu impacto na regeneração tecidual. Demonstrando o procedimento comigo estará Jennifer Kwong, uma assistente de pesquisa no meu laboratório.Use um glucometer para medir a glicemia de cada camundongo diabético anesthetizado de oito a 12 semanas. E use um aparador de cabelo e creme depilatório para remover o cabelo dorsal do primeiro animal. Use lenços álicos duas vezes para limpar a pele exposta e cobrir o animal para que apenas a área cirúrgica seja exposta.Quando o álcool secar, use socos de biópsia estéril de 10 milímetros para criar duas feridas de espessura total de 10 milímetros que se estendem através do carnosus panniculus de acordo com uma técnica bem estabelecida de cicatrização de feridas excisionais. Use uma folha de silicone de 0,5 milímetros de espessura com recortes circulares de 10 milímetros para abrir as feridas e fixar os stints com suturas de seda interrompidas 4/0. Em seguida, coloque os ratos em uma almofada de calor com monitoramento até a recuperação completa, antes de retornar à sua gaiola individual, fornecendo toalhas de papel como material adicional de aninhamento por duas semanas.No dia seguinte, aplique o controle absurdo de gel RNA interferindo ou um pequeno gel Keap1 experimental interferindo no topo da ferida de cada animal e enrole cada torso com curativo de filme transparente para manter o gel no lugar enquanto deixa os membros livres. No terceiro dia do experimento, carregue uma seringa de um milímetro equipada com uma agulha de calibre 27 com solução L-012 recém-preparada e enrole a seringa para proteger a solução da luz. Para imaginar as feridas, remova suavemente o curativo transparente de cada um dos ratos sem perturbar as feridas e coloque os ratos na câmara de imagem de um sistema de imagem de bioluminescência.Defina o fluxo do sistema de imagem e os níveis de oxigênio da câmara de indução para um litro por minuto e imagem dos ratos por bioluminescência e campo brilhante na linha de base. Em seguida, limpe os abdômens com lenços umedecidos e injete cinco miligramas de solução L-012 por 200 gramas de peso corporal, IP, em cada rato uma vez que o álcool secou. Injetar a solução L-012 sem perturbar as feridas na pele dorsal é fundamental, pois qualquer distorção afetará a trajetória de cicatrização da ferida e a interpretação dos dados.Certifique-se de que o animal está seguro em recumbência dorsal antes da injeção. Imediatamente após a injeção, coloque os camundongos de volta em seus respectivos locais na câmara de imagem e imagem dos animais por um minuto a cada quatro minutos durante um período de imagem de 60 minutos, definindo a ferida de 10 milímetros como a região de interesse para determinar o nível de espécies reativas de oxigênio. Em seguida, coloque os ratos em uma almofada de calor com monitoramento até a recuperação completa antes de devolver os animais para suas gaiolas individuais.Três dias após a criação de feridas bilaterais de acordo com o modelo de ferida excisional estabelecida, nenhuma bioluminescência é observada antes da injeção de L-012. Após a injeção intraperintoneal da solução L-012, a bioluminescência é observada nas áreas da ferida onde espécies de oxigênio reativa são detectadas. O registro da bioluminescência por um minuto a cada quatro ou cinco minutos ao longo de 60 minutos demonstra a saturação bioluminescente da região de interesse ao longo do tempo, com o tempo ideal de imagem para alcançar a saturação L-012 completa observada em cerca de 50 minutos.A bioluminescência em cada região de interesse de ferida antes e depois da injeção de L-012 em pequenos RNAs interferentes ou camundongos tratados com RNA interferentes keap1 podem então ser calculados dividindo as contagens totais de intensidade de luz pela área. A análise das seções de tecido silvestre do dia 10 para confirmar a precisão da medição do nível de nível de espécies de oxigênio reativos pela coloração de H&E revela uma redução da infiltração celular em pequenas feridas tratadas keap1 interferindo em comparação com pequenos tecidos tratados sem sentido interferindo, indicando uma morfologia inflamatória reduzida nos animais experimentalmente tratados com gel. A análise da imuno-reatividade de F4/80, um marcador de macrófago proteico em seções de tecido silvestre, indica um número reduzido de macrófagos em pequenas feridas tratadas keap1 interferentes em comparação com pequenas feridas tratadas sem sentido interferindo, ressaltando ainda mais a validade deste método.Ao tentar este procedimento, certifique-se de confirmar que o L-012 não está expirado e agitar a solução em um lugar protegido contra a luz. Após este procedimento, sondas direcionadas e métodos baseados em imuno-ensaio podem ser usados para estudar a localização subcelular de espécies reativas de oxigênio e seus correlatos, permitindo uma rápida avaliação das intervenções e mecanismos que afetam as estatísticas redux das feridas.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

NADPH oxidase é a principal fonte de espécies reactivas de oxigénio (ROS) em fagócitos. Por causa da natureza efêmera de ROS, é difícil de medir e monitorar os níveis de ROS em animais vivos. Um método minimamente invasivo para quantificação de série de ROS em ratos vivos é descrito.

Imagem de bioluminescência de NADPH oxidase em diferentes modelos animais

Source: Hunt, A. M. A., et al. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp.(2017).This video demonstrates the procedure for assessing infection clearance and healing progression in a wounded diabetic mouse using bioluminescent and microscopic images.

Bioluminescence Imaging to Track Bacterial Infection and Wound Healing in a Mouse Model

Este vídeo demonstra imagens in vivo para estudar a dinâmica de recrutamento de neutrófilos em um local de infecção em um camundongo transgênico imunocomprometido com neutrófilos que expressam GFP. Envolve a injeção de bactérias luminescentes para causar uma infecção. Isso leva ao recrutamento de neutrófilos para o local da infecção, cujo rastreamento é feito por imagem.

Monitoramento da dinâmica de recrutamento de neutrófilos e carga bacteriana no local da infecção em um modelo murino

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar um modelo murino de infecção de ferida cutânea. Ao infectar camundongos - modificados para expressar uma proteína fluorescente em neutrófilos - com um Staphylococcus aureus bioluminescente geneticamente modificado - uma bactéria patogênica. A carga bacteriana no local da infecção e a dinâmica de recrutamento de neutrófilos podem ser estudadas usando imagens de animais inteiros.

Um modelo de infecção de feridas na pele murina para estudar a resposta imune contra um patógeno bacteriano

Um modelo murino de cicatrização de feridas cutâneas que podem ser utilizados para avaliar compostos terapêuticos em contextos fisiológicos e patológicos.

Modelo Murino de Cicatrização

Este protocolo descreve a indução de um modelo de isquemia-reperfusão (IR) em pele de orelha de rato usando íman de fixação. Usando um modelo de imagens intravital custom-built, estudamos nas respostas inflamatórias in vivo pós-reperfusão. A lógica por trás do desenvolvimento desta técnica é ampliar a compreensão de como leucócitos responder a uma lesão IR pele.

Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes

Aqui descrevemos um modelo murino diabético romance utilizando camundongos sem pelos para monitoramento em tempo real, não-invasivo, de infecções de ferida biofilme bioluminescentes Pseudomonas aeruginosa. Esse método pode ser adaptado para avaliar a infecção de outras espécies bacterianas e microrganismos geneticamente modificados, incluindo várias espécies biofilmes e testar a eficácia das estratégias de antibiofilm.

Venha para o lado da luz: In Vivo monitoramento de infecções por Pseudomonas aeruginosa biofilme em feridas crônicas em um modelo murino Hairless diabética

Uma abordagem é descrita para a detecção em tempo real da resposta imune inata de ferimento cutâneo e Staphylococcus aureus infecção de ratos. Por LysM-EGFP comparando os ratos (que possuem fluorescentes neutrófilos) com um LysM-EGFP mestiços cepa de rato imunodeficientes, avançamos nossa compreensão da infecção e o desenvolvimento de abordagens para combater a infecção.

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

O objetivo deste protocolo é induzir a produção transitória in vivo de níveis não letais de espécies reativas de oxigênio (EROs) na pele de camundongos, promovendo ainda mais respostas fisiológicas no tecido.

Estimulação de nichos de células-tronco e regeneração tecidual em pele de camundongo por fotogeração dependente de protoporfirina IX comutável de espécies reativas de oxigênio in situ

O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo murino de cicatrização de feridas queimadas. Uma queimadura térmica foi induzida na pele dorsal de camundongos usando um modelo de latão pré-aquecido. Tecido queimado foi desbridado e sobreposto com um enxerto de pele colhido da cauda de um rato doador geneticamente semelhante.

Um modelo murino de uma ferida de queimadura reconstruída com um enxerto de pele aogenética

O presente protocolo descreve um método para detectar espécies reativas de oxigênio (ROS) nos organoides murinas intestinais utilizando imagens qualitativas e ensaios quantitativos de citometria. Este trabalho pode ser potencialmente estendido a outras sondas fluorescentes para testar o efeito de compostos selecionados em ROS.

Analisando o estresse oxidativo em organoides intestinais murinos usando sonda fluorogênica sensível à espécie de oxigênio reativa

Aprenda a imagem quimioluminescente de espécies reativas de oxigênio em feridas murinas usando L-012. Este método não invasivo permite monitorar ROS em tempo real para estudar regeneração tecidual.

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

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