Microfluidic ensaio para a avaliação da adesão de leucócitos ao humano Induced Pluripotent células-tronco derivadas de células endoteliais (ECs-hiPSC)

Este protocolo passo a passo fornece uma descrição detalhada da instalação experimental e análise de dados para a avaliação das respostas inflamatórias em hiPSC-ECs e a análise da adesão de leucócitos sob fluxo fisiológico.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de biologia de células-tronco pluripotentes humanos sobre a funcionalidade e respostas inflamatórias das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece uma descrição detalhada da configuração experimental e análise de dados para a avaliação da adesão de leucócitos às células endoteliais derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem. Para revestimento de chip microfluido, coloque um biochip estéril em uma placa de Petri estéril de 10 centímetros e use uma ponta de pipeta de 10 microlitrados para injetar 10 microlitrais de solução de trabalho de fibronectina recém-preparada em cada canal do biochip.

Cubra a placa de Petri e coloque-a em uma câmara umidificada durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, pré-aqueça o biochip em uma incubadora Celsius de 37 graus, e suspenda as células endoteliais derivadas de células-tronco induzidas por células-tronco induzidas por células-tronco colhidas de uma cultura celular 80 a 100% confluente na concentração desejada em um meio endotelial livre de soro de células endoteliais. Em seguida, aspire a solução de fibronectina de todos os canais do chip microfluido, e misture completamente as células para obter uma suspensão celular homogênea antes de usar uma ponta de pipeta de 10 microliteres para injetar seis microlitrais de células em cada canal.

Examine o biochip sob o microscópio para confirmar que as células são uniformemente distribuídas com uma alta densidade celular. Após 15 minutos a 37 graus Celsius, adicione 40 microliters de meio livre de soro de células endoteliais COMPLETOs nos reservatórios médios em ambos os lados de cada canal. E devolva o biochip à incubadora por uma hora.

Em seguida, adicione mais 50 microliters de células endoteliais sem soro completo nos reservatórios em ambos os lados de cada canal. Para imagens ao vivo das células semeadas, confirme que as configurações microfluidas estão prontas, que a câmara de imagem ao vivo está equilibrada a 37 graus Celsius, e que o nível de CO2 atingiu 5% Coloque o biochip no suporte do chip de microscópio e monte o suporte do chip no estágio de imagem do microscópio. Para conectar o biochip à bomba através do coletor, coloque o adaptador de oito pinos perto dos reservatórios de saída do chip e aprofunde todos os pinos no meio sem conectar completamente os pinos.

No software de bomba microfluida, selecione Washout/Connect para chip e clique em Executar etapa de ensaio para distribuir 30 microliters de meio RPMI através de cada pino. Em seguida, insira o adaptador de oito pinos na saída do biochip. Use uma pipeta para aspirar manualmente o meio de todos os reservatórios de entrada do biochip, e selecione Washout/Chip Washout e Run Assay Step para perfuse um canal de cada vez com 40 microliters de células endoteliais sem soro full para remover quaisquer células mortas e detritos.

Quando todos os canais tiverem sido lavados substitua o meio do reservatório de entrada do canal de interesse por 100 microlitadores de leucócitos humanos diluídos para 2,5 vezes 10 às seis células por concentração mililitro no meio RPMI. Clique na descrição do ensaio/passo da célula e defina a descrição atual do canal/passo e defina o canal de interesse para On e os outros sete canais para Off. Selecione a descrição do passo do ensaio celular e clique em Executar etapa de ensaio.

Substitua os leucócitos restantes no reservatório de entrada por 100 microliters de meio RPMI completo. E clique na descrição cell assay step e executar passo de ensaio para perfundir o canal por cinco minutos com meio RPMI para remover quaisquer leucócitos não aaderientes. Em seguida, adquira imagens de pelo menos três a quatro posições diferentes no canal para visualizar os leucócitos aderidos.

Para quantificar os leucócitos aderentes, abra o software de processamento de imagens CellProfiler e importe o arquivo Count Leukocytes Pipeline. Em módulos de entrada, selecione Imagens e arraste e solte a pasta com as imagens brutas dos leucócitos aderentes à janela Lista de arquivos. Em Análise, os módulos selecionam Identificar Objetos Primários e indicam os diâmetros mínimos e máximos dos leucócitos aderentes em pixels.

Em análise, os módulos selecione FilterObjects. Em seguida, selecione os critérios de filtragem e digite a área minimamente aceita dos objetos em pixels e clique em Analisar imagens para iniciar a análise. A dissociação de células-tronco pluripotentes pluripotentes induzidas pelo homem deve resultar em uma única suspensão celular livre de aglomerados celulares.

Normalmente, 15 minutos após a injeção as células endoteliais se anexarão à parte inferior do canal e começarão a se espalhar. Dentro de uma hora da injeção, as células endoteliais devem formar uma monocamada bem espalhada pelo canal, momento em que estão prontas para uso no ensaio Flow. O uso do software gratuito de processamento de imagens de código aberto, como demonstrado, permite a filtragem de objetos identificados com base em uma área mínima e a exclusão de objetos falsamente identificados, como detritos celulares, autofluorescência ou qualquer outro sinal fluorescente inespecífico.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de otimizar a estimulação com citocinas pró-inflamatórias e incluir as células endoteliais da veia umbilical humana primária como um controle positivo. Não se esqueça que trabalhar com células primárias de mamíferos e linhas celulares pode ser extremamente perigoso e que precauções como usar casaco de laboratório, luvas e proteção ocular devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.