Manipulação e avaliação da cultura de organoides humano de próstata primário

Organoides de próstata são um sistema in vitro excitante para estudar desenvolvimento e doenças. Eles superam desafios das linhas celulares imortalizadas e oferecem uma alternativa barata aos modelos animais. Elas podem ser cultivadas a partir de células da próstata humana, como mostramos neste protocolo, bem como células de próstata de camundongos, como um sistema de modelo pré-clínico relevante para a doença.

Muitos laboratórios descreveram métodos de cultura úteis e pontos finais. Mas esperamos reunir esses detalhes em um protocolo e demonstrar os passos particularmente desafiadores para novos usuários. À medida que as técnicas melhoram, os organoides do câncer de próstata podem ser cultivados a partir de amostras de pacientes como uma abordagem de medicina de precisão para modelar doenças e responder às terapias.

As condições de cultura são específicas para organoides de próstata, porém muitos dos pontos finais foram adaptados de outros tipos de tecidos. Um usuário poderia adaptar partes deste protocolo ao seu tipo de interesse celular. Inicie este experimento cultivando células epiteliais em placas de 96 poços codificadas em gel matricial, conforme descrito no manuscrito.

Para coletar organoides das placas após 12 dias, remova o meio dos poços sem perturbar o gel de matriz. Em seguida, adicione imediatamente aproximadamente 200 microliters de protease neutra a cada poço em cerca de uma proporção de um a dois de gel de matriz para protease neutra. Incubar a placa por 20 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, pipeta para cima e para baixo para dissociar mecanicamente a mistura, e incubar novamente por 20 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, transfira a mistura neutra de células de gel da matriz protease de alguns poços para um tubo de microcentrifuuge. Pelota as células por centrifugação a 300 vezes g por três a cinco minutos.

Remova o supernatante e guarde a pelota organoide para análises subsequentes. Para criar moldes para incorporar, corte uma pequena seção de uma ponta de pipeta de 1.000 microliteres para fazer um cilindro que contém 50 microliters. Em seguida, a partir da parte mais larga da mesma ponta, faça um segundo molde mais largo que se encaixa em torno do primeiro molde.

Para criar um bloco frio, enrole uma embalagem de gelo com fita adesiva para cima. Em seguida, adere os moldes perpendicularmente à fita. Para incorporar os organoides em um plugue de gel de histologia para processamento, primeiro lave a pelota organoide obtida anteriormente com um mililitro da Solução de Sal Balanceado de Hank.

Depois de centrifugar a 300 vezes g por três a cinco minutos, remova o supernatante. Em seguida, adicione 30 a 50 microliters de gel de histologia líquida à pelota organoide, e misture suavemente, pipetando lentamente para cima e para baixo para resuspensar a pelota. Transfira essa mistura para um molde no bloco frio e deixe que o espécime esfrie e solidifique em um plugue.

Em seguida, use um êmbolo para empurrar o plugue para fora do molde pequeno e para o centro do molde maior, e preenchê-lo por pipetting claro 2% ágar ao redor do plugue. Para marcar o topo da amostra, pipeta histologic dye-tinted 2% ágar em cima do plugue. Uma vez que o ágar tenha esfriado, use um êmbolo para transferir o plugue para um de histologia.

Rotule o com um lápis e coloque-o em formalina tamponada 10% neutra para fixação durante a noite. No dia seguinte, transfira o de formalina tamponada 10% neutra para 70% de etanol histológico, e processe-o ainda mais e incorpore em parafina. Comece aparando a base do bloco com uma espessura de 10 micrômetros.

Uma vez que uma seção que contenha a área do plugue apareça, pare de aparar. Bloqueie o rotor de microtome e transfira o bloco de volta para o gelo para esfriar. Mova a lâmina para uma nova porção não utilizada.

E transfira o bloco de volta para o grampo. Desbloqueie a máquina e comece a aparar a cinco micrômetros por seção. Use pinças para transferir a seção para o banho de água Celsius de 40 graus e deixe que ela se espalhe.

Mergulhe um slide verticalmente na água para transferir a seção para ela. Em seguida, observe o slide sob um microscópio de campo brilhante para garantir que um organoide esteja presente na seção. Asse durante a noite a 45 a 50 graus Celsius, e depois prossiga com a coloração como descrito no manuscrito.

Inicie esta parte do experimento com poços nãousados da placa revestida de gel de matriz de 96 poços com organoides. Ao se desargar contra o lado do poço, deixando espaço entre a mídia e o gel de matriz, remova cuidadosamente o máximo de mídia possível sem interromper a cultura organoide. Use uma ponta de pipeta de 1.000 microliter aparada, pré-molhada com PBS para elaborar uma gota de gel de matriz que contenha os organoides de interesse.

Dispense a gota no meio de um deslizamento de câmara. A olho nu, aspire o excesso de mídia e gel de matriz do slide da câmara usando uma pipeta de ponta fina. Promover a adesão organoide ao vidro e evitar a perda de amostras durante as etapas subsequentes de lavagem.

Coloque o slide em uma incubadora de 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos. Pipetando lentamente para evitar o desprendimento do prato, adicione 200 microliters de 1X PBS para lavar os organoides por cinco minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Remova cuidadosamente o PBS 1X e adicione 200 microliters de 4%de paraformaldeído.

Fixar por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. Na PFA, lave e prossiga com etapas subsequentes de permeabilização e coloração, conforme descrito por este protocolo. Monte e imagem imediatamente.

Slide recém-cortado não manchado mostra claramente organoides primários da próstata humana, enquanto em deslizamento seco não manchado, organoides parecem translúcidos e são mais difíceis de detectar sob um microscópio de campo brilhante. A hematoxilina e a coloração de eosina mostram um organoide de próstata primário humano quebrado por manipulação incorreta, como pipetação agressiva, protocolo de processamento errado em comparação com um organoide bem manuseado. O organoide de próstata primário humano foi formado, embutido em parafina, seccionado e manchado com citokeratina basal 5 e citokeratin luminal 8, p63 basal e citokeratina luminal 8, e imageado com microscópio confocal.

Um organoide de próstata primário humano montado inteiro foi manchado com citokeratina basal 5 ou citokeratina luminal 8, e contra-manchado com falitina e DAPI, e imageado com microscópio confocal. Um organoide de células primárias da próstata foi manchado com Edu rotulado fluorescentemente e contra-manchado com Hoescht, e imageado com microscópio confocal. É importante visualizar seus organoides durante todo o procedimento.

Depois de coletar as seções, certifique-se de visualizar as amostras no slide e certifique-se de observar organoides durante a montagem total. Depois de coletar os organoides do gel de matriz, você pode montá-los inteiros e usar ensaios comerciais, ou dissociar-se a células únicas para citometria de fluxo ou sequenciamento de células únicas. A cultura 3D fornece aos pesquisadores uma nova maneira de estudar tecido na configuração de um prato de laboratório.

Pode ser aplicado à organogênese, ou à compreensão da patologia da doença de um paciente. Ao trabalhar com amostras de pacientes, sempre tenha cuidado e manuseie os materiais como potencial para exposição ao patógeno transmitido pelo sangue.