Name: Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Aprenda a quantificar proteínas em regiões cerebrais de roedores usando imunohistoquímica com corantes infravermelhos próximos e varredura de alta resolução. Este método simplificado permite analisar vias de sinalização molecular e marcadores cognitivos.

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A pesquisa neste relatório foi financiada por uma subvenção-alvo dos NIGMS (1P20GM103653) concedido à DK.

O seguinte protocolo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de Delaware. Os ratos masculinos de Sprague Dawley aproximadamente 55 – 75 dias velhos foram usados para este protocolo.
1. extração cerebral e preparação de tecidos
<ol><li>Anestesie o rato com isoflurano na câmara de indução anestésica até que o rato não apresente mais uma resposta à pinça do pé.</li>
	<li>Sacrifique ratos através da decapitação rápida usando uma guilhotina.</li>
	<li>Corte a pele no crânio posterior ao anterior e desobstruído da parte superior do crânio.</li>
	<li>Use rongeurs para remover cuidadosamente a parte de trás do crânio, e, em seguida, usando pequenas tesouras de dissecação cortar Midline do crânio, empurrando para cima contra o topo do crânio em todos os momentos para evitar danificar o tecido cerebral.</li>
	<li>Use rongeurs para descascar afastado a metade direita e esquerda do crânio para expor o cérebro.</li>
	<li>Use uma espátula pequena para colher o cérebro e cortar os nervos, cuidadosamente elevar cérebro e congelar cérebros em isopentano refrigerados em gelo seco (pelo menos-20 ° c). Depois disso, armazene cérebros em um freezer de-80 ° c até fatiar.</li>
	<li>Corte cérebros em regiões de interesse em 30 – 50 μm em um criostat mantido entre-9 ° c e-12 ° c. Diretamente montar fatias em lâminas de vidro e armazenar em um-80 ° c freezer até o momento do ensaio Immunocytochemistry. Nota: Neste protocolo, as regiões cerebrais de interesse foram o hipocampo e a amígdala.</li>
</ol>2. única reacção imuno-histoquímica
Nota: Para a reação immunohistochemical dobro, o protocolo é o mesmo que a única reação immunohistochemical exceto esta reação tem dois anticorpos preliminares de anfitriões diferentes (por exemplo, coelho e rato) e dois anticorpos secundários para o correspondente primárias devem ser de um único hospedeiro (por exemplo, anticoelho de cabra e antimouse de cabra). Os anticorpos secundários também têm de ser de dois espectros diferentes que estão disponíveis em scanners de alta resolução. Por exemplo, um anticorpo secundário com um pico de espectro de emissão a 680 nm e um anticorpo secundário 800CW (pico de espectro de emissão a 780 nm).
<ol><li>Retire as lâminas de vidro do congelador e deixe equilibrar a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>uma capa de fumaça, corrigir o tecido cerebral em 4% paraformaldeído em 0,1 M fosfato tampão salino (PBS) para 1 − 2 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Enxágüe slides em 0,1 M Tris tampão salina (TBS) três vezes por 10 min cada. Permeabilize as membranas celulares incubando lâminas em detergente neutro (por exemplo, 0, 1% detergente) por 30 − 60 min.</li>
	<li>Enxague as lâminas em TBS três vezes por 15 min cada.</li>
	<li>Diluir o anticorpo preliminar para a proteína do interesse em PBS na concentração correta. Por exemplo, para detectar o gene adiantado imediato c-fos, prepare um anticorpo preliminar do anti c-fos do coelho em uma concentração de 1:500.</li>
	<li>Pipeta a solução preliminar do anticorpo diretamente no tecido de cérebro (aproximadamente 200 μL por 3 polegadas x 1 polegada de corrediça).</li>
	<li>Use coberturas para incubar o tecido cerebral em lâminas de vidro na diluição de anticorpos primários para 1 − 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite (~ 17 h) a 4 ° c.</li>
	<li>Remova as coberturas e lave as lâminas em TBS que tem uma pequena quantidade de detergente adicionado a ele (por exemplo, 0, 1% detergente, "TBS-T") quatro vezes por 15 min cada.</li>
	<li>Use coberturas para incubar seções cerebrais em um anticorpo secundário à temperatura ambiente por 2 h. Nota: O anticorpo secundário tem que ser à diluição correta e em um diluente que contem TBS, detergente, e 1,5% do soro do anfitrião. Por exemplo, um anticorpo secundário de cabra numa diluição de 1:2000 conterá 1,5% de soro de cabra e 0, 5% de detergente.</li>
	<li>Enxague as lâminas em TBS-T quatro vezes por 20 min cada, e depois em TBS quatro vezes por 20 min cada.</li>
	<li>Escorregas secas à temperatura ambiente no escuro durante a noite. Quando os slides estão secos, eles estão prontos para a imagem.</li>
</ol>3. imagem latente
<ol><li>Coloque os slides na interface de digitalização de infravermelho próximo com o tecido voltado para baixo. Qualquer imagem um slide de vidro ou slides múltiplos de cada vez usando uma ferramenta de seleção.</li>
	<li>Slides de imagem usando a configuração da mais alta qualidade com um deslocamento de 0 nm e uma resolução de 21 μm. A digitalização normalmente levará 13 − 19 h, dependendo do equipamento de digitalização utilizado.</li>
	<li>Importe imagens para o software de análise de imagem (por exemplo, ImageStudio) para ver e marcar para análise de proteínas Semiquantitativas.</li>
</ol>4. análise da expressão protéica
<ol><li>Abra o software de análise de imagem e selecione a área de trabalho na qual a imagem foi digitalizada.</li>
	<li>Abra a imagem digitalizada no software de análise de imagem para visualizar a digitalização e ajuste quais comprimentos de onda são visualizados, bem como o contraste, o brilho e a ampliação mostrados sem alterar a imagem bruta ou a emissão total quantificada.</li>
	<li>Identifique as regiões-chave para quantificação e selecione a guia análise ao longo da parte superior da página e selecione desenhar retângulo (ou desenhar elipse/desenhar à mão livre) para desenhar um retângulo sobre a área que será quantificada.</li>
	<li>Para exibir o tamanho do retângulo, selecione formas ao longo da parte inferior esquerda da tela e, em seguida, selecione colunas ao longo da parte inferior direita. Adicione colunas de altura e largura para identificar o tamanho da forma. Nota: É importante controlar o tamanho da forma ao comparar a quantificação. Recomenda-se o uso de formas idênticas colocadas dentro do local de quantificação desejado, a fim de obter uma amostragem exata das emissões para essa região.</li>
	<li>Em seguida, nomeie a forma e repita. Uma vez que todas as regiões são amostradas, os dados disponíveis na guia colunas podem ser agregados e analisados.</li>
</ol>

<ol><li>Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKandel%2C+ER+%22Principles+of+Neural+Science%22">Principles of Neural Science</a>. , McGraw Hill. New York. (2013).</li>
<li>Byrne, J. H., Roberts, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aByrne%2C+JH+%22From+Molecules+to+Networks%3A+An+Introduction+to+Cellular+and+Molecular+Neuroscience%22">From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience</a>. , Academic Press/Elsevier. (2009).</li>
<li>Salami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+D2%2F3+binding+potential+modulates+neural+signatures+of+working+memory+in+a+load-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion.</a> Journal of Neuroscience. , (2018).</li>
<li>Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+amygdaloid+corticotropin-releasing+hormone+%28CRH%29+mediate+anxiety-like+behaviors%3F+Dissociation+of+anxiogenic+effects+and+CRH+release%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release.</a> European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).</li>
<li>English, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+mouse+hippocampus+profiled+by+LC-MS%2FMS+for+label-free+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation.</a> Data in Brief. 7, 341-343 (2016).</li>
<li>David, M. A., Tayebi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein+aggregates+in+brain+and+cerebrospinal+fluid+derived+from+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients.</a> Frontiers in Neurology. 5, 251(2014).</li>
<li>Oliver, C., Jamur, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. , (2010).</li>
<li>Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescent+cells+in+rat+brain+can+be+convincing+impostors+in+green+fluorescent+reporter+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-Jun+to+identify+fear+extinction+learning-specific+patterns+of+neural+activity+that+are+affected+by+single+prolonged+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Researach%22%5BJournal%5D)">Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress.</a> Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).</li>
<li>Knox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+via+which+single+prolonged+stress+exposure+leads+to+fear+extinction+retention+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits.</a> Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).</li>
<li>Malinow, R., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).</li>
<li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. The Annual Delaware Neuroscience Research and Poster Symposium, Newark, DE, , (2018).</li>
<li>Eagle, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+prolonged+stress+enhances+hippocampal+glucocorticoid+receptor+and+phosphorylated+protein+kinase+B+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels.</a> Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Os resultados apresentados neste artigo mostram que o Immunocytochemistry próximo-infravermelho em combinação com a exploração de alta resolução pode ser usado para obter medidas Semiquantitativas da expressão da proteína no tecido de cérebro. Ele também pode ser usado para rotular duas proteínas simultaneamente na mesma região do cérebro. Nós usamos previamente immunohistochemistry próximo-infravermelho para medir a expressão adiantada imediata do gene em regiões múltiplas do cérebro9,10</su...

O estudo da neurociência diz respeito a uma investigação de como as células do cérebro mediam funções específicas1. Estes podem ser de natureza celular, como a forma como as células glia conferem imunidade no sistema nervoso central ou podem envolver experimentos que visam explicar como a atividade dos neurônios no hipocampo dorsal leva à navegação espacial. Em um sentido amplo, a função celular é determinada pelas proteínas que são expressas em uma célula e a atividade dessas proteínas2. Como resultado, medir a expressão e/ou atividade de proteínas nas células cerebrais são críticas para o estudo da neurociência.
Um número de técnicas estão disponíveis para medir a expressão da proteína no cérebro. Estes incluem métodos in vivo, como topografia de emissão de pósitrons para densidades de receptores3 e microdiálise para pequenos peptídeos4. Mais comumente, os métodos ex vivo são usados para examinar a função e a expressão protéica. Estes incluem técnicas de espectrometria de massas5, Western blot e ensaio imunoenzimático (ELISA)6, e Immunocytochemistry7. Immunocytochemistry é amplamente utilizado no campo da neurociência. Esta técnica envolve o uso de um anticorpo preliminar para detectar uma proteína (ou o antígeno) do interesse (por exemplo, c-fos) e um anticorpo secundário conjugado para detectar o complexo proteína-preliminar do anticorpo (Figura 1). Para permitir a deteção do complexo anticorpo-secundário da proteína-preliminar do Antibody, os anticorpos secundários têm agentes oxidantes tais como o peroxidase do rábano (HRP) conjugados a eles. Isso permite a formação de precipitados em células que podem ser detectadas por meio de microscopia de luz7. Os anticorpos secundários podem igualmente ter fluorescência dos produtos químicos conjugados a eles (isto é, Fluorophores). Quando estimulados estes produtos químicos emitem a luz, que pode ser usada para detectar complexos anticorpo-secundários proteína-primários do anticorpo7. Por fim, os anticorpos primários, por vezes, têm agentes redutores e produtos químicos de fluorescência anexados a eles, negando diretamente a necessidade de anticorpos secundários7 (Figura 1).
Curiosamente, muitos métodos Immunocytochemistry permitem a visualização de proteínas em células cerebrais, mas não a capacidade de quantificar a quantidade de proteína em uma determinada região da célula ou do cérebro. Usar a microscopia de luz para detectar precipitados das reações da redução permite o visualização dos neurônios e do glia, mas este método não pode ser usado para quantificar a expressão da proteína nas pilhas ou em uma região específica do cérebro. Na teoria, a microscopia de fluorescência pode ser usada para esta, porque a luz emitida do anticorpo secundário fluorescente é uma medida do complexo anticorpo-secundário proteína-preliminar do anticorpo. No entanto, a autofluorescência no tecido cerebral pode dificultar a utilização da microscopia de fluorescência para quantificar a expressão protéica no tecido cerebral8. Em conseqüência, a luz emitida das imagens fluorescentes do tecido de cérebro é usada raramente para quantificar a expressão da proteína no cérebro.
Muitas destas edições podem ser endereçadas usando Immunocytochemistry near-infrared conjuntamente com a exploração de alta resolução9,10. Neste artigo, nós descrevemos como o Immunocytochemistry acoplado com os fluoróforos nos espectros de emissão do próximo-infravermelho pode ser combinado com a exploração de alta resolução (por exemplo, 10 – 21 μm) para obter as imagens afiadas que permitem a semiquantificação da proteína em distinto regiões cerebrais.

Câmara de indução de <table><tbody>anestesia <tr><td>de extração</td><td></td><td></td><td></td>cerebral</tr><tr><td></td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-0530SM</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Guillotine</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-1920</td><td></td></tr><tr><td>Friedman Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16000-14</td><td>usado para remover a parte de trás do crânio</td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação delicada</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-951-5</td><td>usado para cortar para cima ao longo da linha média do crânio</td></tr><tr><td>Micro Espátula</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-5</td><td>usado para retirar o cérebro</td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio de Vidro</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-549-6</td><td></td></tr><tr><td>Reação</td><td></td><td></td><td></td> Imunohistoquímica</tr><tr><td>&nbsp; Triton X-100</td><td></td><td></td><td>Usado como detergente suave para permeabilizar células após fixação em Paraformaldeído, também usado como detergente suave em combinação com soro do hospedeiro e anticorpo secundário&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td></td><td></td><td>Usado como uma pequena quantidade de detergente adicionado ao TBS&nbsp; para processar TBS-T após lâminas de lamínula com anticorpo primário</td></tr><tr><td>Scanner Licor Odyssey</td><td>Licor Biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estúdio de Imagem</td><td>Licor Biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor

Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain

A neurociência é o estudo de como as células do cérebro mediam várias funções. A expressão da proteína de medição nos neurônios e na glia é fundamental para o estudo da neurociência, pois a função celular é determinada pela composição e atividade das proteínas celulares. Neste artigo, nós descrevemos como Immunocytochemistry pode ser combinado com a exploração de alta resolução infravermelho próximo para fornecer uma medida semiquantitativa da expressão da proteína em regiões distintas do cérebro. Esta técnica pode ser usada para a única ou expressão dobro da proteína na mesma região do cérebro. A medição de proteínas desta forma pode ser usada para obter uma mudança relativa na expressão protéica com uma manipulação experimental, assinatura molecular de aprendizado e memória, atividade em vias moleculares e atividade neural em várias regiões cerebrais. Usando as proteínas corretas e a análise estatística, a conectividade funcional entre as regiões cerebrais também pode ser determinada. Dada a facilidade de implementação de imunocitoquímica em um laboratório, usando Immunocytochemistry com varredura de alta resolução infravermelho próximo pode expandir a capacidade do neurocientista para examinar os processos neurobiológicos em um nível de sistemas.

Antes de usar a varredura de alta resolução para immunohistochemistry, uma deve verificar que o protocolo trabalha. Isto pode ser conseguido usando um ensaio de validação onde seções cerebrais do mesmo animal são incubadas com anticorpos primários e secundários, anticorpo secundário sozinho, ou nenhum anticorpo primário ou secundário. Os resultados para tal ensaio de validação são mostrados na Figura 2. Nesta reação nós estávamos detectando o gene adiantado i...

Aqui, nós apresentamos um protocolo que use tinturas near-infrared conjuntamente com a exploração immunohistochemistry e de alta resolução às proteínas do ensaio em regiões do cérebro.

Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor

Neuroscience is the study of how cells in the brain mediate various functions. Measuring protein expression in neurons and glia is critical for the study ...

Este protocolo é significativo porque permite a quantificação de duas proteínas na mesma região cerebral. Isso permite que o experimentador olhe para a atividade em vias de sinalização molecular em regiões cerebrais, ensaio pan e fosfoproteínas. Também pode ser usado para avaliar proteínas que são marcadores de diferentes fenômenos cognitivos.Estamos usando uma técnica relativamente simples, como a imunohistoquímica, para responder a perguntas que normalmente requerem técnicas mais envolvidas. Incluindo examinar a atividade das vias de sinalização molecular, examinando a razão AMPA/NMDA. Usando um criostat mantido entre menos 9 graus Celsius e menos 12 graus Celsius, corte cérebro de rato anteriormente isolado e congelado em regiões de interesse a 30-50 micrômetros.Monte diretamente fatias em lâminas de vidro e armazene a menos 80 graus Celsius até a imunocitoquímica. Retire os slides de vidro do congelador e deixe-os equilibrar a temperatura ambiente por 30 minutos. Trabalhando sob um capô de fumaça, coloque os slides em 4% de paraformaldeído em PBS molar de 0,1 por uma a duas horas em temperatura ambiente para fixação tecidual.Em seguida, enxágue os slides em 0,1 TBS molar três vezes por 10 minutos cada. Para permeabiliar as membranas celulares, incubar as lâminas em um detergente suave por 30-60 minutos. E enxágue novamente em TBS três vezes por 15 minutos cada.Diluir o anticorpo primário para proteína de interesse na PBS na concentração correta, conforme descrito no manuscrito. Solução de anticorpos primários pipeta diretamente no tecido cerebral. Coloque deslizamentos de cobertura nas lâminas e incubar o tecido cerebral na diluição de anticorpos primários por 1-2 horas à temperatura ambiente.Após a incubação, remova os deslizamentos de cobertura e lave os slides em TBS que tem uma pequena quantidade de detergente adicionado a ele, quatro vezes por 15 minutos cada. Diluir o anticorpo secundário em um diluído contendo TBS, detergente e 1,5% do soro hospedeiro. Adicione anticorpos secundários aos slides, cubra com deslizamentos de cobertura e incubar à temperatura ambiente por duas horas.Após a incubação, enxágue os slides em TBS-T quatro vezes por 20 minutos cada e, em seguida, em TBS quatro vezes por 20 minutos cada. Seque os slides à temperatura ambiente no escuro, durante a noite. Coloque slides na interface de varredura infravermelha próxima com o tecido voltado para baixo.Imagem vários slides de cada vez usando a ferramenta de seleção. Imagem os slides usando a configuração de mais alta qualidade com uma resolução de 21 micrômetros. Em uma compensação de zero nanômetros, importe imagens em software de análise de imagem para visualizar e marcar para análise de proteínas semiquantitativas.Após abrir o software de análise de imagens, selecione a área de trabalho em que a imagem foi digitalizada. Em seguida, abra a imagem digitalizada no software de análise de imagem para visualizar a varredura e ajustar comprimentos de onda, contraste, brilho e ampliação mostrados sem alterar a imagem bruta ou a emissão total quantificada. Depois de identificar as regiões-chave para quantificação, selecione a guia de análise ao longo da parte superior da página e selecione desenhar retângulo para desenhar um retângulo sobre a área que será quantificada.Para visualizar o tamanho do retângulo, selecione formas ao longo da parte inferior esquerda da tela. Em seguida, selecione colunas ao longo da parte inferior direita. Em seguida, adicione colunas de altura e largura para identificar o tamanho da forma.Por fim, nomeie a forma e repita. Uma vez que todas as regiões sejam amostradas, proceda à combinação e análise dos dados disponíveis na guia colunas. Para verificar se esse protocolo funciona, as seções cerebrais foram incubadas com anticorpos primários e secundários, apenas anticorpos secundários, ou nem anticorpos primários nem secundários.A expressão c-jun do gene c-jun foi detectada no hipocampo dorsal e amígdala somente quando ambos os anticorpos primários e secundários foram aplicados no tecido cerebral. A sub-unidade GluR1 do receptor AMPA e a sub-unidade NR2A do receptor NMDA foram avaliadas na detecção de proteínas de fezes nos núcleos de amígdala. Isso permitiu examinar a proporção de receptores AMPA NMDA em subnucleos da amígdala que é uma assinatura neurobiológica de aprendizagem e memória.Medidas médias e normalizadas de expressão proteica foram obtidas a partir de escaneamentos de alta resolução no hipocampo ventral. Utilizando o software de análise de imagem, um retângulo é colocado na região de interesse e a intensidade média da luz da forma foi usada como medida de expressão fluorófora, que é uma medida de expressão proteica. Para obter a curva normalizada, foi colocada uma forma em uma região que expressa alto sinal e baixo sinal na área sob a curva foi utilizado como medida de expressão proteica.A maior luta com este procedimento é encontrar um anticorpo e garantir que ele funcione. A aplicação é simples. Meu conselho seria primeiro tentar um procedimento imunohistoquímico regular, depois tentar essa técnica.Sempre realizando um ensaio de validação primeiro. A coisa mais importante a se lembrar é verificar a diluição do anticorpo e certificar-se de que ele é aplicado corretamente. Sem essas etapas, o procedimento falhará.

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós descrevemos um método rápido e simples de células de imagem fluorescente etiquetado em fatias grossas semi-cérebro. Através da fixação, corte, limpeza e opticamente tecido cerebral descrevemos como imagens de epifluorescência ou confocal padrão pode ser usado para visualizar as células individuais e redes neuronal no tecido nervoso intacto.

Uma abordagem rápida para alta resolução de imagem de fluorescência em fatias grossas Semi-Cérebro

Este vídeo demonstra a coloração por imunofluorescência de uma fatia de cérebro de camundongo para quantificar a distribuição de uma proteína pré-sináptica específica. O processo envolve o bloqueio de locais inespecíficos, a aplicação de anticorpos primários para a proteína-alvo e um marcador de referência, seguido pela marcação de anticorpos secundários e contracoloração nuclear. O marcador de referência garante uma quantificação precisa, fornecendo uma linha de base consistente, e a...

Quantificando a distribuição de uma proteína pré-sináptica no cérebro de camundongos usando imunofluorescência

Fonte: Jolly, S., et.al. Combinando hibridização de fluorescência dupla  in situ com imunomarcação para detecção da expressão de três genes em seções cerebrais de camundongos. J. Vis. Exp. (2016). Este vídeo demonstra o uso de hibridização in situ de fluorescência dupla para visualizar a expressão de dois alvos de RNA em seções cerebrais de camundongos. O protocolo envolve a detecção sequencial de RNA usando sondas marcadas com isotiocianato de fluoresceína e digoxigenina, seguida de...

 Realizando hibridização in situ de fluorescência dupla para detectar a expressão gênica em seções cerebrais de camundongos

Source: Kimmelmann-Shultz, B., et. al. Usando fluorescência de infravermelho próximo e varredura de alta resolução para medir a expressão de proteínas no cérebro de roedores. J. Vis. Exp. (2019) Este vídeo demonstra uma fluorescência de infravermelho próximo e um método de varredura de alta resolução para medir a expressão de proteínas no cérebro do roedor.

Medindo a expressão de proteínas no cérebro de roedores usando fluorescência de infravermelho próximo e varredura de alta resolução 

Fonte: Lacin, E., et al. Construção de Repórteres de Engenharia Fluorescente de Neurotransmissores Baseados em Células (CNiFERs) para Detecção Óptica de Neurotransmissores In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra uma técnica para obter imagens da liberação de neurotransmissores in vivo usando repórteres de engenharia fluorescente de neurotransmissores baseados em células (CNiFERs), células repórter especializadas pré-injetadas no córtex de camundongo. Posicionado sob um microscópio de...

Liberação de neurotransmissores de imagem usando repórteres de engenharia fluorescente de neurotransmissores baseados em células

O objetivo deste protocolo é usar a técnica de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para classificar tipos específicos de células neurais para análise subsequente da expressão gênica específica do tipo de célula, marcadores epigenéticos e/ou expressão de proteínas.

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

Este vídeo mostra o procedimento de craniotomia que permite imagens crônicas de neurônios no córtex retroesplenial de camundongos usando microscopia in vivo de dois fótons na linha transgênica Thy1-GFP. Essa abordagem é combinada com a injeção de vírus adeno-associado que expressa mCherry no hipocampo dorsal. Essas técnicas permitem o monitoramento de longo prazo da plasticidade estrutural dependente da experiência em RSC.

Simultânea de dois fótons<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Synaptic Entradas e metas pós-sinápticos no córtex do rato retrosplï¿½ico

Este protocolo descreve as etapas necessárias para obter resultados de localização Subcellular da proteína na retina de zebrafish, correlacionando a microscopia de luz super resolução e imagens de microscopia eletrônica de varredura.

Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish

Aqui, descrevemos uma abordagem quantitativa para determinar a distribuição de uma proteína sináptica em relação uma proteína de marcador usando a mancha da imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador.

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

Este protocolo é projetado para quantificar eficientemente a atividade do sistema de ubiquitina-proteasome (UPS) em diferentes compartimentos celulares do cérebro de roedores. Os usuários podem examinar o funcionamento da UPS em frações nucleares, citoplasmáticas e sinápticas no mesmo animal, reduzindo a quantidade de tempo e o número de animais necessários para realizar essas análises complexas.

Quantificando a ubiquitina subcelular-atividade de proteasome no cérebro de roedores

Relatamos um ensaio simples, eficiente e de alta produtividade baseado em espectroscopia de fluorescência para a quantificação de filamentos de actina em amostras biológicas ex vivo de tecidos cerebrais de roedores e seres humanos.

Um ensaio baseado em espectroscopia de fluorescência com eficiência temporal para avaliar o status de polimerização de actina em roedores e tecidos cerebrais humanos

Aprenda a quantificar proteínas em regiões cerebrais de roedores usando imunohistoquímica com corantes infravermelhos próximos e varredura de alta resolução. Este método simplificado permite analisar vias de sinalização molecular e marcadores cognitivos.

Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor

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