Injeção intratorácica para o estudo do coração de zebrafish adulto

Na pesquisa cardíaca sobre zebrafish adulto, os tratamentos medicamentosos geralmente são feitos de forma sistêmica. Com injeção intratorácica, pode-se fornecer solução localmente ao coração sem causar danos ao miocárdio. Este método permite a entrega de pequenos volumes de drogas, proteínas ou outras moléculas em solução precisamente ao redor do coração de um zebrafish adulto.

Para iniciar este procedimento, use um puxador de agulha para puxar capilares de vidro borosssilicato adaptados à microinjeção. Armazene os capilares puxados em uma placa de Petri de nove centímetros com trilhos de argila de modelagem ou fita adesiva. Usando uma tesoura comum, corte um pedaço de esponja e esculpe uma silhueta semelhante a um peixe no meio.

Em seguida, prepare pequenas alíquotas das soluções de injeção com as proteínas testadas ou outros compostos. Ajuste sua concentração dependendo do ensaio diluindo a substância na solução de sal balanceada 1x Hanks complementada com 10% de fenol vermelho. Para obter a concentração de trabalho de anestésicos, adicione dois a três mililitros de solução de estoque de tricaine a um béquer contendo 100 mililitros de água de peixe.

Primeiro, ligue o microscópio estéreo com a luz de cima e ajuste a ampliação para 16x. Mergulhe a esponja com água de peixe, e coloque-a em uma placa de Petri de nove centímetros no microscópio. Ajuste o foco e, sob o microscópio estéreo, use uma tesoura de iridectomia para cortar a extremidade de uma microcapillaria a aproximadamente sete milímetros da base, conforme detalhado na Figura 1A do protocolo de texto.

Insira o microcapilário de corte no suporte da agulha do aparelho microinjetor. Usando as pontas do Microloader, carregue uma solução de controle para configurar a pressão da injeção para obter o fluxo adequado e, em seguida, esvazie a agulha. Depois disso, carregue o volume selecionado da solução de injeção na ponta do capilar, certificando-se de que não há bolhas de ar.

Use uma rede para pegar um peixe adulto, e transfira-o para a solução anestéstica. Depois de um a dois minutos, quando o peixe parar de nadar e o movimento do operculum é reduzido, toque no peixe com uma colher de plástico para garantir que ele não reaja a nenhum contato. Em seguida, transfira o peixe de forma rápida e cuidadosa para o sulco da esponja molhada, com o lado ventral para cima.

A cabeça do peixe deve apontar para longe da mão dominante do operador. Sob o microscópio estéreo, observe cuidadosamente o movimento do coração batendo sob a pele do peixe. Determine visualmente o ponto de injeção acima do coração pulsante e no meio do triângulo, definido pelas placas cartilaginosas ventral.

Insira a ponta do capilar em um ângulo entre 30 e 45 graus em relação ao eixo do corpo. Penetre suavemente a pele com a ponta do microcapilário no pericárdio. Uma vez que a agulha esteja dentro do pericárdio, pressione o pedal do dispositivo microinjetor para completar a injeção.

Após a injeção, retire suavemente o capilar do tórax, e transfira imediatamente o peixe para um tanque com água do sistema para recuperação. Monitore os peixes até a recuperação total da anestesia. Para analisar os efeitos da injeção, colete o coração no ponto de tempo desejado e prepare-o para uma análise mais aprofundada.

Neste estudo, compostos e proteínas exógenas são entregues na cavidade pericárdia, a fim de estudar seus efeitos sobre o coração em zebrafish adulto. Para validar este método, dois experimentos de teste são realizados injetando cor e corantes fluorescentes em peixes eutanizados. Em ambos os ensaios, a análise de montagem inteira revela a rotulagem de todo o coração, incluindo o ventrículo, o átrio e o bulbo arteriosus.

Esses resultados revelam a disseminação eficiente das soluções de injeção na superfície do coração. Para comparar a adequação da injeção intratorácica versus injeção intraperitoneal para estudos cardíacos, uma quantidade semelhante de DAPI é injetada usando ambos os métodos. Os corações são então fixos após cinco minutos ou 120 minutos.

Nenhuma célula soropositivo é observada nos corações após injeção intraperitoneal em ambos os momentos. Em contraste, as injeções intratorácicas resultam na presença de núcleos rotulados pelo DAPI no miocárdio. Esses resultados demonstram que a injeção intratorácica melhora a entrega do composto ao coração, em comparação com a injeção intraperitoneal.

Para testar a adequação deste método para estudos de regeneração cardíaca, os ventrículos são crioinados e, em seguida, as injeções são realizadas em três e sete dias após a crioca. Tanto o miocárdio quanto o tecido ferido contêm numerosas células dapi-positivas, indicando uma penetração eficiente deste corante no coração intacto e tecido fibroso. Além disso, a faloideina injetada AF649 também é incorporada por cardiomiócitos da zona de peri-lesão e alguns fibroblastos recrutados da área ferida.

Este experimento revela que as drogas podem atravessar o epicárdio e penetrar no miocárdio subjacente. Após testar a eficiência das injeções intratorácicas usando corantes, são analisados os efeitos das proteínas injetadas no coração. Para isso, são investigados os efeitos da citocina exógena em vários processos.

Os aspectos biológicos da proliferação de cardiomiócitos, deposição de matriz extracelular, recrutamento de células imunes e expressão genética cardioprotetora são ativados por injeção intratorácica de citocina. Esses resultados demonstram que a injeção intratorácica fornece uma estratégia adequada para a entrega direcionada de proteínas para estudar seus efeitos em tecidos cardíacos distintos em uma variedade de ensaios. A inserção da agulha no pericárdio é um passo fundamental para uma injeção bem sucedida.

A forma da agulha, o ângulo de penetração e os locais de punção são todos os fatores que influenciam a inserção da agulha. Seguindo ou precedendo a injeção intratorácica, pode-se realizar lesões criocicas a fim de analisar o efeito de moléculas injetadas na regeneração cardíaca. A injeção intratorácica foi usada em zebrafish para estudar o pré-condicionamento cardíaco.

Uma proteína chamada CNTF foi injetada e tem sido demonstrada para melhorar programas citoprotetores e pró-regenerativos no coração.