Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

Modelos xenoenxertos derivados do paciente e linhas celulares primárias estão se tornando parte integrante do desenvolvimento de medicamentos e da iniciação e progressão da pesquisa de biologia tumoral. Os modelos xenoenxertos derivados do paciente preservam a aparência histológica das células cancerosas, retêm a heterogeneidade intratumoral e refletem melhor os componentes humanos relevantes do microambiente tumoral. Seus modelos são para representações mais precisas do câncer humano do que as linhas tradicionais de células cancerosas e têm o potencial de melhorar a avaliação pré-clínica de novas terapias anticancerígenas.

Além disso, esses modelos podem ser úteis na comparação de características moleculares ou assinaturas tumorais entre diferentes subgrupos de pacientes com câncer. Os camundongos NSG são recomendados como modelo de camundongos imunodeficientes. Devido à grave imunodeficiência dos camundongos, a esterilidade deve ser mantida em todos os experimentos.

Em condições estéreis, use fórceps e tesouras para dissecar cuidadosamente os tecidos tumorais e apara-los em vários pequenos pedaços. Depois de anestesiar o rato, use uma tesoura estéril para fazer uma incisão de um centímetro em ambos os flancos dorsais. Use fórceps estéreis para interromper o tecido subcutâneo.

Em seguida, corte um pedaço do tecido tumoral, e coloque-o no local profundo. Feche a área de implante por sutura subcutânea com agulhas de sutura cirúrgica. Esterilize a ferida com iodo.

Depois disso, coloque suavemente os ratos em uma gaiola vazia enquanto mantém a recumbência severa. Preste muita atenção aos ratos, pois eles devem acordar e começar a caminhar depois de aproximadamente três a quatro minutos. Coloque camundongos submetidos à cirurgia em uma nova gaiola separados daqueles que não foram submetidos à cirurgia.

Avalie o tamanho do tumor por palpação do local de implantação e meça-os com uma pinça Vernier duas vezes por semana. Depois de eutanásia dos camundongos, use fórceps estéreis e tesouras para isolar lentamente o tumor dos camundongos. Lave os tecidos tumorais em DPBS em uma antena de 10 centímetros.

Você fórceps e tesouras para dissecar e remover áreas necroséticas, tecido gorduroso, coágulos sanguíneos e tecido conjuntivo. Em seguida, use um molde para cortar os tecidos tumorais a uma espessura máxima de um milímetro. Lave as fatias do tumor com DPBS em um prato de 10 centímetros.

Para iniciar o processo de vitrificação, use fórceps para transferir as fatias para o tubo V1 e incubar a quatro graus Celsius por quatro minutos. Role e inverta o tubo brevemente e incuba a quatro graus Celsius por mais quatro minutos. Em seguida, despeje a solução V1 e corte em um prato de 10 centímetros e use fórceps para transferir as fatias para o tubo V2. Incubar a 4 graus Celsius por quatro minutos.

Enrole e inverta o tubo brevemente e incuba-o a quatro graus Celsius por mais quatro minutos. Depois disso, despeje a solução V2 e as fatias em um prato de 10 centímetros. Transfira as fatias para o tubo V3 e incubar a quatro graus Celsius por cinco minutos.

Role e inverta o tubo brevemente e incuba a quatro graus Celsius por mais cinco minutos. Certifique-se de que todas as fatias afundem no fundo do tubo. Se várias fatias permanecerem flutuando, role e inverta o tubo brevemente e incubar a quatro graus Celsius até que todas as fatias afundem completamente.

Em seguida, despeje a solução V3 e corte em um prato de 10 centímetros. Corte os suportes de tecido ao comprimento adequado e coloque-os em gaze estéril. Transfira as fatias para os suportes.

Enrole os suportes com gaze. Usando fórceps, coloque os suportes em nitrogênio líquido e deixe-os incubar por cinco minutos. Depois disso, rotule os frascos criogênicos com as informações do tecido.

Transfira os suportes com fatias de tecido para os frascos, que serão armazenados em nitrogênio líquido. Primeiro, ressecção amostras de câncer gástrico de amostras resseccionadas ou tecidos PDX colhidos. Coloque os tecidos no gelo e transfira-os para um prato de cultura estéril de 10 centímetros.

Use fórceps e tesouras para remover áreas necroséticas, tecido gorduroso, coágulos sanguíneos e tecido conjuntivo. Lave os tecidos tumorais uma vez com DPBS contendo penicilina e estreptomicina em um prato de 10 centímetros. Em seguida, corte o tumor em pedaços na tampa do prato.

A espessura máxima de cada peça deve ser de um milímetro. Transfira as peças em um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo sete mililitros de uma solução de colagem tipo 1 e trypsin. Vórtice a mistura brevemente.

Incubar em um banho de água a 37 graus Celsius por 30 a 40 minutos, certificando-se de vórtice da mistura a cada cinco minutos. Depois disso, adicione um volume igual de RPMI-1640 médio suplementado com 10% de FBS e vórtice da mistura completamente. Transfira esta mistura para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros através de uma filtragem lenta através de um filtro de 40 microliter.

Centrifugar os filtrados a uma velocidade entre 113 e 163 vezes g por cinco a sete minutos em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente este supernatante. Lave a pelota com cinco mililitros de PBS e remova cuidadosamente o supernatante.

Se a pelota é vermelha, contém eritrócitos. Resuspenque suavemente a pelota com 500 microliters de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS.

Centrifugar a uma velocidade entre 113 e 163 vezes g por cinco a sete minutos em temperatura ambiente. Retire cuidadosamente o supernasce e resuspenque a pelota com meio de cultura e transfira a mistura para um prato estéril de 10 centímetros. Incubar a cultura a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, certificando-se de substituir o meio por meio contendo soro a cada dois ou três dias.

Neste estudo, são estabelecidos modelos PDX de câncer gástrico e linhas celulares primárias. Tumores de primeira geração são vistos crescendo mais lentamente do que os das gerações posteriores, levando três semanas ou mais para atingir o tamanho apropriado. A taxa de sucesso da formação de tumores subcutâneos de primeira geração é superior a 80% A identidade das células cancerígenas dos modelos PDX é confirmada a partir de modelos PDX por manchas de H&E.

A taxa de sucesso da formação de tumores a partir do tecido tumoral criopreservado é vista como aproximadamente 95% As células tumorais podem ser facilmente reconhecidas por diferenças na morfologia. As células primárias são autenticadas independentemente por dois patologistas sob um microscópio. Para maiores confirmações, a coloração de H&E é usada para observar a morfologia celular do câncer após a fixação.

A taxa de isolamento bem-sucedido das linhas celulares primárias é de aproximadamente 40% Esses modelos têm se mostrado preditivos de desfechos clínicos e estão sendo utilizados para avaliação de medicamentos pré-clínicos por uma identificação de marcadores, estudos biológicos e estratégias medicinais personalizadas.