Name: Crescimento metal-limitado de neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes reativos metálicos e aquisição de metais da Host Ligands (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Aprenda a cultivar Neisseria gonorrhoeae em meio líquido com restrição de metais para caracterizar genes responsivos a metais e mecanismos de aquisição. Este método reproduz condições de imunidade nutricional do hospedeiro.

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Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH R0125421, R01 AI127793 e U19 AI144182. O autor da redação gostaria de agradecer a todos os membros do laboratório que contribuíram para a revisão e revisão deste método.

1. Preparação das Soluções de Ações MédiaS Definidas Tratadas pela Chelex (CDM)
<ol><li>Solução de ações I<ol>
<li>Combine NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) e KH2PO4 (10,9 g) em água deionizada para um volume final de 1 L.</li>
		<li>Filtro esterilizar a solução e alíquota em tubos cônicos de 50 mL.</li>
		<li>Loja a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de ações II<ol>
<li>Combine hcl thiamine (0,2 g), thiamine pirophosphate-Cl (0,05 g), pantothenate de cálcio (0,19 g) e biotina (0,3 g) em 50% (vol/vol) etanol para um volume final de 1 L.</li>
		<li>Aliquot em tubos cônicos de 50 mL e armazenar a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de estoque III<ol>
<li>Combine L-aspartate (4,0 g), L-glutamate (10,4 g), L-arginina (1,2 g), glicina (0,2 g), L-serine (0,4 g), L-leucine (0,7 2 g), L-isoleucine (0,24 g), L-valine (0,48 g), L-tyrosine (0,56 g), L-proline (0,4 g), L-tryptophan (0,64 g), L-threonine (0,4 g), L-phenylalanine (0,2 g), L-asparagine-H2O (0,2 g), L-glutamina (0,4 g), L-histidine-HCl (0.2 g), L-methionine (0,12 g), L-alanine (0,8 g), L-lysine (0,4 g) e reduziu a glutahiona (0,36 g) em 500 mL deionizada água deionizada.</li>
		<li>Dissolva L-cysteine (0,44 g) e L-cystine (0,28 g) em um volume mínimo (~1 mL) de 1 M HCl e adicione à solução de aminoácido acima.</li>
		<li>Ajuste o pH da solução com 10 N NaOH até que todas as partículas se dissolvam. O pH final será 10.0-11.0.</li>
		<li>Leve o volume final para 1 L com água deionizada.</li>
		<li>Filtro esterilizaa a solução e a alíquota em volumes de 250 mL.</li>
		<li>Loja a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de ações IV<ol>
<li>Dissolva glicose (200 g) em água deionizada para um volume final de 1 L. NOTA: A solução pode ter que ser aquecida para dissolver a glicose.</li>
		<li>Filtrar esterilizar e alíquotar a solução em tubos cônicos de 50 mL.</li>
		<li>Loja a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de ações V<ol>
<li>Combine hipoxantina (5,0 g), uracil (5,0 g) e NaOH (4,0 g) em água deionizada a um volume final de 1 L.</li>
		<li>Filtrar esterilizar e alíquota em tubos cônicos de 50 mL.</li>
		<li>Loja a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução VI<ol>
<li>Prepare uma solução de 1 M CaCl2-2H2O (147 g/L) em água desionizada. Filtrar esterilizar e armazenar à temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de ações VII<ol>
<li>Prepare uma solução 1 M anhydrous MgSO4 em água desionizada. Filtrar esterilizar e armazenar na RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de ações VIII<ol>
<li>Prepare uma solução 1 M NaHCO3 em água deionizada. Filtrar esterilizar e armazenar na RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de Concentrado Estéril 4x e 1x CDM
NOTA: Este procedimento deve ser realizado em vidros estéreis tratados com ácido ou plástico para evitar o lixitório de metais nas soluções.
<ol><li>Combine soluções de ações I (50 mL), II (20 mL), III (250 mL), IV (50 mL) e V (20 mL) com 20,0 g de HEPES e mexa para misturar.</li>
	<li>Ajuste o pH para 7,4, depois leve o volume final para 500 mL com água desionizada.</li>
	<li>Lave a resina Chelex-100 em 1 L água desionizada para remover conservantes antes de adicioná-la ao concentrado estéreo 4x. Faça isso adicionando 50 g de resina a 1 L água desionizada e mexendo por pelo menos 1h. Remova a água por filtragem de vácuo e use esta resina lavada para a etapa 2.4.</li>
	<li>Adicione 50 g de resina e mexa lentamente por exatamente 90 min.</li>
	<li>Remova a resina por esterilização do filtro e armazene o concentrado estéreo 4x a 4 °C.</li>
	<li>Para preparar uma concentração de trabalho de 1x de CDM, primeiro diluir o concentrado 4x com água desionizada estéril, depois adicionar solução VI (125 μL por 500 mL de solução 1x), solução VII (535 μL por 500 mL) e solução VIII (10 mL por 500 mL). NOTA: Embora todas as soluções de estoque já tenham sido esterilizadas, recomenda-se filtrar a solução de 1x novamente após a preparação.</li>
</ol>3. Preparação das placas de CDM
NOTA: A receita abaixo faz 1 L de mídia para pratos, mas é melhor prepará-los em volumes menores. Tudo diminui proporcionalmente.
<ol><li>Agarose lavada<ol>
<li>Dissolva 50 g de agarose em 1 L água deionizada, mexendo por 1h.</li>
		<li>Transfira a solução para uma garrafa de centrífuga e centrífuga em 1.200 x g por 15 min na RT. Despeje cuidadosamente o supernatant e descarte.</li>
		<li>Adicione água deionizada suficiente para resuspender a pelota de agarose e, em seguida, transfira para um frasco de 1 L. Leve para um volume final de 1 L com água deionizada e depois mexa e centrífuga sisócia como na etapa 3.1.2. Descarte o supernatante.</li>
		<li>Adicione 100% de etanol suficiente para resuspender a pelota e depois transfira para um novo frasco de 1 L. Traga para um volume final de 1 L com etanol. Mexa e centrífugas como na etapa 3.1.2.</li>
		<li>Repita o passo 3.1.4.</li>
		<li>Adicione metanol à pelota de agarose para resuspender, depois transfira para um frasco de 1 L. Traga para um volume final de 1 L com metanol. Mexa e centrífugas como na etapa 3.1.2.</li>
		<li>Repita o passo 3.1.6.</li>
		<li>Transferir agarose lavada para uma bandeja forrada com papel alumínio e permitir secar em um capô de fumaça. Quando estiver seco, transfira para um recipiente sem metal para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adicione 10 g de agarose lavada e 5 g de amido de batata a 750 mL de água desionizada.</li>
	<li>Autoclave por 30 min a 121 °C, 100 kPa acima da pressão atmosférica.</li>
	<li>Permita que a mídia esfrie a ~65 °C, depois adicione 250 mL de 4X CDM, 250 μL de solução VI, 1,07 mL de solução VII e 20 mL da solução VIII.</li>
	<li>Se desejar, adicione os metais escolhidos antes de derramar placas. A adição de chelators não é necessária para manter condições livres de metais.</li>
	<li>Despeje em pratos petri e deixe se solidificar.</li>
</ol>4. Metal Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae
NOTA: Para a maioria das aplicações, não é necessário estressar as bactérias antes da inoculação do MDL. A etapa inicial de duplicação no CDM e a diluição subsequente são suficientes para esgotar o gonococci de seus estoques internos de ferro e zinco. Como tal, as duas primeiras etapas do procedimento a seguir são realizadas utilizando placas de ágar feitas a partir da base média GC que foram complementadas com o suplemento de Kellogg I14 e 12,5 μM Fe(NO3)3. Se o estresse metálico precoce for desejado, recomendamos preparar placas de base média GC sem Fe (NO3)3 e com 5 μM TPEN (N,N,N', N',N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) etilediamina) para queda de zinco ou 10 μM deferoxamina para queda de ferro. Toda a incubação é realizada a 37 °C com 5% de CO2.
<ol><li>Dois dias antes do experimento, no dia -2, a raia gonococci dos estoques de freezer em placas médias GC e incubar por não mais de 24 h.</li>
	<li>No dia -1, raia colônias individuais em placas médias gc frescas. Tente fazer isso de 14 a 16 h antes do experimento de crescimento.</li>
	<li>No dia do experimento, adicione 5-10 mL 1x CDM a um frasco de braço de 125 mL lavado de ácido(Figura Suplementar 1)e use isso para embranco um colorímetro Klett.</li>
	<li>Use um cotonete estéril, com ponta de algodão para inocular CDM de colônias saudáveis e solteiras. Aponte para 20 unidades Klett. NOTA: Se um colorímetro Klett não estiver disponível, um espectrofotômetro também é adequado. Não há fórmula de conversão universal para unidades Klett para OD, mas um guia áspero está disponível<a href="https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales" target="_blank">(https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales</a>).</li>
	<li>Incubar com tremor a 250 rpm até aproximadamente uma dobra em massa (40 unidades Klett). Isso deve levar entre 1-2 h.</li>
	<li>Neste ponto, as culturas estão de volta diluídas pela adição de um volume suficiente de MDL para atingir metade da densidade cultural inicial (por exemplo, se 5 mL de cultura passou de 20 para 40 unidades Klett, 15 mL de CDM irá reduzi-lo para 10 unidades Klett) e o crescimento continuará como na etapa 4.5. A quantidade específica de diluição nas costas, tratamentos metálicos, etc. dependem de aplicações a jusante. Damos três exemplos abaixo (seções 5, 6 ou 7).</li>
</ol>5. Análise Ocidental de Produtos Genéticos Responsivos metálicos
<ol><li>A partir da etapa 4.6, de volta diluir as culturas com três volumes de CDM (por exemplo, 15 mL de CDM se começar com 5 mL). Neste ponto, adicione tratamentos metálicos, se desejar.<ol>
<li>Genes sensoriais de ferro podem ser despressionados com 12,5 μM Fe (NO3)3. Genes responsivos de zinco podem ser despressionados com znSO4de 10 μM .</li>
		<li>O estresse adicional de ferro ou zinco não é necessário, pois a mídia já está esgotada, por isso os genes responsivos já serão expressos. Se for desejado mais estresse, recomendamos não mais do que 1-2 μM de deferoxamina ou TPEN, pois o estresse excessivo evitará que as culturas cresçam.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cresça as culturas como na etapa 4.5 por 4 h e registre a densidade celular final das amostras. Culturas menos estressadas pelo metal crescerão para densidades finais mais elevadas.</li>
	<li>Padronizar culturas para uma densidade adequada e preparar lisates.<ol>
<li>Padronizar lisates de células inteiras para uma densidade equivalente a 100 unidades Klett em 1 mL de cultura. Para isso, divida 100 pela densidade da unidade Klett da sua amostra. O número que você recebe é o volume, em mL, de cultura que será usado para fazer a pelota celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Siga os procedimentos padrão SDS-PAGE e western blotting15 para sondar proteínas de interesse.</li>
</ol>6. Ensaios de crescimento limitados ao metal
NOTA: Esses ensaios descrevem pré-mixes de crescimento pré-fabricados. A preparação dessas misturas é descrita na seção 8.
<ol><li>Durante a dobra em massa na etapa 4.5, recue os poços de uma microplaca de poço de 96 com pré-mixes de 10x. Além disso, designe três poços para servir em branco. A esses poços, adicione 10 μL de pré-mix de 10x e 90 μL de CDM.</li>
	<li>Uma vez que as culturas nos frascos de braço sidearm tenham dobrado, adicione 100 μL de cada cultura a um poço não utilizado na microplaca e meça a densidade óptica em 600 nm (OD600). Isso pode ser feito com cuvettes em um espectrofotômetro, mas com um maior número de cepas dentro de um ensaio isso pode se tornar complicado e geralmente não é aconselhável a menos que seu espectrofotômetro possa medir diretamente do braço do frasco de braço lateral(Figura Suplementar 2).<ol>
<li>Ao medir o OD, coloque os frascos de volta na incubadora para garantir que os gonococci permaneçam viáveis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule a quantidade correta de diluição necessária para levar as culturas para OD600 = 0,02. As pré-misturas de 10x têm um efeito insignificante no OD e podem ser omitidas a partir do cálculo.</li>
	<li>Diluir culturas com CDM em pequenos tubos de cultura e adicionar volume suficiente para diluir as pré-misturas de 10x a 1x na placa. Se um aquecedor de placa estiver disponível, mantenha a placa a 37 °C enquanto estiver funcionando.</li>
	<li>Incubar a placa por 8 a 12 h com tremor em um leitor de placas, tomando medições de OD600 em intervalos desejados.</li>
</ol>7. Detecção de Ligand Binding por Transportadores metálicos de Membrana Externa
<ol><li>Trate as culturas tão desejadas quanto na etapa 5.1, depois incubacom o tremor por 4 h.</li>
	<li>Pouco antes da marca de 4 h, corte três pedaços de papel filtro e um pedaço de nitrocelulose para o tamanho aproximado necessário para caber em um aparelho de mancha de ponto (Figura Suplementar 3). Presoak a nitrocelulose em água deionizada, em seguida, montar o aparelho com papel filtro abaixo da nitrocelulose.</li>
	<li>Às 4h, registre as densidades celulares e padronize uma densidade final adequada. Recomenda-se usar ~10% da densidade utilizada para a preparação das células na etapa 5. Por exemplo, se usar 100 KU em 1 mL para os lisates, isso significa ~10 KU em 1 mL para essas manchas. O cálculo é o mesmo descrito em 5.3.1, e as culturas são adicionadas diretamente à nitrocelulose nos volumes calculados em vez de transformadas em lisatos.</li>
	<li>Culturas de células pipet sobre a nitrocelulose e permitem tempo suficiente para o papel filtro absorver todo o líquido.</li>
	<li>Desmonte o aparelho, deixe a mancha secar e bloqueie a membrana nitrocelulose por 1 h em 5% de albumina de soro bovino ou leite sem gordura (w/v) em soro soro tampão tris.</li>
	<li>Remonte o aparelho de manchas de pontos, substituindo o papel filtro por película de parafina para criar um selo à prova de vazamento a nitrocelulose.</li>
	<li>Diluir o ligand de ligação metálica de interesse para 0,2 μM em blocker e células de sonda por 1 h.</li>
	<li>Sifão fora do líquido com um vácuo, lave a mancha, em seguida, siga os procedimentos imunológicos padrão para desenvolver o sinal16. Os passos de lavagem podem ser feitos dentro ou fora do aparelho.</li>
</ol>8. Carregamento metálico de Transferrin, S100A7 e Calprotectin, e Preparação de Pré-misturas de 10x
NOTA: Assim como na preparação do CDM, use vidro lavado ácido ou plástico para preparação de soluções.
<ol><li>Dissolver a transferência humana a 10 mg/mL (125 μM) no buffer inicial (100 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 8,4). S100A7 e calprotectin estão suspensos em tampão composto por 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoetanol e 1 mM CaCl2, pH = 8,0).<ol>
<li>Adicione solução de ferração (citrato de sódio de 100 mM, 100 mM NaHCO3, 5 mM FeCl3-6H2O, pH = 8,4) à solução de transferência para alcançar 30% de saturação de ferro (por exemplo, 75 μL de solução de ferração é adequado para transferência de 5 mL se feita a 10 mg/mL).</li>
		<li>Adicione ZnSO4 a S100A7 ou calprotectin a uma relação molar de 50% para a proteína para criar 25% de saturação (cada molécula de proteína tem dois locais de ligação metálica). Podem ser utilizadas preparações de 100 μM S100A7 ou calprotectin a 50 μM ZnSO4.</li>
		<li>Para ambos os casos, permita a mistura de ponta-over-end por pelo menos 1h para carregamento de metal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 4 L de tampão de diálise (40 mM Tris, 150 mM NaCl, 20 mM NaHCO3, pH = 7,4). Divida isso em dois volumes separados de 2 L e coloque um a 4 °C.</li>
	<li>Adicione as proteínas carregadas de metal em um de diálise usando uma seringa e diálise contra o primeiro volume de tampão por 4 h na RT.</li>
	<li>Mova o para o segundo volume de buffer e dique durante a noite a 4 °C. Após estas etapas, qualquer metais desvinculados devem ser removidos. NOTA: Aconselhamos um ensaio ácido bicinchoníco a determinar concentrações proteicas após a diálise.</li>
	<li>Use um pré-mix de transferência de 10x para utilização de transferrin como única fonte de ferro.<ol>
<li>Prepare esse premix diluindo 30% de fe-transferrina humana e apo-transferrina bovina (preparada em 125 μM como descrito para transferência humana, sem a etapa de carregamento de ferro) a 75 μM e 30 μM, respectivamente, na PBS. Um premix de controle positivo substitui 30% fe-transferrin a 75 μM Fe (NO3)3, e um premix de controle negativo omite qualquer ferro adicionado, mantendo apenas a apo-transferrin abo bovina. No ensaio de crescimento, diluir 10 μL desses concentrados com 90 μL de cultura. As concentrações finais são de 7,5 μM 30% humanafe-transferrina e 3 μM de apo-transferrina bovina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use uma versão modificada do premix de 10x de transferrina para s100A7 ou utilização de calprotectin a ser uma única fonte de zinco.<ol>
<li>Para um pré-mix de controle positivo, incorpore 50 μM ZnSO4 no pré-mix de transferência. Para um controle negativo, incorpore 50 μM TPEN e omita o zinco. Em seguida, pegue 10 μL de cada um deles para cada amostra bem necessária, e mova esse volume para um novo tubo. Adicione a esta metade o volume de PBS estéril. Por exemplo, se 10 poços receberem o premix de controle positivo, peguem 100 μL de pré-mix, movam-no para um novo tubo e adicionem 50 μL de PBS. Faça o mesmo pelo controle negativo.</li>
		<li>Para fazer o Premix S100A7 ou calprotectin, pegue 10 μL do premix de controle negativo por bem necessário, mova-se para um novo tubo e adicione metade desse volume do Zn-S100A7 de 25% ou calprotectin. No ensaio de crescimento, use 15 μL de pré-mix e dilua com 85 μL de cultura. As concentrações finais para os transferrins permanecem as mesmas da etapa 8.5, com um acréscimo de 5 μM de Zn, TPEN ou S100A7/calprotectin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cornelissen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+nutritional+immunity+by+the+pathogenic+Neisseriae%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae.</a> Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).</li>
<li>Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+iron-responsive+genes+of+Neisseria+gonorrhoeae+by+microarray+analysis+in+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium.</a> Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).</li>
<li>Pawlik, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zinc-responsive+regulon+of+Neisseria+meningitidis+comprises+17+genes+under+control+of+a+Zur+element%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).</li>
<li>Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+through+the+three+domains+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Zinc through the three domains of life.</a> Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).</li>
<li>Frawley, E. R., Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+bacterial+iron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of bacterial iron metabolism.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).</li>
<li>Thompson, S., Chesher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lot-to-Lot+Variation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist+Reviews%22%5BJournal%5D)">Lot-to-Lot Variation.</a> The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).</li>
<li>Hood, M. I., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+immunity%3A+transition+metals+at+the+pathogen-host+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).</li>
<li>Lopez, C. A., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Dietary+Transition+Metals+on+Host-Bacterial+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions.</a> Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MntABC+and+MntH+contribute+to+systemic+Staphylococcus+aureus+infection+by+competing+with+calprotectin+for+nutrient+manganese%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese.</a> Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+immunity+beyond+iron%3A+a+role+for+manganese+and+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).</li>
<li>Seib, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defenses+against+oxidative+stress+in+Neisseria+gonorrhoeae%3A+a+system+tailored+for+a+challenging+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).</li>
<li>Wu, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PerR+controls+Mn-dependent+resistance+to+oxidative+stress+in+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae.</a> Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).</li>
<li>Rayner, M. H., Suzuki, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+method+for+the+removal+of+trace+metal+cations+from+a+mammalian+culture+medium+supplemented+with+10%25+fetal+calf+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Biometals%22%5BJournal%5D)">A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum.</a> Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).</li>
<li>Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+Gonorrhoeae.+I.+Virulence+Genetically+Linked+to+Clonal+Variation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation.</a> Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
<li>Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dot-blot+assay+for+proteins+using+enhanced+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence.</a> Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).</li>
<li>Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+Evades+Calprotectin-Mediated+Nutritional+Immunity+and+Survives+Neutrophil+Extracellular+Traps+by+Production+of+TdfH%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH.</a> Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).</li>
<li>Stork, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+piracy+as+a+mechanism+of+Neisseria+meningitidis+for+evasion+of+nutritional+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733(2013).</li>
<li>Maurakis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+interaction+between+Neisseria+gonorrhoeae+TdfJ+and+human+S100A7+allows+gonococci+to+subvert+host+zinc+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction.</a> PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937(2019).</li>
<li>Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+piracy%3A+acquisition+of+transferrin-bound+iron+by+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens.</a> Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).</li>
<li>Quillin, S. J., Seifert, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+host+adaptation+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).</li>
<li>Platt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+dioxide+requirement+of+Neisseria+gonorrhoeae+growing+on+a+solid+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium.</a> Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).</li>
<li>Grim, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Metallophore+Staphylopine+Enables+Staphylococcus+aureus+To+Compete+with+the+Host+for+Zinc+and+Overcome+Nutritional+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity.</a> MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).</li>
<li>Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+and+transition-metal+homeostasis+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).</li>
<li>Calmettes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanism+of+Zinc+acquisition+by+the+neisserial+outer-membrane+transporter+ZnuD%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD.</a> Nature Communications. 6, 7996(2015).</li>
<li>Hubert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZnuD%2C+a+potential+candidate+for+a+simple+and+universal+Neisseria+meningitidis+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine.</a> Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).</li>
<li>Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neisseria+meningitidis+ZnuD+zinc+receptor+contributes+to+interactions+with+epithelial+cells+and+supports+heme+utilization+when+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).</li>
<li>Stork, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outer+membrane+receptor+of+Neisseria+meningitidis+involved+in+zinc+acquisition+with+vaccine+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential.</a> PLoS Pathogens. 6, 1000969(2010).</li>
<li>Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+zinc+binding+system%2C+ZevAB%2C+is+critical+for+survival+of+nontypeable+Haemophilus+influenzae+in+a+murine+lung+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model.</a> Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).</li>
<li>Ammendola, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+Zn2%2B+uptake+system+ZnuABC+is+required+for+bacterial+zinc+homeostasis+in+intracellular+environments+and+contributes+to+the+virulence+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica.</a> Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).</li>
<li>Gabbianelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ZnuABC+and+ZinT+in+Escherichia+coli+O157%3AH7+zinc+acquisition+and+interaction+with+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 11, 36(2011).</li>
<li>Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+characterization+of+the+Neisseria+gonorrhoeae+lbpB+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product.</a> Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).</li>
<li>Biswas, G. D., Sparling, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+lbpA%2C+the+structural+gene+for+a+lactoferrin+receptor+in+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).</li>
<li>Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+a+hemoglobin-binding+outer+membrane+protein+from+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).</li>
<li>Wong, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+haemoglobin+binding+by+HpuA+from+the+Neisseriaceae+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family.</a> Nature Communications. 6, 10172(2015).</li>
<li>Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+enterobactin+binding+and+utilization+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae.</a> Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).</li>
<li>Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+manganese+in+Neisseria+gonorrhoeae+correlates+with+resistance+to+oxidative+killing+by+superoxide+anion+and+is+independent+of+superoxide+dismutase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity.</a> Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

A mídia de crescimento serve a uma variedade de papéis na pesquisa microbiológica. A mídia especializada é usada para seleção, enriquecimento e várias outras aplicações para muitos tipos únicos de estudo. Uma dessas aplicações é a indução de genes reativos metálicos, que normalmente é realizado pela adição de um chellador específico que tem como alvo um determinado íon metálico. Este método é limitado, pois a quantidade de queda necessária para vários metais de rastreamento provavelmente será variável devido a diferentes...

A gonorreia de neisseria causa a gonorreia de infecção sexualmente transmissível comum. Durante a infecção, neisseria patogênica expressa um repertório de genes reativos metálicos que permitem que as bactérias superem os esforços de restrição metálica pelo hospedeiro humano1,2,3. Os metais de rastreamento como ferro e zinco desempenham papéis-chave em muitos processos celulares, como a vinculação a enzimas em sítios catalíticos, participação em reações redoxas e como fatores estruturais em várias proteínas4,5. Em condições limitadas a metais, loci reativo metálico são desreprimidos e suas proteínas resultantes podem ajudar na aquisição desses nutrientes. A caracterização desses genes e proteínas apresenta um desafio técnico único para o pesquisador. Íons metálicos devem ser retidos de bactérias para induzir a transcrição desses genes de seus loci nativos, mas uma queda eficaz desses íons da mídia carregada de metal pode ser difícil de otimizar. Os diferentes perfis metálicos de água de origem e variação inerente lote a lote6 de ingredientes em pó significa que a quantidade de chelator necessária para remover um metal específico de um meio rico vai variar entre diferentes locais, fornecedores de ingredientes, e mesmo ao longo do tempo dentro de um único laboratório à medida que o inventário químico é substituído.
Para contornar este desafio, descrevemos a preparação de um meio definido que é tratado com resina Chelex-100 durante a preparação para remover metais de rastreamento da solução. Este meio é suficientemente nutriente denso para permitir o crescimento do gonococcus, que é difícil de cultivar fora do hospedeiro humano, e permite que o pesquisador introduza um perfil metálico específico, adição de suas próprias fontes e concentrações definidas de Metais. O método de complemento controlado de metais desejados para médio esgotado aumenta a consistência experimental e permite experimentos robustos e replicáveis, independentemente de fatores como fonte de água e números de lotes químicos. Além disso, essa mídia pode ser implantada como líquida ou sólida com apenas pequenas modificações, tornando-a bastante versátil.
Para demonstrar a utilidade desse meio, delineamos um protocolo para seu uso para o crescimento gonocócica e descrevemos três experimentos bem sucedidos para caracterizar genes Neisseria responsivos ao metal. Primeiro, preparamos lisatos de células inteiras gonocócicas de culturas metal-esgotadas ou suplementadas e demonstramos níveis variáveis de produção de proteínas a partir de loci reativo metálico. Em seguida, delineamos um ensaio de crescimento restrito ao zinco no qual o crescimento gonocócica é controlado pela suplementação de fontes específicas e utilizáveis de zinco. Finalmente, mostramos ensaios vinculativos que demonstram células gonocócicas inteiras expressando receptores de superfície religados ao metal ligados aos seus respectivos ligantes contendo metal. A apresentação superficial bem-sucedida desses receptores requer crescimento em meio metálico.
O protocolo atual foi otimizado especificamente para a neisseria gonorrhoeae,mas inúmeros outros patógenos bacterianos empregam estratégias de aquisição de metais durante a infecção7, de modo que esse protocolo pode ser adaptado para o estudo da homeostase metálica em outras bactérias. Otimizar esta mídia e esses protocolos experimentais para uso em outras bactérias provavelmente exigirá uma leve modificação das concentrações de quedor de metal e/ou tempo de tratamento com chelex-100, já que outras bactérias podem ter requisitos metálicos ligeiramente diferentes do gonococcus. Ferro e zinco são os metais primários de preocupação para as investigações descritas, mas outros metais (por exemplo, manganês) têm sido demonstrados como críticos para bactérias, incluindo Neisseria8,9,10,11,12. Além disso, métodos semelhantes foram descritos para caracterizações metálicas no trabalho de cultura celular eucatótica, que também pode ser considerado. 13

<table><tbody><tr><td>Frascos de braço lateral de 125 mL</td><td>Bellco</td><td>2578-S0030</td><td>Deve ser encomendado sob encomenda</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>VWR</td><td>M131</td><td>Aberto na capela de exaustão</td></tr><tr><td>Papel 3MM</td><td>GE Health</td><td>3030-6461</td><td>Chamado de "papel de filtro" no texto</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biolone</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>Pó Cloreto de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Bloqueador de grau de mata-borrão</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404</td><td>Leite em pó desnatado</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Roche</td><td>3116964001</td><td>em pó</td></tr><tr><td>Transferrina bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1428</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Pantotenato de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8731</td><td></td></tr><tr><td>Calprotectina</td><td>em pó N/A</td><td>N/A</td><td>Somos fornecidos com isso por um colaborador</td></tr><tr><td>Chelex-100 Resina</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td>Lave com água deionizada antes de usar</td></tr><tr><td>Cotonete estéril com ponta de algodão</td><td>Puritano</td><td>25-806</td><td>O algodão é melhor que o poliéster para esta aplicação</td></tr><tr><td>Deferoxamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9533</td><td>Pó</td></tr><tr><td>D-glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr> de diálise em pó <tr><td></td><td>Thermo</td><td>66380</td><td>Pré-mergulhe em tampão antes de usar</td></tr><tr><td>Aparelho de mancha de pontos</td><td>Schleicher & Schwell</td><td>10484138</td><td>Trave a tampa o mais firmemente possível antes do carregamento da amostra</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1016</td><td>Líquido inflamável, armazene em armário de inflamáveis</td></tr><tr><td>Cloreto férrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7134</td><td>Irritante, não inale</td></tr><tr><td>nitrato férrico não hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1143</td><td>Irritante, não inale</td></tr><tr><td>base média GC</td><td>Difco</td><td>228950</td><td>Pó, já contém ágar</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td>Pó</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>L-15694</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Transferrina humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2030</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Hipoxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9377</td><td></td></tr><tr><td>Pó Klett colorímetro</td><td>Manostat</td><td>37012-0000</td><td>Usa transmissão de cor para avaliar a densidade da cultura</td></tr><tr><td>L-alanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-asparagina monohidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8381</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-aspartato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9256</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Cloridrato de L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1276</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-cistina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8755</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Cloridrato de L-histidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8125</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-isoleucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-fenilalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-serina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500</td><td>Pó</td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625</td><td>em pó</td></tr><tr><td>L-triptofano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254</td><td>em pó</td></tr><tr><td>L-tirosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td>em pó</td></tr><tr><td>L-valina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td>em pó</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>em pó</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Líquido inflamável, armazenar em armário de inflamáveis</td></tr><tr><td>Nitrocelulose</td><td>GE Health</td><td>10600002</td><td>Mantenha em bainha protetora até o uso</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60356</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Sulfato de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0772</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Amido de batata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4251</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Glutationa reduzida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td>Manuseie com cuidado. Pode oxidar facilmente.</td></tr><tr><td>S100A7</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Somos fornecidos por um colaborador</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td> em pó <td>VWR</td><td>470302</td> em <td>pó</td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Fisher</td><td>S279</td><td>em pó</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Acros Organics</td><td>383040010</td><td>Tiamina altamente higroscópica</td></tr><tr><td> cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Pirofosfato de tiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754</td><td>Também chamado de cocarboxilase</td></tr><tr><td>TPEN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4413</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>497</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td>Pó</td></tr><tr><td>Sulfato de zinco heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>204986</td><td>Irritante, não inale</td></tr></tbody></table>

crescimento metal-limitado de neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes reativos metálicos e aquisição de metais da host ligands

Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands

Metais de rastreamento como ferro e zinco são nutrientes vitais conhecidos por desempenhar papéis-chave em processos procarióticos, incluindo regulação genética, catalise e estrutura proteica. O sequestro metálico por anfitriões muitas vezes leva à limitação metálica para a bactéria. Essa limitação induz a expressão genética bacteriana cujos produtos proteicos permitem que as bactérias superem seu ambiente limitado ao metal. Caracterização desses genes é desafiadora. As bactérias devem ser cultivadas em mídia meticulosamente preparada que permite acesso suficiente a metais nutricionais para permitir o crescimento bacteriano, mantendo um perfil metálico propício para alcançar a expressão dos genes acima mencionados. Como tal, deve-se estabelecer um equilíbrio delicado para as concentrações desses metais. Cultivar um organismo nutricionalmente exigente, como a norréia neisseria,que evoluiu para sobreviver apenas no hospedeiro humano, adiciona um nível adicional de complexidade. Aqui, descrevemos a preparação de um meio metálico limitado definido suficiente para permitir o crescimento gonocócica e a expressão genética desejada. Este método permite que o pesquisador chelate ferro e zinco de fontes indesejadas enquanto complementa a mídia com fontes definidas de ferro ou zinco, cuja preparação também é descrita. Finalmente, descrevemos três experimentos que utilizam essa mídia para ajudar a caracterizar os produtos proteicos de genes gonocócicos regulados pelo metal.

Um meio definido específico na ausência de metais de rastreamento para o crescimento da gonorreia neisseria foi desenvolvido e implementado para a caracterização de genes reativos metálicos e seus produtos genéticos. No protocolo otimizado, o perfil metálico da mídia é controlado adicionando metais de volta a critério do investigador, em vez de por uma queda titulada de um alvo metálico, permitindo maior controle e consistência de laboratório para laboratório e experimento para e...

Descrevemos aqui um método de crescimento da gonorreia Neisseria em meio líquido restrito ao metal para facilitar a expressão de genes para a captação de metais. Também delineamos experimentos a jusante para caracterizar o fenótipo de gonococci cultivado nessas condições. Esses métodos podem ser adaptados para serem adequados para caracterização de genes reativos metálicos em outras bactérias.

Crescimento metal-limitado de neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes reativos metálicos e aquisição de metais da Host Ligands

Trace metals such as iron and zinc are vital nutrients known to play key roles in prokaryotic processes including gene regulation, catalysis, and protein ...

Este protocolo permite que os pesquisadores analisem bactérias cultivadas em condições que imitam mais de perto as encontradas em um hospedeiro mamífero, que são metálicas limitadas através de um processo chamado imunidade nutricional. Este protocolo facilita a geração de crescimento bacteriano reprodutível consistente em condições restritas metálicas e pode ser adaptado para o crescimento de muitos tipos diferentes de bactérias. Dois dias antes de iniciar o experimento, a gonococcide de talão dos estoques congeladores para placas médias gc para uma incubação não mais do que 24 horas a 37 graus Celsius.14 a 16 horas antes do experimento de crescimento, bife colônias únicas em placas médias GC frescas. No dia do experimento, adicione de cinco a 10 mililitros de MDL a um frasco de braço lateral de 125 mililitros lavado a ácido e use este meio para apagar um colorímetro Klett. Use um cotonete de algodão estéril para inocular 20 unidades Klett de MDL de colônias solteiras saudáveis.A geração de um saudável Neisseria gonorrhoeae inoculum para subcultura nas 96 placas de poço para ensaios de crescimento líquido é fundamental para o sucesso de todos os experimentos a jusante. Incubar as c

metal-limited-growth-neisseria-gonorrhoeae-for-characterization-metal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Stenzler, B. R. et. al., Um ensaio de biossensor anaeróbico para a detecção de mercúrio e cádmio. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o uso de biossensores bacterianos geneticamente modificados para medir com precisão a fração biodisponível de íons de mercúrio em condições anaeróbicas. Ao variar a concentração de sulfato de magnésio, o ensaio garante que o biossensor responda seletivamente aos íons de mercúrio livres, conforme indicado pelas mudanças na intensidade da fluorescência.

Ensaio de biossensor bacteriano para detecção de mercúrio biodisponível em condições anaeróbicas

Fonte: Maurakis, S., e Cornelissen, C. N. Crescimento limitado por metais de Neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes responsivos a metais e aquisição de metais de ligantes hospedeiros. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o procedimento para o cultivo de Neisseria gonorrhoeae sob condições limitadas por metal usando um meio definido e empobrecido em metal.

Cultivo de Neisseria gonorrhoeae em condições de esgotamento de metais

Fonte: Maurakis, S., et al. Crescimento limitado por metal de Neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes responsivos a metais e aquisição de metais de ligantes hospedeiros. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra um ensaio de crescimento bacteriano limitado a metais para estudar o papel dos genes responsivos a metais. Bactérias selvagens e mutantes cultivadas em meio empobrecido em metal são incubadas com ligante de metal e seu crescimento é monitorado usando um leitor de placas. Em...

Ensaio de crescimento bacteriano limitado por metais para estudar o papel de genes responsivos a metais

Fonte: Maurakis, S., e Cornelissen, C. N. Crescimento limitado por metais de Neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes responsivos a metais e aquisição de metais de ligantes hospedeiros. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o procedimento para detectar transportadores de metal de superfície em Neisseria gonorrhoeae cultivada sob condições limitadas por metal usando um ensaio de dot blot, envolvendo ligação de ligante, detecção de anticorpos e visualização colorimétrica.

Detecção dos transportadores de metais de superfície em Neisseria gonorrhoeae usando Dot Blot

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Para obter informações básicas sobre a sorção e reciclagem de ouro de sistemas aquosos foi investigada a interação de nanopartículas de Au(III) e Au(0) em proteínas da camada S. A sorção de polímeros proteicos foi investigada por ICP-MS e a de monocamadas proteicas por QCM-D. O AFM subsequente permite a imagem latente das nanoestruturas.

Au-Interação de Slp1 Polímeros e monocamada de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, o ICP-MS e AFM como Ferramentas para Estudos biomolécula metal-

Um protocolo para a extração de um acompanhante de metal de transição periplasmático no contexto dos seus parceiros de ligação nativo e caracterização Biofísica de seu conteúdo de substrato por raios-x, absorção fluorescência e radiometal é apresentada.

Captação de Metal essencial em bactérias Gram-negativas: fluorescência, radioisótopos, um raio-x e fracionamento da pilha

Aqui, apresentamos um protocolo para usar um biosensor microbiana anaeróbia de células inteiras para avaliar como diferentes variáveis ambientais afetam a biodisponibilidade de Hg e Cd de bactérias em ambientes anóxica.

Um ensaio de anaeróbios Biosensor para a detecção de mercúrio e cádmio

Apresentamos um ensaio para a fácil quantificação de metais introduzidos em amostras preparadas usando cromatografia de afinidade metálica imobilizada. O método utiliza hidroxinaphthol azul como o indicador de metal colorimétrico e um espectrômetro UV-Vis como o detector.

Quantificação da lixiviação metálica na cromatografia imobilizada da afinidade metálica

O isolamento de micróbios resistentes a metais pesados de fontes geotérmicas é um tema quente para o desenvolvimento de bioremediação e monitoramento ambiental de biossistemas. Este estudo fornece uma abordagem metodológica para isolar e identificar bactérias tolerantes a metais pesados a partir de fontes termais.

Bioprospecção de microrganismos extreílicos para enfrentar a poluição ambiental

Este protocolo detalha a preparação de meios limitados por Zn2+, vasos de crescimento e culturas de sementes para produzir ribossomos limitados por Zn2+ em micobactérias. Traços de Zn2+ levam ao crescimento limitante de Zn2+ e descrevemos características morfogênicas usadas como bioindicadores para verificar a limitação de Zn2+ in vitro na bactéria modelo, Mycobacterium smegmatis, e no patógeno humano M. tuberculosis.

Usando Mycobacterium smegmatis como um bioindicador para condições de crescimento limitado por zinco em micobactérias

Aprenda a cultivar Neisseria gonorrhoeae em meio líquido com restrição de metais para caracterizar genes responsivos a metais e mecanismos de aquisição. Este método reproduz condições de imunidade nutricional do hospedeiro.

Crescimento metal-limitado de neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes reativos metálicos e aquisição de metais da Host Ligands (Vídeo) | JoVE Journal

Crescimento metal-limitado de neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes reativos metálicos e aquisição de metais da Host Ligands

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