Instilação intratraqueal de células-tronco em ratos neonatais de termo

Descrito é um protocolo para a realização de transplante intratraqueal de células estromais mesenquimais (MSCs) através de injeção intratraqueal a termo ratos neonatais. Esta técnica é uma opção clinicamente viável para a entrega de células-tronco e drogas em pulmões de ratos neonatais para avaliar sua eficácia.

A instilação intratraqueal é um biotécnico clínico para o parto de células-tronco e drogas em um pulmão neonatal para avaliar a eficácia de Chilman. Esta técnica pode ser boa fé para uso com uma variedade de aplicação primária em um rato neonatal e é uma medida relativamente fácil e econômica para o tratamento da doença pulmonar. No quinto dia pós-natal, contenha filhotes de rato Sprague-Dawley anestesiados, em uma entubação de 60 graus.

E afixar fita de rotulagem de laboratório em todos os quatro membros de cada filhote para fixá-los no lugar. Aplique fita abaixo de cada nariz para fixar as cabeças. E apontou o primeiro pescoço para perfuração traqueotomia.

Use uma almofada de preparação de 75% de álcool para desinfetar a área de incisão. E faça uma incisão vertical de 3 centímetros acima da traqueia para evitar danificar as artérias carótidas. Use pinças afiladas curvas sem gancho para dissociar as camadas de gordura e músculo para localizar a traqueia.

Quando a traqueia puder ser observada, use a pinça para agarrar a traqueia e use uma seringa de 100 microliteres equipada com uma agulha de calibre 30 para injetar uma vez dez da quinta luciferase de vagalume GFP rotulada células mesenquimais estrogonais em 30 microlitras de soro fisiológico na traqueia, durante a fase inspiratória. Quando todas as células tiverem sido injetadas, feche a incisão com 160 pontos de seda amarrando o nó o mais firmemente possível. E cortando as extremidades da sutura o mais curto possível.

Em seguida, permita que o filhote se recupere da anestesia, em um local quente com monitoramento até ficar quente, rosa e capaz de movimento espontâneo antes de devolver o animal à sua gaiola. Para rastrear as células mesenquimais mesenquimais humanas transplantadas 15 minutos após a retirada dos ratos da cirurgia, injete intraperitoneally os filhotes re-anestesiados com 125 miligramas por quilograma de sal de potássio luciferiano na PBS. 10 minutos após a injeção, use um pequeno sistema de imagem animal para adquirir imagens sequenciais em intervalos de 5 a 15 segundos com um binning médio, uma parada de 1 f e um campo de visão de 26 centímetros.

Em seguida, use o software de imagem para quantificar a atividade de luminescência dos pulmões com base nas regiões automáticas de interesse. Um alto nível de expressão GFP é observado em células-tronco mesenquimais humanas com rótulo de luciferase. As células-tronco mesenquimais podem ser ainda caracterizadas pela expressão do marcador de superfície celular e sua capacidade de se diferenciar em osteocitos, condrócitos e adipócitos.

A imagem de luminescência das células mesenquimais humanas transplantadas no VIVO, revela a ausência de sinalização luminescente nas regiões pulmonares de ratos tratados com soro fisiológico normal. Em ratos tratados com células-tronco mesenquimais, a luminescência é observada dentro da traqueia e regiões pulmonares centrais desses animais. De fato, nesta análise representativa, a quantificação da intensidade de luminescência revelou que os ratos tratados com células-tronco mesenquimais apresentaram um aumento de aproximadamente 13 vezes na atividade de luminescência em comparação com ratos tratados com soro fisiológico normal.

Ao tentar esse procedimento, é importante dissecar e isolar a traqueia sem limitar as artérias circundantes. Esta técnica permite o estudo dos efeitos da administração intratraqueal de células e medicamentos da doença de Palmer neonatal utilizando raios com o modo de paciente humano.