Name: Aplicação de terapia phage para neutralizar pseudomonas aeruginosa infecção em embriões de zebrafish fibrose cística (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Aprenda a aplicar terapia com fagos para neutralizar Pseudomonas aeruginosa em embriões de zebrafish modelo de fibrose cística. Este método permite avaliar in vivo a eficácia do tratamento contra infecções bacterianas.

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Italiana de Fibrose Cística (FFC#22/2017; Associazione "Gli amici della Ritty" Casnigo e FFC#23/2019; Un respiro in più Onlus La Mano tesa Onlus).

Os zebrafish adultos (Danio rerio) da cepa AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) são mantidos de acordo com as diretrizes internacionais (Diretiva da UE 2010/63/UE) e nacionais (decreto italiano 4de março de 2014, n. 26) sobre a proteção de animais usados para fins científicos. As condições padrão são definidas na instalação de peixes com um ciclo escuro de 14 horas/10 h e temperatura da água do tanque a 28° C.
1. Elaboração de soluções e ferramentas
<ol><li>Prepare uma solução de estoque de 50x e soluções de trabalho 1x para o meio de embrião E3 para embriões de zebrafish em crescimento (ver Tabela 1).</li>
	<li>Faça solução de bloqueio de pigmentação, para bloquear a pigmentação do embrião a partir de 24 horas após a fertilização (24 hpf) (ver Tabela 1).</li>
	<li>Prepare estoque de 25x e solução anestésica tricane de trabalho 1x, conforme descrito na Tabela 1. NOTA: Para evitar o congelamento e o descongelamento repetidos da solução que poderia danificar a solução de estoque, faça alíquotas de 2 mL de tricaine 25x e armazene-as a -20 °C.</li>
	<li>Prepare as faixas para microinjeção de embriões dissolvendo 1 g de agarose em 100 mL de H2O destilado em um frasco ou garrafa microwavable. Micro-ondas por 1-3 min até que a agarose esteja completamente dissolvida.</li>
	<li>Posicione os moldes de microinjeção de zebrafish (ver Tabela de Materiais) virados de cabeça para baixo em uma placa de Petri (90 mm x 15 mm) e cubra toda a superfície derramando o gel líquido de agarose com uma largura de aproximadamente 10 mm.</li>
	<li>Remova o molde assim que a agarose se solidificar. Encha a placa de Petri com 1x de meio de embrião E3. Isso pode ser armazenado a 4 °C por aproximadamente uma semana. Antes de usar, substitua pelo meio E3 fresco contendo Tricaine. NOTA: Moldes mais antigos podem desenvolver fungos ou contaminações bacterianas.</li>
	<li>Use capilares de 10 cm polidos de fogo para preparar agulhas para microinjeção e fixá-las no puxador de micropipette apertando as alças. Ajuste o puxador com as seguintes configurações: calor 500, velocidade 100, tempo 150, puxe 150.</li>
</ol>2. P. aeruginosa (PAO1) preparação inóculo
<ol><li>Inoculação 1 colônia de GFP+P. aeruginosa cepa PAO119 em 5 mL de caldo LB (ver Tabela 1) e crescer durante a noite a 37 °C com agitação (200 rpm).</li>
	<li>Diluir a cultura da noite para OD600 = 0,1 em 10 mL de caldo LB e crescer para OD600 = 0,5 a 37 °C com agitação (200 rpm).</li>
	<li>Centrifugar 2 mL da cultura por 2 min a 4 °C a 16.100 x g e resuspengar a pelota celular para OD600 = 1, equivalente a cerca de 1 x 109 cfu/mL, em 1 mL da solução fisiológica (ver Tabela 1).</li>
	<li>Diluir a suspensão celular para cerca de 5 x 107cfu/mL em solução fisiológica e armazenar a 4 °C.</li>
</ol>3. Preparação de estoque de phage
<ol><li>Inocular 1 colônia de P. aeruginosa cepa PAO1 em 5 mL de caldo LB e incubar durante a noite a 37 °C com agitação. Diluir a cultura da noite paraOD 600 = 0,01 em 500 mL de caldo LB e crescer a 37 °C com agitação para OD600 = 0,05, equivalente a cerca de 2,5 x 107 cfu/mL.</li>
	<li>À cultura diluída de P. aeruginosa,adicione cerca de 1,25 x 107 phages, para obter a multiplicidade de infecção (M.O.I.) de 10-3. Incubar a 37 °C com agitação até que o OD600 caia para cerca de 0,1-0,3 (em cerca de 3 a 5 horas, dependendo do phage utilizado). NOTA: Foram selecionados quatro phages para este experimento que infectam a cepa PAO1: Dois Podoviridae, números de adesão do GenBank vB_PaeP_PYO2, MF490236 e vB_PaeP_DEV, MF490238, e dois Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 e vB_PaeM_E217, MF490240. Realize as etapas abaixo para cada phage individualmente.</li>
	<li>Incubar o lysate com 1 mg/mL de DNase e RNase por 30 min a 37 °C. Centrifugar a 5.000 x g por 30 min a 4 °C e recuperar cuidadosamente o supernaspe (SN). Filtre o SN com um filtro com 0,8 μm de diâmetro de poros.</li>
	<li>Ao SN, adicione 58 g/L de NaCl e 105 g/L de PEG6000. Dissolva-se com agitação em RT 20 min e, em seguida, mantê-lo durante a noite a 4 °C. Centrífuga a 20.000 x g por 30 min a 4 °C para precipitação de phage. Remova o SN e dissolva cuidadosamente a pelota de phage em 15 mL de tampão TN (ver Tabela 1).</li>
	<li>Purifique os phages com gradiente de densidade CsCl, conforme descrito nas etapas abaixo.<ol>
<li>Em um tubo de ultracentrificação de poliallômero para rotor SW41, prepare um gradiente de densidade de passo CsCl estratificando 2 mL das quatro soluções CsCl descritas na Tabela 1.  Adicione 3,5 mL de suspensão de phage em cada um dos 4 tubos. NOTA: CsCl é tóxico, adotar procedimentos de segurança adequados para manuseá-lo e descartá-lo.</li>
		<li>Introduza os tubos no rotor e certifique-se de que os tubos estejam equilibrados (a diferença de peso entre os dois tubos voltados deve ser ≤ 0,01g).</li>
		<li>Centrifugar por 2h a 4 °C e 100 x g (25.000 rpm para rotor SW41). Após a centrifugação, remova lentamente os tubos e imobilize-os cuidadosamente em um suporte. Usando uma seringa com agulha de 19 G, elas desenhe a faixa branca/opalescente que está localizada geralmente entre a região de densidade d=1,5 e a d=1,4.</li>
		<li>Transfira as suspensões da seringa para novos tubos de polinômero para rotor SW60 e use a solução d=1.4 para equilibrar com precisão os tubos.</li>
		<li>Centrifugar a suspensão a 4 °C e 150.000 x g (38.000 rpm para o rotor SW60) por pelo menos 16 h.</li>
		<li>Colete a faixa visível como acima (ver passo 3.3.3) e transfira-as para tubos de diálise com 6.000 da cut-off. Dialise a faixa visível obtida 2x por 20 min contra 500 mL de água e durante a noite contra 500 mL de tampão TN. Filtrar com um filtro de poros de 0,22 μm e armazenar a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparação para coquetéis de phage
<ol><li>Faça uma mistura de quatro phages que infectam a cepa PAO1, anteriormente isolada e caracterizada8. Antes de misturar, estime o título de cada estoque de phage por ensaio de placa20.</li>
	<li>Monte o coquetel de phage, com um titer global de 5 × 108 pfu/mL, misturando igualmente quatro preparações de phage no mesmo pfu/mL imediatamente antes de cada experimento, para garantir titulações phage precisas.</li>
</ol>5. Coleta e preparação de embriões de zebrafish para microinjeção de morfolnos cftr
NOTA: Coletar 1-2 embriões de células de zebrafish tipo selvagem para microinjeção cftr morpholinos(cftr-MOs).
<ol><li>Dois dias antes do experimento de microinjeção bacteriana, configure pares de reprodução e colete embriões conforme descrito anteriormente21. Os zebrafish adultos (Danio rerio) da cepa AB foram comprados do European Zebrafish Resource Center, EZRC.</li>
	<li>No dia seguinte, colete os embriões imediatamente após a fertilização com uma pipeta plástica ou usando um coador de malha fina. Coloque os embriões coletados em uma placa de Petri contendo meio embrião E3 e remova cuidadosamente os detritos com uma pipeta plástica para evitar contaminação que possa prejudicar o desenvolvimento do embrião.</li>
	<li>Prepare 5 μL de solução de injeção de morfolino diluindo as duas soluções de estoque de morfolino (1 mM) em água estéril para uma concentração final de 0,25 pmol/embrião ATG-MO + 0,25 pmol/embrião-MO. Para rastrear a injeção de embrião, adicione 0,5 μL de fenol vermelho à mistura da solução de injeção de morfolino.</li>
	<li>Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL da solução de mistura de morfelino usando uma micropipette de 20 μL com uma ponta de carregamento de gel fino. Fixar a agulha no micromanípulo conectado a um suporte e posicioná-la sob um estereótipo. NOTA: Não é necessário que a solução atinja a ponta da agulha, pois a pressão da bomba microinjetor irá empurrá-la.</li>
	<li>Corte a ponta da agulha cortando a ponta da agulha com pinças finas e estéreis. Meça o diâmetro da gota usando uma barra de escala no ocular do microscópio. Alternativamente, crie uma gota de óleo mineral em um slide de micrômetro e ajuste o volume de microinjeção injetando a solução na gota de óleo para avaliar o tamanho da gotícula. Use uma gota com um diâmetro de 156 μm para injetar um volume de 2 nL.</li>
	<li>Ajuste o microinjetor ajustando a pressão de compensação para 15 hPa, tempo de injeção para 0,5 s e pressão de injeção entre 300 e 600 hPa para obter o volume correto de injeção dependendo da agulha utilizada.</li>
	<li>Com uma pipeta plástica organize os embriões da etapa 5.2 em um vidro posicionado em uma placa de Petri de 96 mm de diâmetro. NOTA: Muito meio E3 impedirá a penetração adequada da agulha de microinjeção na coro dos embriões.</li>
	<li>Penetre o acorde e, em seguida, a gema com a agulha para injetar 2 nL no embrião como descrito anteriormente22.</li>
	<li>Coloque embriões injetados em uma placa de Petri com meio E3 e coloque-os em uma incubadora a 28 °C para deixá-los se desenvolver até o dia seguinte.</li>
</ol>6. Microinjeção de embriões de zebrafish com bactérias e coquetel de phage
NOTA: Para realizar uma infecção sistêmica, o embrião deve ter circulação sanguínea que geralmente começa após 26 hpf.
<ol><li>Após 26 hpf (para estágios de desenvolvimento de zebrafish, consulte Kimmel21) embriões descorrionatos com solução de pronase preparados pela dissolução do pó de pronase em meio E3 a uma concentração de 2 mg/mL. Pipeta suavemente os embriões para quebrar o acorde. Descarte o meio pronase/E3 e enxágue o prato várias vezes com E3 fresco para remover toda a pronase.</li>
	<li>Anesthetize embriões de zebrafish em E3 médio contendo Tricaine aproximadamente 5 minutos antes das injeções.</li>
	<li>Pipeta os embriões anestesiados na pista preparados na etapa 1. Use uma ponta de carregamento de gel fino para forrar os embriões na posição lateral.</li>
	<li>Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL da preparação de P. aeruginosa conforme descrito na parte 5.</li>
	<li>Insira a agulha dorsalmente ao ponto de partida do duto de Cuvier, onde ela começa a se espalhar sobre o saco de gema. Injete um volume de 1-3 nL e certifique-se de que o volume se expanda diretamente dentro do duto e entre na circulação.</li>
	<li>Aproximadamente após cada 50 embriões injetados, injete uma gota da bactéria em um tubo de centrífuga de 1,5 mL com 100 μL de PBS estéril para verificar se o volume de injeção permanece o mesmo. Emplaque o inóculo no ágar LB (ver Tabela 1) a 37 °C durante a noite para avaliar a UFC.</li>
	<li>Transfira os embriões microinjetados em duas placas de Petri limpas com e3 médio fresco + PTU e incuba-os a 28 °C.</li>
	<li>Em dois pontos de tempo selecionados: 30 min ou 3 h após a injeção bacteriana, retire uma das placas de Petri com embriões injetados por bactérias da incubadora e alinhe-os na pista, conforme descrito em 6.3 para a injeção de coquetel phage.</li>
	<li>Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL do coquetel de phage (preparado na etapa 4) com uma ponta de carregamento de gel fino e fixe-a no microinjetor (ver passo 5).</li>
	<li>Injete o coquetel de phage no duto de Cuvier dos embriões previamente injetados com bactérias.</li>
	<li>Transfira os embriões microinjetados em duas placas de Petri limpas com e3 médio fresco + PTU e incuba-os a 28 °C.</li>
</ol>7. Avaliação da carga bacteriana de embriões injetados com PAO1 e phages
<ol><li>A 8 hpi, pipeta 15 embriões anestesiados da placa de Petri para um tubo de centrífugas de 1,5 mL.</li>
	<li>Substitua a solução anestésica por 300 μL de 1% Triton X-100 em PBS (PBSTritonX) e homogeneize os embriões passando-os pelo menos 15x através de uma seringa de insulina com uma agulha estéril de 27 G.</li>
	<li>Prepare diluições seriais de homogeneizadores em PBS estéreis transferindo 100 μL do homogenate diluído em 900 μL de PBS estéril.</li>
	<li>Para selecionar para a cepa PAO1 naturalmente resistente, a placa 100 μL das diluições no ágar LB adicionada com ampicillina (100 μg/mL) e incubar a 37 °C durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, conte o número de colônias, multiplique pelo fator de diluição para determinar o número total de UFC, e divida pelo número de embriões homogeneizados para obter o número médio de UFC/embrião infectado.</li>
</ol>8. Avaliação da letalidade dos embriões injetados com PAO1 e phages
<ol><li>Para avaliar a letalidade da infecção por PAO1, escore os embriões injetados em 20 hpi sob um estereótipo e conte para os embriões mortos (branco/não transparente).</li>
	<li>Calcule a dose de concentração letal semi-máxima de 50 (LD50) de PAO1 que determina a morte de 50% dos embriões injetados a 20 hpf.</li>
</ol>9. Preparação embrionária para imagens de lapso de tempo estereomicroscope da infecção por GFP+ PAO1
<ol><li>Prepare o molde para imagens de embriões vivos dissolvendo 1,5% de baixa agarose de fusão em 100 mL de solução E3.</li>
	<li>Adicione 1% de Tricaine (ver Tabela 1) para anestesiar os embriões.</li>
	<li>A 4 hpi transfira um embrião com uma pipeta de plástico em um prato de fundo de vidro e adicione a solução agarose de ponto de fusão baixa quente.</li>
	<li>Posicione a placa de fundo de vidro sob um estereótipo e com uma ponta posicione o embrião na orientação desejada. Use uma pipeta de plástico para adicionar cuidadosamente uma gota de agarose no embrião.</li>
	<li>Deixe a agarose esfriar por 5-10 min e encha delicadamente o prato de fundo de vidro com E3 contendo a solução anestésica para manter o embrião úmido.</li>
	<li>Coloque a antena inferior de vidro com o embrião sob o estereóscópio fluorescente com um filtro fluorescente (canal 488 nm) para bactérias GFP+. Não remova a placa de Petri até novas aquisições com os mesmos parâmetros de 9, 14 e 18 cv.</li>
</ol>10. Análises de expressão de citocinas pró-inflamatórias
<ol><li>A 20 hpi anestesia os embriões com solução tricaine 1x e transfira-os da placa de Petri para um tubo de centrífugas de 1,5 mL.</li>
	<li>Sob um capô de fumaça remova a solução anestéstica e substitua por 200 μL de reagente de cloridrato de guanidium.</li>
	<li>Homogeneize os embriões ao pipetá-los repetidamente através de uma pipeta de 200 μL primeiro e, em seguida, pelo menos 15x com uma seringa de insulina com uma agulha estéril de 27 G.</li>
	<li>Extrair RNA total de embriões homogeneizados de zebrafish usando um reagente de cloridrato de guanidium comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Trate 1 μg de cada amostra de RNA com 2 μL de 1U/μL de DNase I (sem RNase), seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Use 1 μg de RNA tratado DNase I para reação de transcrição reversa (RT) usando kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais),em um volume total de 20 μL de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Execute a reação qPCR RT em um volume total de 10 μL contendo 1x SYBR Green mastermix usando 1,5 μL de uma diluição de 1:6 da reação RT. Para fins de normalização, use os primers para os genes de manutenção da casa rpl8 e para citocinas pró-inflamatórias, use primers para TNF-α e IL-1β (ver Tabela 2). o protocolo qPCR foi: ciclo 1 passo 1: 95 °C, 2 min, repetir uma vez; ciclo 2: passo 1 95 °C, 10 s, passo 2 55 °C, 30 s, repetir 40x; ciclo 3: passo 1 72 °C, 15 min.</li>
</ol>

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<li>Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+in+the+study+of+the+phage-antiphage+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction.</a> Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).</li>
<li>Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+as+a+Model+Organism+to+Study+Development+of+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System.</a> Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste manuscrito, descrevemos o protocolo para realizar a infecção por P. aeruginosa (PAO1) em embriões de zebrafish e como aplicar a terapia de phage com um coquetel de phages previamente identificado como capaz de infectar PAO1 para resolvê-lo. O uso de bacteriófagos como alternativa aos tratamentos com antibióticos tem sido de crescente interesse desde os últimos anos. Isso se deve principalmente à difusão de infecções bacterianas multidrogas resistentes (MDR), que constituem um problema sério para a saúde pú...

A terapia phage, o uso dos inimigos naturais das bactérias para combater infecções bacterianas, está ganhando interesse renovado à medida que a resistência bacteriana aos antibióticos se torna generalizada1,,2. Esta terapia, utilizada há décadas na Europa Oriental, poderia ser considerada um tratamento complementar a antibióticos na cura de infecções pulmonares em pacientes com CF e uma possível alternativa terapêutica para pacientes infectados com bactérias resistentes a todos os antibióticos atualmente em uso2,,3. As vantagens da terapia antibiótico são que os bacteriófagos se multiplicam no local da infecção, enquanto os antibióticos são metabolizados e eliminados do corpo4,,5. De fato, a administração de coquetéis de phages virulentos isolados em diferentes laboratórios tem se mostrado eficaz no tratamento de infecções pseudomonas aeruginosa em modelos animais tão diferentes quanto insetos e mamíferos6,,7,,8. A terapia de phage também mostrou-se capaz de reduzir a carga bacteriana em feridas de queimadura infectadas com P. aeruginosa e Escherichia coli em um ensaio clínico randomizado9.
O zebrafish (Danio rerio) emergiu recentemente como um modelo valioso para estudar infecções com vários patógenos, incluindo P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus e Burkolderia cepacia12,13. Ao microinjetar bactérias diretamente na circulação sanguínea do embrião14 é fácil estabelecer uma infecção sistêmica que é neutralizada pelo sistema imunológico inato de zebrafish, que é conservado evolutivo com neutrófilos e geração de macrófagos semelhante à contraparte humana. Além disso, durante o primeiro mês de vida, os embriões de zebrafish carecem da resposta imune adaptativa, tornando-os modelos ideais para estudar a imunidade inata, que é o mecanismo crítico de defesa em infecções pulmonares humanas15. O zebrafish surgiu recentemente como um poderoso sistema de modelo genético para entender melhor o início da CF e desenvolver novos tratamentos farmacológicos10,,16,17. O modelo de zebrafish CF de cftr knock-down gerado com injeção de morfolino em zebrafish apresentou uma resposta de explosão respiratória amortecida e reduziu a migração de neutrófilo10, enquanto o nocaute do CFTR leva à posição do órgão interno prejudicada e à destruição do pâncreas exócrino, um fenótipo que espelha a doença humana16,17. De maior interesse foi a constatação de que a carga bacteriana P. aeruginosa foi significativamente maior em embriões de perda de função cftrdo que em controles em 8 horas pós-infecção (hpi), o que paralelamente aos resultados obtidos com camundongos e células epiteliais brônquias humanas2,,18.
Neste trabalho, demonstramos que a terapia de phage é eficaz contra infecções por P. aeruginosa em embriões de zebrafish.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289329</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phospate tampolado com solução salina PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td>nome comum tricaína</td></tr><tr><td>Micromanipulador Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>5247</td><td></td></tr><tr><td>Fleming/marrom P-97</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>LE-Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11685660001</td><td></td></tr><tr><td>Baixo Derretimento Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>Azul Metil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de microinjeção</td><td>Aparelho</td><td></td><td></td>de Harvard</tr><tr><td>N-feniltioureia > = 98%</td> <td>Aldrich-P7629</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr>Ferramentas <td></td><td>genéticas</td><td>de oligo morfolino</td><td>projetadas pelo pesquisador</td></tr><tr><td>PEG6000</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>Solução de vermelho de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 143-74-B</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-06-0</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio ACS reagente, &ge; 99,0%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td>S9I</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Oxóide</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Oxóide</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>Z-MOLDS</td><td>Microinjeção Palavra Instrumentos de precisão</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aplicação de terapia phage para neutralizar pseudomonas aeruginosa infecção em embriões de zebrafish fibrose cística

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

A resistência antimicrobiana, uma das principais consequências da incerteza diagnóstica e da superprescrição antimicrobiana, é uma causa cada vez mais reconhecida de infecções graves, complicações e mortalidade em todo o mundo com um enorme impacto em nossa sociedade e no sistema de saúde. Em particular, pacientes com sistemas imunológicos comprometidos ou patologias pré-existentes e crônicas, como a fibrose cística (CF), são submetidos a tratamentos antibióticos frequentes para controlar as infecções com a aparência e difusão de isolados resistentes a multidroga. Portanto, é urgente abordar terapias alternativas para combater infecções bacterianas. O uso de bacteriófagos, os inimigos naturais das bactérias, pode ser uma solução possível. O protocolo detalhado neste trabalho descreve a aplicação da terapia de phage contra a infecção por Pseudomonas aeruginosa em embriões de zebrafish CF. Os embriões de zebrafish foram infectados com P. aeruginosa para demonstrar que a terapia phage é eficaz contra infecções por P. aeruginosa, pois reduz a letalidade, a carga bacteriana e a resposta imune pró-inflamatória em embriões CF.

Os resultados e os números aqui apresentados são encaminhados aos embriões cf gerados através da injeção de morfoolinos cftr como descrito anteriormente10 e na etapa 5. Para validar o fenótipo cf, considerou-se a posição prejudicada de órgãos internos como coração, fígado e pâncreas, conforme descrito anteriormente17 (Figura 1). Resultados semelhantes foram obtidos no caso dos embriões WT, conforme relatado em nossa publicação anterior...

Apresentado aqui é um protocolo para a infecção por Pseudomonas aeruginosa e aplicação de terapia de phage em embriões de zebrafish fibrose cística (CF).

Aplicação de terapia phage para neutralizar pseudomonas aeruginosa infecção em embriões de zebrafish fibrose cística

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

Este protocolo facilita a preparação e administração de um coquetel viral e phage contra pseudomonas aeruginosa em embriões de zebrafish. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma avaliação in vivo da eficácia da praga no combate à infecção bacteriana. O coquetel de phage é eficiente tanto no tipo selvagem quanto nos modelos de zebrafish de fibrose cística.Abrindo a possibilidade de aplicar a terapia de phage a infecções bacterianas em pacientes com fibrose cística. A terapia phage também pode ser aplicada para neutralizar infecções bacterianas específicas em outros sistemas modelo. Para preparar um estoque de phage para o experimento.Adicione 1,25 vezes 10 ao sétimo phages a uma cultura OD 600 de 0,05 P.aeruginosa a uma multiplicidade de infecção de uma vezes 10 para os três negativos e incubar a cultura por três a quatro horas com agitação até que o OD 600 caia para 0,1 a 0,3. No final da incubação incubar o lysate com um micrograma por mililitro de DNAse e RNAse por 30 minutos a 37 graus Celsius. E pelotar as células por centrifugação.No final do filtro de centrifugação o supernascer através de um diâmetro de poros de 0,8 micro metros e adicionar 58 gramas por litro de cloreto de sódio e 105 gramas por litro de PEG 6000. Incubar a solução a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, precipitar a praga por centrifugação.No final da centrofugação remova o supernascer e dissolva cuidadosamente a pelota de phage em 15 mililitros de tampão de cloreto de sódio Tris. Para purificar as pragas por gradiente de densidade de cloreto de césio, primeiro estratifique dois mililitros de quatro soluções diferentes de cloreto de césio em tubos de ultracentrífugo politomérico para um Rotor SW 41 e adicione 3,5 mililitros da suspensão de phage a cada tubo. Cloreto de césio é tóxico.Adote sempre os procedimentos de segurança adequados ao manusear e descartar este composto. Quando todos os tubos estiverem carregados, coloque os tubos no rotor, tomando cuidado para que os tubos estejam equilibrados. E centrifugar as amostras por duas horas a 100.000 vezes g e quatro graus Celsius.No final da centrifugação, use uma seringa com uma agulha de calibre 19 para aspirar a camada branca entre o D é igual a 1,5 e o D equivale a 1,4 regiões de densidade. E transfira as suspensões para novos tubos de poliallômero tamanho SW 60. Centrifugar as suspensões por pelo menos 16 horas a 150.000 vezes g e quatro graus Celsius.E transfira as bandas visíveis para tubos de diálise com um corte de 6.000 Dalton. Em seguida, dilímpe as amostras coletadas duas vezes contra 500 mililitros de água por 20 minutos por diálise e durante a noite contra 500 mililitros de tampão de cloreto de sódio tris. Na manhã seguinte, filtre o estoque de phage resultante com um filtro de poros de 0,22 mímetro e armazene o estoque a quatro graus Celsius.No dia da micro injeção dilui duas soluções de estoque de morfolinos micromolar em água estéril a uma concentração final de 0,25 picomolar por embrião para obter uma solução de injeção de morfolino de cinco microliter. E adicione 0,5 microliters de fenol vermelho a cada solução. Em seguida, use uma micropipette de 20 microliteres com uma ponta de carregamento de gel fino para carregar uma agulha de micro injeção com todo o volume de solução mista de morfolino e fixar a agulha a um micromistor conectado a um suporte sob um microscópio estéreo.Em seguida, com uma ou duas células, embriões de peixe zebra dispostos em um slide de vidro colocado dentro de uma placa de Petri de 96 milímetros de diâmetro, penetram o acorde e a gema com a ponta da agulha de micro injeção e injetam dois nanoliters da mistura de morfina no embrião. Às 26 horas após a fertilização, carregue uma agulha de micro injeção com aproximadamente cinco microliters de P.aeruginosa inoculum e insira a agulha dorsalmente até o ponto de partida do ducto de Cuvier no qual o duto começa a se espalhar sobre o saco de gema. Injete um a três nanoliters do inóculo PAO1 no embrião certificando-se de que o volume se expanda diretamente dentro do duto e entre na circulação.Após a injeção transfira o embrião para uma das duas novas placas de Petri contendo e3 médio fresco suplementado com fenilhiourea por uma incubação de 30 minutos ou três horas a 28 graus Celsius. Em seguida, carregue uma agulha de micro injeção com aproximadamente cinco microliters do coquetel de phage e fixe a agulha no micro injetor. Em seguida, injete um a três nanoliters de coquetel de phage no duto de Cuvier de cada embrião previamente injetado com bactérias e coloque os embriões em uma das duas novas placas de Petri contendo e3 médio fresco suplementado com fenilhiourea a 28 graus Celsius.Às quatro horas após a infecção, use uma pipeta plástica para transferir um embrião anestesiado em um prato de fundo de vidro. E encha o prato com ponto de fusão baixo quente agarose solução. Quando a agarose estiver fria, encha suavemente o prato com e3 médio suplementado com solução anestéstica.Coloque o prato sob o microscópio estéreo e use uma ponta de pipeta para posicionar o embrião na orientação desejada. Em seguida, coloque o prato sob um microscópio estéreo fluorescente com um filtro fluorescente para bactérias positivas GFP por até 18 horas após a infecção e imagem do embrião para a progressão da expressão GFP aos nove, 14 e 18 horas pós-infecção. Para determinar a carga bacteriana em oito horas após a infecção, transfira 15 embriões micro-injetados anestinados em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e substitua a solução anestésica por 300 microlitres de 1%Triton X-100 em PBS.Passe as agulhas através da agulha estéril de 27 medidores de uma seringa de insulina pelo menos 15 vezes para homogeneizar os embriões. E preparar diluições seriais do homogeneizar transferindo 100 microliters da mistura resultante em 900 microliters de PBS estéril por diluição. Para selecionar para a cepa P.aeruginosa naturalmente resistente à anicilina, placa 10 microliters das diluições em ágar LB suplementado com ampicillina e incuba-los durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, conte o número de colônias. Para permitir o cálculo do número total de unidades formadoras de colônias e o número médio de colônias formando unidades por embrião infectado. Para avaliar a letalidade da infecção por P.aeruginosa, os embriões injetados em 20 horas após a infecção sob um microscópio estéreo contam o número de embriões brancos mortos opacos.Em seguida, calcule a concentração letal meia máxima 50 dose de P.aeruginosa que resultou na morte de 50% dos embriões injetados em 20 horas após a infecção. Para validar o fenótipo da fibrose cística, a posição prejudicada de órgãos internos como o fígado cardíaco e o pâncreas podem ser avaliadas. A carga bacteriana é reduzida pela terapia de phage em embriões de fibrose cística infectados com P.Aeruginosa.Em 48 horas após a fertilização, embriões de fibrose cística infectados com bactérias P.Aeroginosa positivas da GFP, uma colônia formando unidades por dose de embrião demonstra uma letalidade de 50% em 20 horas após a infecção. A terapia de phage é igualmente eficaz em 20 horas após a infecção quando entregue 30 minutos ou sete horas após a injeção bacteriana. Aqui, uma fibrose cística e P.Aeruginosa positiva da GFP injetaram embrião em quatro, nove, 14 e 18 horas após a infecção.Em contraste, a fibrose cística mais P.Aeruginosa mais o embrião injetado por phage demonstra uma fluorescência reduzida devido à ação de phage contra as bactérias. A resposta inflamatória gerada pela infecção por P.aeruginosa em embriões de fibrose cística é significativamente aumentada, conforme revelado pela expressão das citocinas pró-inflamatórias, TNF alfa e interleucina 1 beta após injeção de P.aeruginosa em comparação com o controle de zebrafish injetado. No entanto, a expressão de ambas as citocinas inflamatórias é reduzida em animais co-injetados no coquetel phage.As pragas devem ser cuidadosamente purificadas para remover qualquer endotoxina contaminante que possa ser retida durante a preparação. As preparações de phage podem ser analisadas por microscopia eletrônica para avaliar a morfologia da virion. Seria interessante testar se a infecção em pacientes humanos por bactérias que não sejam pseudomonas aeruginosa pode ser curada com a terapia de phage no modelo de zebrafish fibrose cística.

phage-therapy-application-to-counteract-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Embriões do zebrafish transparente provaram anfitriões modelo útil para visualizar e interações de estudo funcional entre as células imunes inatas e patógenos bacterianos intracelulares, tais...

A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

O desenvolvimento rápido, tamanho pequeno e transparência de peixes-zebra são enormes vantagens para o estudo do controle imunológico inato de...

Não-invasivos de imagem de candidíase disseminada em larvas do peixe

O vídeo demonstra a técnica de terapia fágica direcionada à infecção por Pseudomonas aeruginosa em embriões de peixe-zebra com fibrose cística. A terapia fágica diminui efetivamente a carga bacteriana e mitiga as respostas imunes pró-inflamatórias em embriões de peixe-zebra com FC infectados com bactérias, levando à redução da letalidade do embrião de FC.

Uma terapia fágica contra a infecção por Pseudomonas aeruginosa em embriões de peixe-zebra

Este artigo descreve o vídeo elevado rendimento oleoduto que tenha sido estabelecida com sucesso para infectar e analisar um grande número de embriões de peixes-zebra proporcionando uma nova ferramenta poderosa para o teste e composto de descoberta de medicamentos usando um animal vertebrado organismo inteiro.

Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; E<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas

In vivo interações espaço-temporais de patógenos e defesas imunes no nível da mucosa não são facilmente visualizadas em hospedeiros vertebrados existentes. O método aqui apresentado descreve uma plataforma versátil para estudar a candidíase mucosa em vertebrados vivos usando a bexiga natatória do peixe-zebra juvenil como local de infecção.

Modelagem da mucosa candidíase em larval Zebrafish por swimbladder Injection

Embriões de peixe-zebra opticamente transparentes são amplamente utilizados para estudar e visualizar em tempo real as interações entre microrganismos patogênicos e as células imunes inatas. A microinjeção de Mycobacterium abscessus, combinada com imagens de fluorescência, é usada para examinar características patogênicas essenciais, como a formação de cordão em embriões de peixe-zebra.

Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Em embriões Zebrafish

Modelos de infecção sistêmica e localizada de peixe-zebra para o vírus influenza A humano são demonstrados. Usando um modelo de infecção sistêmica, o peixe-zebra pode ser usado para rastrear medicamentos antivirais. Usando um modelo de infecção localizada, o peixe-zebra pode ser usado para caracterizar as respostas das células imunes do hospedeiro.

Usando modelos de Zebrafish de infecções por vírus gripe humana A para Screen antivirais e Caracterizar imune do hospedeiro respostas de células

Este protocolo descreve o uso de cotonetes do reservatório e análise de lodos de sistemas de zebrafish, que leva à detecção de aumentada em comparação com o uso exclusivo de sentinelas para detectar agentes patogénicos como Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. e  Tomentosa de Pseudocapillaria. Propõe-se também um sistema para monitorar os ovos p. tomentosa em quarentena.

Análise ambiental de Aeromonas hydrophilae Mycobacterium spp. tomentosa Pseudocapillaria em sistemas de Zebrafish

Aqui descrevemos um protocolo para a imunização do adulto peixe-zebra (Danio rerio) com uma vacina baseada em DNA e demonstrar a validação de um evento de sucesso da vacinação. Este método é adequado para o rastreio pré-clínico de candidatos vacinais em vários modelos de infecção.

Imunização do adulto Zebrafish para o rastreio pré-clínica de vacinas baseadas em DNA

Este protocolo fornece instruções passo a passo para gerar e solucionar problemas de xenoenxertos de leucemia linfoblástica aguda humana (LLA) de linhagens celulares e material fresco do paciente em embriões de peixe-zebra imunossuprimidos transitoriamente, juntamente com diretrizes para avaliação de resposta a medicamentos usando citometria de fluxo. O pipeline experimental também pode ser adaptado para tumores sólidos.

Predição rápida de resposta a medicamentos in vivo usando enxertos de células de leucemia em embriões de peixe-zebra

Atualmente, faltam modelos in vivo passíveis de triagem de medicamentos contra infecções bacterianas crônicas. Aqui, descrevemos um protocolo para infecção de ferida por um isolado clínico de Pseudomonas aeruginosa para gerar uma infecção persistente em larvas de peixe-zebra.

Modelagem de infecção persistente por Pseudomonas aeruginosa em larvas de peixe-zebra feridas

Aprenda a aplicar terapia com fagos para neutralizar Pseudomonas aeruginosa em embriões de zebrafish modelo de fibrose cística. Este método permite avaliar in vivo a eficácia do tratamento contra infecções bacterianas.

Aplicação de terapia phage para neutralizar pseudomonas aeruginosa infecção em embriões de zebrafish fibrose cística

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