Name: Um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a induzir FEMI em camundongos grávidos via injeção de LPS para estudar lesões intestinais em recém-nascidos. Este modelo reproduz inflamação estéril sem bactérias vivas, permitindo investigar mecanismos de enterocolite necrosante.

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Este trabalho foi apoiado em parte através dos Institutos Nacionais de Saúde (DK097335 & T32AI007260) e do Departamento de Pediatria da Família Stead da Universidade de Iowa.

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Iowa (Protocol #8041401). Todos os animais foram alojados em uma Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados De Animais laboratoriais (AALAC) aprovada na Universidade de Iowa. Todos os ratos eram do tipo selvagem C57Bl/6J.
1. Estabelecimento de FEMI em camundongos gestantes
<ol><li>Preparação do LPS<ol>
<li>Use LPS derivado de Escherichia coli O55:B5 (concentração de estoque 2 mg/mL).</li>
		<li>Concentração de estoque de LPS diluída 1:100 com soro fisiológico estéril para uma concentração de trabalho de 20 μg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injeção de LPS materno<ol>
<li>Injete barragens grávidas no dia da gestação e15. Esse ponto de tempo é de aproximadamente 75% durante a gestação murina, tornando esse modelo de desenvolvimento semelhante ao terceiro trimestre precoce de gestações humanas, que é quando ocorre a maioria dos nascimentos prematuros devido à cooamnionite.</li>
		<li>Pese camundongos gestantes imediatamente antes da injeção para determinar a dosagem LPS apropriada.</li>
		<li>Calcule a dose de concentração de trabalho utilizando a seguinte fórmula: 5 μL x grama de peso corporal (gbw), para uma dose total de LPS de 100 μg/kg. Para animais de controle, use um volume equivalente de soro fisiológico normal para injeção.</li>
		<li>Solução LPS vortex três vezes por 15 segundos em alta antes de cada injeção.</li>
		<li>Desenhe o volume LPS em uma seringa de 1 mL.</li>
		<li>Contenha o rato grávida com técnica de escroffing. Segure na posição de recumbência dorsal e realize a injeção.<ol>
<li>Insira uma agulha de 30 mm de 8 mm sobreo painel do quadrante inferior direito do abdômen (para evitar bexiga e vasos abdominais) em um ângulo de 30\u201240°. Insira cerca de 1/4 a 1/2 o comprimento da agulha.</li>
			<li>Puxe para trás o êmbolo da seringa para garantir a pressão negativa antes da injeção. Proceda com a injeção se houver pressão negativa.</li>
			<li>Após a injeção, monitore os camundongos por aproximadamente 30 minutos e depois retorne às gaiolas pelo resto da gravidez.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Parto e cuidado de descendentes, e colheita intestinal
<ol><li>Entregue filhotes normalmente através do parto vaginal no e20. NOTA: Este modelo tem uma taxa de perda fetal dependente de dose esperada que pode ser observada na Figura 1 e é discutida nos resultados abaixo.</li>
	<li>Permita que os filhotes permaneçam com as mães e recebam rações ad libitum.</li>
	<li>No dia da colheita, tipicamente no dia 14 (P14), os filhotes de eutanásia via deslocamento cervical em conformidade com os protocolos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.</li>
	<li>Usando tesouras e fórceps, faça uma incisão vertical pela linha média do abdômen, através da pele e do peritônio, durante toda a extensão do abdômen. Extirpe o intestino delgado do estômago até o ceco com uma tesoura e remova a mesenteria com fórceps.</li>
	<li>Isole e mantenha o distal 1/3 do intestino delgado (seção representativa do íleo humano), descartando o intestino delgado proximal, o ceco e o cólon.</li>
	<li>Divida a porção de íleo ao meio usando uma tesoura.</li>
	<li>Coloque a metade proximal em uma solução de estabilização de RNA para quantificação posterior do RNA.</li>
	<li>Coloque a metade distal em formalina tamponada 10% neutra para a preparação do slide.</li>
</ol>3. Pontuação de lesão intestinal
<ol><li>Seção parafina embutida tecido em fatias de 5 μm de espessura e montar em lâminas de vidro. NOTA: Enviamos os espécimes para um núcleo de histologia para incorporação, secção e montagem em slides.</li>
	<li>Desparafinar slides de acordo com os procedimentos padrão.</li>
	<li>Manchas com hematoxilina e eosina de acordo com os procedimentos padrão.</li>
	<li>Escore seções em uma escala de 3 pontos para lesão intestinal como descrito anteriormente42,43.<ol>
<li>Utilizando microscopia leve, avalie a lesão intestinal generalizada por dois investigadores cegos separados em uma escala de 3 pontos avaliando a integridade e separação de Villus da membrana do porão43 (Figura Suplementar 1). A lesão intestinal é melhor avaliada em ampliação de 20x e abertura numérica 0,50.</li>
		<li>Atribua uma pontuação de 0 para descrever a mucosa normal.</li>
		<li>Atribuir uma pontuação de 1 descrever lesão leve que abrange o desenvolvimento do espaço subepiteliol gruenhagen, vacuolização ou elevação subepithelial limitada à lavímen propria ou pontas de villi.</li>
		<li>Atribua um escore de 2 para descrever lesões graves, indicadas por elevação epitelial e vacuolização maior que a metade da vílli, distorção de villi ou ulceração mucosa e desintegração da órcia de lamina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Quantificação de panése e células de cálice
<ol><li>Após a desparafinação, manchas deslizam de seções teciduais da Etapa 2.8 com a mancha de Ácido Azul/Periódico Alcian Schiff para denotar tanto as células de cálice quanto de Paneth como descrito anteriormente44,45 de acordo com as etapas a seguir. NOTA: Embora a mancha de Alcian Blue/Periodic Acid Schiff não seja específica nem para células paneth ou cálices, em nossa experiência, investigadores experientes cegos têm quantificação celular equivalente usando esta mancha em comparação com anticorpos mirados celulares, com significativamente menos coloração de fundo46.</li>
	<li>Desparafinar, manchar e desidratar lâminas da seguinte forma.<ol>
<li>Submergir desliza em xileno por 10 minutos duas vezes. ATENÇÃO: O xileno deve ser usado em um capô de fumaça.</li>
		<li>Enxágüe com 100% etoh.</li>
		<li>Submergir slides em 100 % EtOH por 3 min, depois em 90% EtOH por 3 min, seguido por 70% EtOH por 3 min, e por último submergir slides em 50% EtOH por 3 min.</li>
		<li>Lave sob água da torneira por 5 minutos. ATENÇÃO: Aponte a seção para longe da água corrente para evitar a perda da amostra de tecido.</li>
		<li>Filtrar a solução de mancha azul alciana com um filtro de café padrão.</li>
		<li>A mancha desliza na mancha azul alciana por 15 minutos e depois lava sob água da torneira por 2 minutos.</li>
		<li>Diluir 1 mg de ácido periódico em 200 mL de água dupla destilada. Submergir slides nesta solução por 5 minutos. Em seguida, lave sob água da torneira por 1 min.</li>
		<li>Mancha com o reagente de Schiff por 10 minutos. Lave sob água da torneira por 5 minutos.</li>
		<li>Manche os slides com hematoxilina por 1 min e depois lave sob água da torneira por 2 minutos.</li>
		<li>Submergir-os em álcool ácido (1 mL de ácido clorídrico misturado em 99 mL de 70% EtOH) por 1 min.</li>
		<li>Submergir na água da torneira de Scott (0,1% de concentração de NaHCO3 na água da torneira) por 1 min e depois lavar sob água da torneira por 1 min.</li>
		<li>Desidratar os slides.<ol>
<li>Mergulhe cada slide 10 vezes em 70% EtOH, depois diminua 10 vezes em 90% EtOH e 10 vezes em 100% EtOH.</li>
			<li>Submergir desliza em 100% EtOH por 10 minutos, seguido por submergir duas vezes em xileno fresco por 3 min cada.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque uma gota de mídia de montagem sobre o espécime e coloque uma mancha sobre ele.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contagem de células de cálice<ol>
<li>Utilizando microscopia leve, conte células de cálice(Figura Suplementar 2). Para cada pedaço de tecido intestinal, conte o número de células de cálice e 500 células epiteliais e expresse a razão das células de cálice como uma razão por 100 células epiteliais. As células cálices são melhor contadas em ampliação de 20x e abertura numérica 0,5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contagem de células de Paneth<ol>
<li>Utilizando microscopia leve, conte células paneth(Figura Suplementar 2). Para cada pedaço de tecido intestinal, expresse como uma razão de células paneth por cripta intestinal. Conte 100 criptas intestinais por cada pedaço de tecido intestinal. As células paneth são melhor contadas em 20x-60x de ampliação e abertura numérica 0,50-1,30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A coioamnionite impacta 2\u20124% do prazo e 25\u201230% das entregas pré-termo8,9. No entanto, o impacto da coioamnionite pode se estender muito além do nascimento, pois tem se mostrado ter efeitos significativos sobre o feto e o recém-nascido10,11,12,13,14,15,<...

As membranas coriônicas desempenham um papel integral na gravidez dos mamíferos. Eles incluem o acorde e amnion, que servem múltiplas funções. Cercam e protegem o feto, facilitam a sinalização paracrina entre os compartimentos materno e fetal1, e criam laços de feedback locais dentro das membranas coriônicas, que podem estar envolvidas no início da parturição1. A compreensão atual das membranas indica que o amnion fornece função de barreira estrutural, e o acorde fornece um tampão imunológico principalmente para proteger o feto em desenvolvimento do sistema imunológico materno2. A inflamação dessas membranas é conhecida como coioamnionite. Historicamente, o diagnóstico de coioamnionite clínica foi feito após a presença de febre materna mais um ou mais achados clínicos fetais ou maternos3,4. No entanto, embora essa definição seja clinicamente útil, sua falta de precisão tornou a pesquisa de coioamnionite desafiadora. Em 2015, na tentativa de esclarecer o diagnóstico, uma oficina de painéis de especialistas do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver definiu a coioamnionite como inflamação intrauterina, ou infecção, ou ambos (triplo I)3. Esse esclarecimento é importante porque, embora a infecção induzida por microbiano seja uma importante causa de inflamação uterina/amniótica, ocorre menos comumente do que a inflamação uterina/amniótica estéril5,6,7. No geral, a coioamnionite continua sendo um problema significativo de saúde pública, como é visto em 2\u20124% dos partos a termo e 25\u201230% das entregas pré-termo8,9.
A coioamnionite pode ter efeitos significativos no feto e no recém-nascido. Tem sido bem documentado na literatura que a coioamnionite está associada ao aumento do risco de muitas das morbidades da prematuridade, incluindo displasia broncopulmonar10, lesão de matéria branca cerebral11,hemorragia intraventricular12, retinopatia da prematuridade13, e tanto suspeita e confirmada início precoce da sepse neonatal14,15. Como estamos interessados em mecanismos de lesão e reparação do trato intestinal imaturo, é importante notar que a coioamnionite também está associada ao desenvolvimento posterior da enterocolite necrosante (NEC)15,16. A NEC é uma doença gastrointestinal devastadora de bebês prematuros que resulta em uma resposta desregulada do hospedeiro à inflamação e necrose intestinal subsequente17. A cada ano, a NEC afeta mais de 4.000 bebês nos Estados Unidos, e até um terço desses bebês morrem pela doença18. A patogênese da NEC provavelmente envolve uma combinação de imaturidade intestinal, desregulação do sistema imunológico imaturo, inflamação intestinal e translocação bacteriana19,culminando em uma via comum final de necrose intestinal. É importante ressaltar que o início da NEC ocorre muitas vezes semanas após o nascimento e exposição potencial à coioamnionite, tornando incerto o vínculo mecanicista entre a coioamnionite e o desenvolvimento subsequente da NEC20. Um mecanismo potencial pelo qual a coioamnionite pode contribuir para a fisiopatologia da NEC é através da regulação do sistema imunológico materno, produzindo posteriormente uma forte resposta inflamatória fetal que pode interromper os padrões normais de desenvolvimento fetal21,22,23.
Múltiplos modelos mamíferos de coioamnionite existem em roedores e ovelhas24,25,26,27,28,29,30,31,32. No entanto, existem poucos dados relativos ao desenvolvimento do trato intestinal além do período inicial do recém-nascido após a exposição fetal induzida pela coioamnionite à inflamação materna (FEMI). A fim de explorar a relação entre FEMI e o desenvolvimento subsequente da lesão do trato intestinal imaturo, adaptamos o modelo FEMI induzido por lipopolissacarídeo (LPS). Lipopolisacarídeos são um componente importante da superfície extracelular em bactérias gram negativas e são um potente estimulante do sistema imunológico inato de múltiplas espécies eucarióticas, incluindo humanos33. A injeção de LPS materno resulta em uma cascata inflamatória estéril sem os efeitos confusos das bactérias vivas, sendo um modelo bem estabelecido para a indução do nascimento pré-parto34, bem como um modelo de corioamnionite aguda e a síndrome de resposta inflamatória fetal (FIRS), que é a forma mais grave de coioamnionite24,35. Também foi demonstrado induzir tanto a lesão de matéria branca e cinza cerebral em um modelo de ovelha36 como um modelo murino37,38,39,40. No entanto, pelo que sabemos, somos os primeiros a utilizar esse modelo de coioamnionite e FEMI para investigar seus efeitos no desenvolvimento do trato gastrointestinal após o nascimento, bem como para investigar uma possível ligação mecanicista entre a coioamnionite e o desenvolvimento posterior da NEC41,42.

<table><tbody><tr><td>10% de formalina tamponada neutra</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Alcian blue stain</td><td>Newcomer fornecimento</td><td>1003A</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl6 / J camundongos</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina corante</td><td>Leica</td><td>381562</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-U Microscópio</td><td>Nikon</td><td>2CE-MQVJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Periódico</td><td>ACROS</td><td>H5106</td><td>CAS # 10450-59-9</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>Thermofisher</td><td>Am7021</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de Schiff</td><td>Sigma</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Secor Imager 2400</td><td>Meso Scale Discovery (MSD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V-Plex Assay</td><td>Meso Scale Discovery (MSD)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma</td><td>534056</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

A coioamnionite é um precipitante comum do nascimento prematuro e está associada a muitas das morbidades da prematuridade, incluindo enterocolite necrosante (NEC). No entanto, ainda não foi descoberto um elo mecanicista entre essas duas condições. Adotamos um modelo murino de coioamnionite envolvendo lipopolisacarídeo (LPS) induzido exposição fetal à inflamação materna (FEMI). Este modelo de FEMI induz uma cascata inflamatória materna, placentária e fetal estéril, que também está presente em muitos casos de coioamnionite clínica. Embora existam modelos que utilizem bactérias vivas e imitem com mais precisão a fisiopatologia de uma infecção ascendente que resulta em coioamnionite, esses métodos podem causar efeitos indiretos no desenvolvimento do insorudo do trato intestinal imaturo e do microbioma em desenvolvimento associado. Usando este protocolo, demonstramos que o FEMI induzido pelo LPS resulta em um aumento dependente de dose na perda de gravidez e nascimento prematuro, bem como interrupção do desenvolvimento intestinal normal na prole. Além disso, demonstramos que o FEMI aumenta significativamente a lesão intestinal e citocinas séricas na prole, ao mesmo tempo em que diminui as células de cálice e Paneth, ambas fornecem uma primeira linha de imunidade inata contra inflamação intestinal. Embora um modelo semelhante de FEMI induzido pelo LPS tenha sido usado para modelar a associação entre corioamnionite e anormalidades subsequentes do sistema nervoso central, pelo que sabemos, este protocolo é o primeiro a tentar elucidar um elo mecanicista entre a coioamnionite e posterior perturbações no desenvolvimento intestinal como um potencial elo entre a coioamnionite e a NEC.

A exposição ao FEMI no dia 15 embrionário leva a uma perda dependente de dose da gravidez e uma taxa dependente de dose de trabalho de parto prematuro(Figura 1)42. Para os experimentos, optou-se por usar uma dose de LPS de 100 μg/kg para minimizar a perda e a prematuridade da gravidez (perda de 50% entre prematuridade e morte fetal intrauterina) enquanto expunimos os fetos a um insulto inflamatório significativo.
Usando esta abordagem, exam...

Desenvolvemos um modelo de coioamnionite para simular a exposição fetal à inflamação materna (FEMI) sem complicações de organismos vivos para examinar os efeitos do FEMI no desenvolvimento do trato intestinal da prole. Isso permite o estudo de causas mecanicistas para o desenvolvimento de lesões intestinais após a coioamnionite.

Um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Este protocolo FEMI torna possível investigar os efeitos a longo prazo em neonatos após a exposição fetal à inflamação materna. Isso é especialmente relevante para o desenvolvimento de enterocolite necrosante, ou ECN. Essa técnica imita a inflamação estéril que é frequentemente observada na corioamnionite, e a falta de bactérias vivas pode ter efeitos confusos no trato intestinal em desenvolvimento e no microbioma.A etapa mais importante deste protocolo é a injeção de LPS para induzir FEMI. É extremamente importante que uma dose apropriada de LPS seja usada e que a injeção não cause trauma intraperitoneal no camundongo grávida. Comece diluindo o estoque de LPS de um a 100 com solução salina estéril para uma concentração de trabalho de 20 microgramas por mililitro.Injetar mães grávidas no dia da gestação E15. Pese os camundongos imediatamente antes da injeção para determinar a dosagem apropriada de LPS, usando um volume equivalente de solução salina normal para animais de controle. Vortex a solução LPS três vezes por 15 segundos em alta.Em seguida, coloque-o em uma seringa de um mililitro. Use a técnica de scruffing para conter a rata grávida e segure-a na posição de decúbito dorsal. Insira aproximadamente um quarto a metade de uma agulha de calibre 30 e oito milímetros, sobreposta ao quadrante inferior direito do abdômen em um ângulo de 30 a 40 graus.Puxe o êmbolo da seringa para trás para garantir a pressão negativa. Em seguida, prossiga com a injeção se houver pressão negativa. Monitore os camundongos por aproximadamente 30 minutos e, em seguida, devolva-os às gaiolas pelo restante da gravidez.Faça o parto dos filhotes por parto vaginal no E20 e permita que eles permaneçam com as mães, recebendo alimentação ad libitum. Colha os intestinos no dia 14 pós-natal. Use tesouras e fórceps para fazer uma incisão vertical na linha média do abdômen, através da pele e do peritônio, em todo o comprimento do abdômen.Extirpar o intestino delgado do estômago para o ceco e remover o mesentério. Isole o terço distal do intestino delgado, descartando o intestino delgado proximal, o ceco e o cólon. Divida a porção do íleo ao meio usando uma tesoura.Em seguida, coloque a metade proximal em uma solução de estabilização de RNA para quantificação de RNA e a metade distal em formalina tamponada a 10% neutra para preparação da lâmina. Corte o tecido embebido em parafina em fatias de cinco micrômetros de espessura e monte-as em lâminas de vidro. Desparafinize as lâminas e, em seguida, core as seções com hematoxilina e eosina de acordo com os procedimentos padrão.Use microscopia de luz para avaliar a lesão intestinal generalizada por dois investigadores cegos separados em uma escala de três pontos, avaliando a integridade das vilosidades e a separação da membrana basal. Atribua uma pontuação de zero para descrever a mucosa normal. Atribua uma pontuação de um para descrever a lesão leve, que inclui o desenvolvimento do espaço subepitelial de Gruenhagen, vacuolização ou elevação subepitelial limitada à lâmina própria ou pontas das vilosidades.Atribua uma pontuação de dois para descrever lesão grave, indicada por elevação epitelial e vacuolização maior que a metade das vilosidades, distorção das vilosidades ou ulceração da mucosa e desintegração da lâmina própria. Mergulhe as lâminas em xileno duas vezes por 10 minutos. Em seguida, enxágue-os com etanol 100%.Mergulhe as lâminas por três minutos em 100% de etanol, 90% de etanol, 70% de etanol e 50% de etanol. Em seguida, lave as lâminas em água corrente por cinco minutos, de frente para a seção longe da água para evitar a perda de amostra de tecido. Filtre a solução de corante azul Alcian com um filtro de café padrão e use-o para manchar as lâminas por 15 minutos.Em seguida, lave-os em água corrente da torneira por dois minutos. Diluir um miligrama de ácido periódico em 200 mililitros de água bidestilada e submergir as lâminas nesta solução por cinco minutos. Após uma lavagem de um minuto em água corrente, manche as lâminas com reagente de Schiff por 10 minutos e lave-as novamente por cinco minutos.Em seguida, core-os com hematoxilina por um minuto e lave com água por dois minutos. Mergulhe-os em álcool ácido por um minuto, depois na água da torneira de Scott por um minuto, seguido de uma lavagem em água corrente da torneira por um minuto. Para desidratar as lâminas, mergulhe cada lâmina 10 vezes em 70% de etanol, 90% de etanol e depois em 100% de etanol.Mergulhe as lâminas em etanol a 100% por 10 minutos, seguido de submersão duas vezes em xileno fresco por três minutos de cada vez. Coloque uma gota de meio de montagem na amostra e uma lamínula por cima. Conte as células caliciformes ao microscópio.Para cada pedaço de tecido intestinal, conte o número de células caliciformes e 500 células epiteliais. Em seguida, expresse as células caliciformes como uma proporção por 100 células epiteliais. Conte as células de Paneth.Para cada pedaço de tecido intestinal, registre a proporção de células de Paneth por cripta intestinal, contando 100 criptas intestinais para cada pedaço de tecido intestinal. A exposição fetal à inflamação materna, ou FEMI, no dia embrionário 15 leva a uma perda de gravidez dependente da dose e a uma taxa dependente da dose de trabalho de parto prematuro. O FEMI induz uma lesão intestinal significativa ao nascimento e às oito semanas de vida.Essa lesão ocorre na ausência de estímulos adicionais aos animais, sugerindo que o FEMI sozinho interrompe a homeostase normal do trato intestinal murino do recém-nascido. O número de células caliciformes produtoras de mucina e células de Paneth produtoras de peptídeos antimicrobianos no terço distal do trato intestinal delgado foi quantificado. Verificou-se que o FEMI interrompeu a composição normal do epitélio intestinal induzindo a perda de ambos os tipos celulares, em comparação com animais sem FEMI.Para investigar os efeitos do FEMI na resposta inflamatória neonatal, uma variedade de marcadores inflamatórios séricos foram quantificados, incluindo interleucina-1 beta, interleucina-10, KCGRO e interleucina-6, do soro de filhotes com e sem FEMI. O FEMI aumentou significativamente a cascata inflamatória para todas as citocinas em P0. A cascata inflamatória em idades posteriores diferiu com base no ponto de tempo e na citocina. Curiosamente, houve níveis semelhantes de IL6 em P7 a P28 nos grupos FEMI e simulado.No entanto, houve níveis significativamente mais altos no grupo FEMI em P56, apesar de nenhuma intervenção secundária. É fundamental realizar uma curva de dose inicial de LPS, pois diferentes estoques de LPS podem ter potências diferentes. Descobrimos que nossos resultados neonatais dependem da dose de LPS usada para induzir FEMI.

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