Um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido

Desenvolvemos um modelo de coioamnionite para simular a exposição fetal à inflamação materna (FEMI) sem complicações de organismos vivos para examinar os efeitos do FEMI no desenvolvimento do trato intestinal da prole. Isso permite o estudo de causas mecanicistas para o desenvolvimento de lesões intestinais após a coioamnionite.

Este protocolo FEMI torna possível investigar os efeitos a longo prazo em neonatos após a exposição fetal à inflamação materna. Isso é especialmente relevante para o desenvolvimento de enterocolite necrosante, ou ECN. Essa técnica imita a inflamação estéril que é frequentemente observada na corioamnionite, e a falta de bactérias vivas pode ter efeitos confusos no trato intestinal em desenvolvimento e no microbioma.

A etapa mais importante deste protocolo é a injeção de LPS para induzir FEMI. É extremamente importante que uma dose apropriada de LPS seja usada e que a injeção não cause trauma intraperitoneal no camundongo grávida. Comece diluindo o estoque de LPS de um a 100 com solução salina estéril para uma concentração de trabalho de 20 microgramas por mililitro.

Injetar mães grávidas no dia da gestação E15. Pese os camundongos imediatamente antes da injeção para determinar a dosagem apropriada de LPS, usando um volume equivalente de solução salina normal para animais de controle. Vortex a solução LPS três vezes por 15 segundos em alta.

Em seguida, coloque-o em uma seringa de um mililitro. Use a técnica de scruffing para conter a rata grávida e segure-a na posição de decúbito dorsal. Insira aproximadamente um quarto a metade de uma agulha de calibre 30 e oito milímetros, sobreposta ao quadrante inferior direito do abdômen em um ângulo de 30 a 40 graus.

Puxe o êmbolo da seringa para trás para garantir a pressão negativa. Em seguida, prossiga com a injeção se houver pressão negativa. Monitore os camundongos por aproximadamente 30 minutos e, em seguida, devolva-os às gaiolas pelo restante da gravidez.

Faça o parto dos filhotes por parto vaginal no E20 e permita que eles permaneçam com as mães, recebendo alimentação ad libitum. Colha os intestinos no dia 14 pós-natal. Use tesouras e fórceps para fazer uma incisão vertical na linha média do abdômen, através da pele e do peritônio, em todo o comprimento do abdômen.

Extirpar o intestino delgado do estômago para o ceco e remover o mesentério. Isole o terço distal do intestino delgado, descartando o intestino delgado proximal, o ceco e o cólon. Divida a porção do íleo ao meio usando uma tesoura.

Em seguida, coloque a metade proximal em uma solução de estabilização de RNA para quantificação de RNA e a metade distal em formalina tamponada a 10% neutra para preparação da lâmina. Corte o tecido embebido em parafina em fatias de cinco micrômetros de espessura e monte-as em lâminas de vidro. Desparafinize as lâminas e, em seguida, core as seções com hematoxilina e eosina de acordo com os procedimentos padrão.

Use microscopia de luz para avaliar a lesão intestinal generalizada por dois investigadores cegos separados em uma escala de três pontos, avaliando a integridade das vilosidades e a separação da membrana basal. Atribua uma pontuação de zero para descrever a mucosa normal. Atribua uma pontuação de um para descrever a lesão leve, que inclui o desenvolvimento do espaço subepitelial de Gruenhagen, vacuolização ou elevação subepitelial limitada à lâmina própria ou pontas das vilosidades.

Atribua uma pontuação de dois para descrever lesão grave, indicada por elevação epitelial e vacuolização maior que a metade das vilosidades, distorção das vilosidades ou ulceração da mucosa e desintegração da lâmina própria. Mergulhe as lâminas em xileno duas vezes por 10 minutos. Em seguida, enxágue-os com etanol 100%.

Mergulhe as lâminas por três minutos em 100% de etanol, 90% de etanol, 70% de etanol e 50% de etanol. Em seguida, lave as lâminas em água corrente por cinco minutos, de frente para a seção longe da água para evitar a perda de amostra de tecido. Filtre a solução de corante azul Alcian com um filtro de café padrão e use-o para manchar as lâminas por 15 minutos.

Em seguida, lave-os em água corrente da torneira por dois minutos. Diluir um miligrama de ácido periódico em 200 mililitros de água bidestilada e submergir as lâminas nesta solução por cinco minutos. Após uma lavagem de um minuto em água corrente, manche as lâminas com reagente de Schiff por 10 minutos e lave-as novamente por cinco minutos.

Em seguida, core-os com hematoxilina por um minuto e lave com água por dois minutos. Mergulhe-os em álcool ácido por um minuto, depois na água da torneira de Scott por um minuto, seguido de uma lavagem em água corrente da torneira por um minuto. Para desidratar as lâminas, mergulhe cada lâmina 10 vezes em 70% de etanol, 90% de etanol e depois em 100% de etanol.

Mergulhe as lâminas em etanol a 100% por 10 minutos, seguido de submersão duas vezes em xileno fresco por três minutos de cada vez. Coloque uma gota de meio de montagem na amostra e uma lamínula por cima. Conte as células caliciformes ao microscópio.

Para cada pedaço de tecido intestinal, conte o número de células caliciformes e 500 células epiteliais. Em seguida, expresse as células caliciformes como uma proporção por 100 células epiteliais. Conte as células de Paneth.

Para cada pedaço de tecido intestinal, registre a proporção de células de Paneth por cripta intestinal, contando 100 criptas intestinais para cada pedaço de tecido intestinal. A exposição fetal à inflamação materna, ou FEMI, no dia embrionário 15 leva a uma perda de gravidez dependente da dose e a uma taxa dependente da dose de trabalho de parto prematuro. O FEMI induz uma lesão intestinal significativa ao nascimento e às oito semanas de vida.

Essa lesão ocorre na ausência de estímulos adicionais aos animais, sugerindo que o FEMI sozinho interrompe a homeostase normal do trato intestinal murino do recém-nascido. O número de células caliciformes produtoras de mucina e células de Paneth produtoras de peptídeos antimicrobianos no terço distal do trato intestinal delgado foi quantificado. Verificou-se que o FEMI interrompeu a composição normal do epitélio intestinal induzindo a perda de ambos os tipos celulares, em comparação com animais sem FEMI.

Para investigar os efeitos do FEMI na resposta inflamatória neonatal, uma variedade de marcadores inflamatórios séricos foram quantificados, incluindo interleucina-1 beta, interleucina-10, KCGRO e interleucina-6, do soro de filhotes com e sem FEMI. O FEMI aumentou significativamente a cascata inflamatória para todas as citocinas em P0. A cascata inflamatória em idades posteriores diferiu com base no ponto de tempo e na citocina. Curiosamente, houve níveis semelhantes de IL6 em P7 a P28 nos grupos FEMI e simulado.

No entanto, houve níveis significativamente mais altos no grupo FEMI em P56, apesar de nenhuma intervenção secundária. É fundamental realizar uma curva de dose inicial de LPS, pois diferentes estoques de LPS podem ter potências diferentes. Descobrimos que nossos resultados neonatais dependem da dose de LPS usada para induzir FEMI.