Name: Membranas lipídicas de bicamadas tethered para monitorar a transferência de calor entre nanopartículas de ouro e membranas lipídicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Aprenda a monitorar a transferência de calor de nanopartículas de ouro para membranas lipídicas de bicamadas tethered usando espectroscopia de impedância em tempo real. Este método permite avaliar efeitos fototérmicos em sistemas biomiméticos.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Descoberta do Conselho de Pesquisa Australiano (ARC) (DP150101065) e pelo Arc Research Hub for Integrated Device for End-user Analysis at Low-levels (IDEAL) (IH150100028).

1. preparação de eletrodos tBLMs
<ol><li>Preparação do primeiro revestimento de monocamadas<ol>
<li>Mergulhe um slide de microscópio eletrodo padrão de ouro recém-sputtered em uma solução etanolica composta por uma razão de 3 mM 1:9 de benzil-dissulfeto-tetra-etilenoglicol-OH "espaçador" (dissulfeto benzilo composto por um spacer de quatro oxigênio-etileno, terminou com um grupo OH) e benzil-dissulfeto (tetra-etilenoglicol) n=2 C20-fitanyl moléculas "amarradas". Isso cria o primeiro revestimento de camada para o qual um bicamado pode ser ancorado. NOTA: O eletrodo de ouro é feito evaporando 100 nm, 99,9995% de ouro (5n5 ouro) em lâminas personalizadas de 25 mm x 75 mm de policarbonato20.</li>
		<li>Incubar eletrodos com a primeira camada à temperatura ambiente por pelo menos 1 h.</li>
		<li>Enxágüe os eletrodos de ouro imergindo em quantidades abundantes de etanol puro acima de 30 s.</li>
		<li>Use o slide de eletrodo dourado com a primeira monocamada diretamente para o próximo passo ou armazene em um pote cheio de etanol puro.</li>
		<li>NOTA: Para garantir a integridade da primeira camada, minimize qualquer contato direto com as porções de ouro do slide</li>
	</ol></li>
	<li>Montando o primeiro slide revestido de monocamada<ol>
<li>Retire cuidadosamente um slide de eletrodo de ouro coplanar de seu recipiente usando pinças, tendo certeza de não fazer contato com as áreas padronizadas onde os tBLMs se formarão. NOTA: Esteja atento para identificar o lado do slide sobre o qual o ouro é depositado.</li>
		<li>Lâmina seca de ar por 1 - 2 min para remover qualquer etanol residual.</li>
		<li>Coloque o eletrodo dourado sobre uma superfície seca, certifique-se de que o eletrodo dourado seja corretamente orientado com superfície dourada estampada voltada para cima.</li>
		<li>Descasque a tampa da camada adesiva transparente de um laminado fino e coloque sobre os 6 canais para definir cada poço.</li>
		<li>Use um rolo de pressão para liberar qualquer ar entre o slide e a camada adesiva transparente, conforme mostrado na Figura 1A. NOTA: O tempo necessário para esta etapa precisará ser otimizado pelo pesquisador. Neste protocolo, os tempos variam de 2 a 3 minutos.</li>
		<li>Introduza assim que possível (dentro de 1-2 minutos) a segunda bicamada lipídica ao primeiro eletrodo revestido de monocamada montado para auto-montagem para evitar danificar a primeira camada.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do segundo bicamógrafo lipídudo<ol>
<li>Adicione 6 μL de lipídios de 3 mM de interesse ao primeiro poço do slide de seis poços. Não deixe que a borda da ponta da micropipette toque na superfície dourada, o que pode danificar as químicas amarradas no eletrodo. NOTA: A mistura lipídica utilizada neste trabalho consistiu em 3 mM 70% zwitterionic C20 diphytanyl-ether-glycero-fosphasphatidylcholina (DPEPC) e 30% Lipídios de diphytanyldiglyceride C20 (GDPE) misturados com 3 mM de colesterol-PEG-Biotina na razão molar 50:1.</li>
		<li>Introduza 6 μL da mistura lipídica aos outros poços com uma diferença de 10 s entre cada adição.</li>
		<li>Incubar cada poço por exatamente 2 minutos à temperatura ambiente antes de trocar a mistura lipídica sobre os eletrodos com um tampão como PBS. Estoque os tempos para a adição e troca de buffer 10 s separados para que cada poço seja incubado com o lipídio por exatamente 2 min cada.</li>
		<li>Lave mais 3 vezes com 50 μL de tampão PBS (pH 7.0). Certifique-se de deixar 50 μL de tampão sobre os eletrodos o tempo todo. Não deixe os eletrodos secarem. NOTA: Deslocar o solvente de etanol com a solução aquosa desta forma (o método de troca de solventes) permite a rápida formação de um único bicamado lipídeca ancorado no eletrodo de ouro através das químicas amarradas.</li>
	</ol></li>
	<li>Testando a formação do TBLM usando medições de espectroscopia de impedância elétrica (EIS)<ol>
<li>Insira slide de eletrodo preparado em um espectrômetro de impedância CA (por exemplo, Tethapod). Certifique-se de que o espectrômetro esteja conectado através de uma porta USB a um computador que executa o software.</li>
		<li>Abra o software, clique em Configurar e abra hardware.</li>
		<li>Defina as configurações de hardware para usar a excitação AC de pico ao pico de 25 mV.</li>
		<li>Definir frequências entre 0,1 e 10.000 Hz com dois passos por década para medidas de impedância rápida pressione ok.</li>
		<li>Clique no menu Configuração e abra o Modelo.</li>
		<li>Use um modelo de circuito equivalente que descreve o eletrodo de ouro amarrado como um elemento de fase constante em série com um resistor descrevendo o tampão eletrólito e uma rede de resistor-capacitor paralelo para descrever a bicamada lipídica, e pressione OK.</li>
		<li>Pressione o botão Iniciar para iniciar uma medição em tempo real da capacitância da membrana (Cm) e da condução da membrana (Gm). Os valores Cm dos tBLMs típicos devem estar na faixa de 12,5 nF a 15,5 nF para 10% de químicas amarradas21,22.</li>
		<li>Depois de executar o protocolo e terminar o experimento, salve os dados.</li>
		<li>Repita a medição com o próximo poço.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Irradiação a laser
<ol><li>Configuração experimental NOTA: O sistema personalizado é configurado para cada tBLM bem individualmente.<ol>
<li>Realize experimentos em uma caixa à prova de luz para minimizar o laser perigosamente.</li>
		<li>Use uma tabela óptica para configurar o experimento para reduzir vibrações indesejadas.</li>
		<li>Coloque o leitor de impedância, onde está o slide de ouro conectado, em um estágio XYZ e eleve de tal forma que ele se sente no caminho da fonte laser.</li>
		<li>Use engrenagens microscópicas de foco grosseiras para controlar a altura da fonte laser para obter a precisão adequada.</li>
		<li>Direja o caminho laser ao longo do eixo longitudinal do slide do eletrodo. ATENÇÃO: Use sempre óculos de segurança a laser adequados e mantenha bons protocolos de segurança a laser.</li>
		<li>Permita que o laser ajustado selecionado se estabilize antes de iniciar o experimento. NOTA: Um esquema da configuração experimental é ilustrado na Figura 2A.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alinhamento de eletrodos a laser e ouro NOTA: Antes de começar, avalie sempre a saída de energia do laser usando um medidor de potência para garantir que apenas potências muito baixas sejam entregues aos tBLMs.<ol>
<li>Ajuste o caminho do laser ou o ângulo do eletrodo de modo que o laser passe pelo líquido que cobre o eletrodo e seja apenas visível, uniformemente, na superfície dourada.</li>
		<li>Ajuste a posição de luz do feixe de laser para cada experimento, levantando ou baixando a fonte do feixe de laser usando o ajuste fino enquanto observa alterações na condução da membrana.</li>
		<li>Bloqueie o botão para fixar a posição do caminho do laser quando não forem observadas alterações de condução. NOTA: O aumento dos valores de condutância da membrana será gerado quando o laser interagir com o eletrodo de ouro subjacente. É, portanto, importante ajustar o caminho do laser para que tais interações não sejam possíveis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação da amostra<ol>
<li>Prepare o alinhamento da luz do feixe de laser (onde não há alteração na conduance da membrana), como mostrado na Figura 2, posição 3.</li>
		<li>Adicione GNPs de interesse (funcionalizados ou nus) ao buffer PBS no qual os tBLMs estão imersos enquanto o laser é desligado.</li>
		<li>Misture o buffer PBS ao redor dos tBLMs suavemente três vezes, tomando cuidado para não tocar no eletrodo.</li>
		<li>Incubar por 5-10 min em temperatura ambiente.</li>
		<li>Ligue o laser para irradiar a amostra, usando a posição correta de luz do feixe de laser alinhada, como visto na Figura 2, posição 3.</li>
		<li>Use a combinação apropriada de tamanho, forma e concentração de GNPs com comprimento de onda de luz laser. NOTA: O feixe laser do comprimento de onda definido deve acoplado à frequência de ressonância plasmon GNP correspondente.</li>
		<li>Registro medido continuamente (medições em tempo real).</li>
		<li>Realizar as etapas 2.2.1 - 2.3.7, omitindo a adição de GNP para os experimentos de controle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Análise e apresentação de dados estatísticos
<ol><li>Exporte os dados para uma planilha.</li>
	<li>Extrair o parâmetro de condutância da membrana versus o tempo.</li>
	<li>Use os dados gravados após definir uma luz de feixe de laser com a posição certa e antes da introdução dos GNPs.</li>
	<li>Normalize os dados dividindo a conduciência da membrana medida sobre a conduciência da membrana de base. NOTA: Isso confirma que alterações relativas nos valores de condução da membrana provocadas por GNPs irradiados introduzidos.</li>
	<li>Apresentar dados como parcelas de tempo (x-eixo) versus condução de membrana normalizada (eixo y).</li>
</ol>4. Prever a quantidade de calor localizado gerado nos tBLMs a partir de nanopartículas irradiadas (modelo preditivo térmico)
<ol><li>Resolva o problema da transferência de radiação de acordo com Dombrovsky23, a fim de calcular o poder de radiação absorvido em soluções de nanopartículas irradiadas.</li>
	<li>Calcule a geração de calor incorporando a fonte de calor devido à radiação absorvida na equação de energia. NOTA: Para uma explicação detalhada da análise numérica da geração de calor nos tBLMs a partir de nanopartículas irradiadas e da interface nanomaterial-eletrodo, consulte 19.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram os seguintes interesses financeiros/relações pessoais, que podem ser considerados como potenciais interesses concorrentes: Prof. Bruce Cornell é Diretor - Ciência e Tecnologia na Surgical Diagnostics SDx tethered membranas Pty. Ltd.

Este protocolo descreve o uso do modelo tBLM com um substrato de eletrodos coplanar em conjunto com uma configuração de alinhamento a laser horizontal que permite a gravação de impedância elétrica em tempo real em resposta à irradiação a laser de nanopartículas de ouro. O método de gravação do EIS apresentado aqui constrói uma lista mínima de experimentos necessários para fornecer o registro de mudanças de corrente de íon em toda a membrana, o que corresponde ao calor gerado pela interaçã...

O desempenho hipertérmico de nanomateriais de ouro irradiado oferece uma nova classe de tratamento minimamente invasivo, seletivo e direcionado para infecções e tumores1. O emprego de nanopartículas que podem ser aquecidas por um laser tem sido usado para destruir seletivamente células doentes, bem como fornecer um meio para o parto seletivo de medicamentos2,3. Uma consequência dos fenômenos da fototermólise de nanopartículas plasmônicas aquecidas é danos às membranas celulares. A membrana de bicamadas lipídicas fluidas é considerada um local particularmente vulnerável para as células submetidas a tais tratamentos, pois a desnaturação de proteínas de membrana intrínseca, bem como danos à membrana, também pode levar à morte celular4, já que muitas proteínas estão lá para manter o gradiente potencial iônico entre as membranas celulares. Embora a capacidade de determinar e monitorar a transferência de calor na nanoescala seja de interesse fundamental para o estudo e aplicação de GNPs irradiados1,5,6,7, avaliação e compreensão das interações moleculares entre GNPs e bio-membranas, bem como as consequências diretas dos fenômenos de aquecimento induzidos a laser de GNPs incorporados em tecidos biológicos, ainda estão para ser totalmente elucidado8. Portanto, uma compreensão completa do processo de hipertermia dos GNPs irradiados continua a ser um desafio. Como tal, o desenvolvimento de uma interface nanomaterial-eletrodo que imita o ambiente natural das células poderia fornecer um meio para realizar uma investigação aprofundada das características de transferência de calor de nanopartículas de ouro irradiadas dentro de sistemas biológicos.
A complexidade das membranas celulares nativas é um dos desafios significativos na compreensão das interações irradiadas de GNPs nas células. Existem várias plataformas de membrana artificial desenvolvidas para fornecer versões bio miméticas simples de arquitetura e funcionalidade de membrana lipídica natural, incluindo, mas não se limitando a, membranas lipídicas pretas9,membranas bicamadas apoiadas10,membranas bicamadas híbridas11,membranas lipídicas com almofadas de polímero12 e membranas lipídicas bicamadasamarradas 13. Cada modelo de membrana lipídica artificial tem vantagens e limitações distintas no que diz respeito à imitação das membranas lipídicas naturais14.
Este estudo descreve o emprego de eletrodos revestidos de membrana lipídica como um sensor para avaliar as interações de nanopartículas de ouro e membrana lipídica, utilizando o modelo tBLM. O esquema de detecção de biosensor baseado em tBLM fornece estabilidade e sensibilidade inerentes13, pois as membranas amarradas podem se auto-reparar, ao contrário de outros sistemas (como membranas formadas por patch-clamp ou lipossomos) em que apenas uma pequena quantidade de dano de membrana resulta em seu colapso15,16,17,18. Além disso, como os tBLMs são de dimensões mm2, a impedância de fundo é ordens de magnitude inferiores às técnicas de gravação de grampos, o que permite o registro de alterações no fluxo iônico da membrana basal devido às interações com nanopartículas. Como resultado disso, o presente protocolo pode contrastar mudanças na condutância da membrana por GNPs vinculados que são animados por lasers cujos poderes são tão baixos quanto 135 nW/μm2.
O sistema aqui apresentado fornece um método sensível e reprodutível para determinar parâmetros precisos de laser, tamanho de partículas, revestimentos de partículas e composição necessários para projetar e desenvolver terapias térmicas. Isso é fundamental para o refinamento de terapias fototérmicas emergentes, além de oferecer informações valiosas para mecanismos detalhados de transferência de calor dentro de sistemas biológicos. O protocolo apresentado baseia-se no trabalho publicado anteriormente19. Um esboço do protocolo é o seguinte: a primeira seção define a formação tBLM; a segunda seção descreve como construir a configuração e alinhar a fonte de laser de excitação; a seção final ilustra como extrair informações dos dados de espectroscopia de impedância elétrica.

<table><tbody><tr><td>Nanopartículas de ouro conjugadas com estreptavidina de 30 nm de diâmetro</td><td>Cytodiagnostics</td><td>AC-30-04-05</td><td>Este é um produto GNPs conjugado com estreptavidina pronto para uso</td></tr><tr><td>nanopartículas de ouro nuas de 30 nm de diâmetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>753629</td><td>Este é um produto GNPs nu pronto para uso</td></tr><tr><td>Colesterol-PEG-Biotina (MW1000)</td> <td>NANOCS</td><td>PG2-BNCS-10k</td><td>Dissolvido em etanol</td></tr> <tr><td>altamente puroC20 Lipídios de difitanil-glicero-fosfatidilcolina</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-S1</td><td>frasco para injetáveis de vidro de 1 ml contendo 70% de difitanil fosfatidilcolina C16 (DPEPC) e 30% de difitanil glicerol C16 (GDPE) em 99,9% de etanol</td></tr><tr><td>Benzil-dissulfeto-tetra-etilenoglicol-OH</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-S2</td><td>Espaçador de moléculas</td></tr><tr><td>Benzil-dissulfeto (tetra-etilenoglicol) n=2 C20-fitanil&nbsp;</td><td>Membranas Amarradas SDx Pty. Ltd.</td><td>SDx-S2</td><td>Moléculas amarradas</td></tr><tr><td>532 nm laser verde luz contínua</td><td>OBIS LS/OBIS CORE LS, China</td><td>ND-1000</td><td>A potência deste laser era ~135&nbsp; mW&nbsp;</td></tr><tr><td>leitor tethaPod EIS</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-R1</td><td>Um leitor de condutância e capacitância em seis canais simultaneamente</td></tr><tr><td>conjunto de cartucho tethaPlate</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-BG</td><td>Materiais para prender a corrediça com eletrodos ao cartucho da célula de fluxo</td></tr><tr><td>Braçadeira e gabarito de montagem da corrediça</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td><td>SDx-A1</td><td>Materiais para prender a lâmina com eletrodos ao cartucho da célula de fluxo</td></tr><tr><td>Eletrodos de ouro coplanar revestidos com lipídios</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>Os eletrodos de ouro coplanar <td>SDx-T10</td><td>são feitos de 25 mm x 75 mm x&nbsp; 1&nbsp; mm substrato à base de policarbonato com layout de matrizes de ouro padronizado, depois revestido com benzildissulfeto, bis-tetraetilenoglicol C16 meia membrana de phytanyl abrangendo amarras em uma proporção de 10%&nbsp;</td></tr><tr><td>software tethaQuick</td><td>SDx Tethered Membranes Pty. Ltd.</td>Software <td>SDx-B1</td><td>para uso com tethaPod para processar dados e exibir medições de condutância, impedância e capacitância dos eletrodos tethaPlate</td></tr><tr><td>&nbsp; 99,9% de etanol puro</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34963</td><td>Absoluto,&nbsp; 99,9%</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>pH 7</td></tr></tbody></table>

membranas lipídicas de bicamadas tethered para monitorar a transferência de calor entre nanopartículas de ouro e membranas lipídicas

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Aqui relatamos um protocolo para investigar a transferência de calor entre nanopartículas de ouro irradiadas (GNPs) e membranas lipídicas bicamadas por eletroquímica usando membranas lipídicas bicamadas amarradas (tBLMs) montadas em eletrodos de ouro. Os GNPs modificados irradiados, como os GNPs conjugados com estreptavidina, estão incorporados em tBLMs contendo moléculas-alvo, como a biotina. Usando essa abordagem, os processos de transferência de calor entre GNPs irradiados e membrana lipídica bicamada modelo com entidades de interesse são mediados por um raio laser horizontalmente focado. O modelo computacional preditivo térmico é usado para confirmar as mudanças de condutância eletroquimicamente induzidas nos tBLMs. Sob as condições específicas utilizadas, a detecção de pulsos de calor exigia fixação específica das nanopartículas de ouro à superfície da membrana, enquanto as nanopartículas de ouro não ligadas não conseguiram obter uma resposta mensurável. Esta técnica serve como um poderoso biosensor de detecção que pode ser utilizado diretamente para o design e desenvolvimento de estratégias para terapias térmicas que permitem a otimização dos parâmetros de laser, tamanho das partículas, revestimentos de partículas e composição.

O substrato de ouro sobre o qual os tBLMs podem ser criados é mostrado na Figura 1. Um esquema da configuração experimental é apresentado na Figura 2.
Os eletrodos de ouro coplanar, como mostrado na Figura 1A,são feitos de substrato de base de policarbonato de 25 mm x 75 mm x 1 mm com matrizes de ouro padronizadas. Uma camada adesiva transparente define as seis câmaras de medição individuais. O eletrodo d...

Este trabalho descreve um protocolo para alcançar o monitoramento dinâmico e não invasivo da transferência de calor de nanopartículas de ouro irradiadas a laser para tBLMs. O sistema combina espectroscopia de impedância para a medição em tempo real de mudanças de condução através dos tBLMs, com um raio laser horizontalmente focado que impulsiona a iluminação de nanopartículas de ouro, para produção de calor.

Membranas lipídicas de bicamadas tethered para monitorar a transferência de calor entre nanopartículas de ouro e membranas lipídicas

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

Este protocolo oferece uma interface de eletrodo de nanomaterial que imita as membranas celulares naturais, tornando possível determinar o efeito da transferência de calor localizada de nanopartículas de ouro irradiadas na integridade de uma membrana biológica. Os efeitos de nanopartículas e fototérmicos podem ser explorados em tempo real em membranas celulares modelo. Esta técnica usa um sistema de membrana biomimética para observar e interrogar os efeitos fototérmicos em um sistema biológico resultante do calor gerado devido à interação de nanopartículas de ouro com a luz, medindo as mudanças de condutância e capacitância através da membrana celular modelo.O uso de nanopartículas e terapia fototérmica está se mostrando muito promissor como potencial terapia contra o câncer. Este método fornece informações diretas sobre como essa abordagem afeta as células. Esta plataforma fornece dados valiosos para projetar estratégias para terapias térmicas que permitem a otimização dos parâmetros do laser, tamanho de partícula, revestimentos de partículas e composição.Demonstrando o procedimento estarão os pesquisadores da UTS, a professora Stella Valanzuela e o Dr. Amani Alghalayini, juntamente com o professor Bruce Cornell de diagnósticos cirúrgicos. Para começar, retire cuidadosamente uma lâmina de eletrodo de ouro coplanar de seu recipiente usando uma pinça, tomando cuidado para não entrar em contato com as áreas padronizadas onde o tBLMS se formará. Seque a lâmina ao ar por um a dois minutos para remover qualquer etanol residual.Em seguida, coloque o eletrodo de meta sobre uma superfície seca com a superfície dourada padronizada voltada para cima. Retire a cobertura da camada adesiva transparente de um laminado fino e coloque-a sobre os seis canais para definir cada poço. Use um rolo de pressão para liberar o ar entre a lâmina e a camada adesiva transparente.Dentro de um a dois minutos, introduza a segunda bicamada lívida no primeiro eletrodo revestido de monocamada montado para automontagem. Adicione seis microlitros de lipídios de três milimolares de interesse ao primeiro poço da lâmina de seis poços sem tocar a borda da ponta da micropipeta na superfície dourada, o que pode danificar os produtos químicos amarrados no eletrodo. Introduza seis microlitros da mistura lipídica nos outros poços com um intervalo de dez segundos entre cada edição.Incube cada poço por exatamente dois minutos em temperatura ambiente. Troque a mistura lipídica sobre os eletrodos por um tampão como PBS, espaçando os tempos para a adição e troca de tampão com 10 segundos de intervalo, de modo que cada poço seja incubado com um lipídio por exatamente dois minutos. Lave os eletrodos mais três vezes com 50 microlitros de tampão PBS, deixando sempre 50 microlitros de tampão sobre os eletrodos e não deixando secar.Insira a lâmina do eletrodo preparada em um espectrômetro de impedância CA. Certifique-se de que o espectrômetro esteja conectado a um computador executando o software via porta USB. Abra o software, clique em configurar e abra o hardware.Defina as configurações de hardware para usar 25 milivolts falar com o pico de citação ACX e definir as frequências entre 0,5 e 10.000 hertz com duas etapas por década para medidas rápidas de impedância. Pressione OK, clique no menu de configuração e abra o modelo. Usando um modelo de circuito equivalente que descreve o eletrodo de ouro de amarração como um elemento de fase constante em série com o buffer de eletrólito como um resistor e uma rede de capacitores de resistor paralelo para descrever a bicamada lipídica, pressione ok.Pressione o botão Iniciar para iniciar uma medição em tempo real da capacitância da membrana e da condução da membrana. Depois de executar o protocolo e concluir o experimento, salve os dados. Repita a medição com o próximo poço.Use uma mesa óptica para configurar o experimento para reduzir vibrações indesejadas e realizar experimentos em uma caixa à prova de luz para minimizar o risco do laser. Amarre o leitor de impedância onde o lado dourado está conectado em um estágio XYZ. E eleve-o de forma que fique no caminho da fonte de laser.Use uma engrenagem microscópica de foco de localização grosseira para controlar a altura da fonte de laser para alcançar a posição apropriada. Direcione o caminho do laser ao longo do eixo longitudinal da lâmina do eletrodo e permita que o laser sintonizado selecionado se estabilize. Antes de começar, avalie a potência do laser usando um medidor de potência para garantir que apenas potências muito baixas sejam fornecidas aos tBLMs.Ajuste o caminho do laser ou o ângulo do eletrodo, de modo que o laser passe pelo líquido que cobre o eletrodo e seja visível uniformemente na superfície dourada. Ajuste a posição da luz do feixe de laser para cada experimento aumentando ou diminuindo a fonte do feixe de laser usando o ajuste fino enquanto observa as mudanças na condutância da membrana. Trave o botão para proteger a posição do caminho do laser quando não houver alterações de condutância observadas devido à interação do laser com o eletrodo de ouro subjacente.Repare o alinhamento da luz do feixe de laser e adicione nanopartículas de ouro de interesse ao buffer PBS onde os tBLMs são imersos enquanto o laser está desligado. A lâmina coplanar do eletrodo de ouro com seis poços foi finalmente definida pela adição de uma fina camada adesiva transparente. O modelo tBLM consiste em um espaçador e moléculas amarradas à superfície do substrato de ouro para formar a primeira camada e lipídios não ligados na segunda camada.A representação esquemática das diferentes posições de alinhamento horizontal do laser e os registros de condutância normalizados ao longo do tempo correspondentes às diferentes posições de alinhamento são mostrados aqui. As mudanças na condutância da membrana nas posições um e dois são devidas ao calor das interações do laser com nanoestruturas dentro dessa camada de ouro com manteiga. Focalizar a luz laser horizontal diretamente no eletrodo de ouro causa um aumento na condutância da membrana.A posição precisa do laser revelou uma variação insignificante nos registros de condutância da membrana durante os períodos de laser ligado e desligado. A adição de divisão estreptocócica e nanopartículas de ouro conjugadas de 30 nanômetros aos tBLMs mostrou uma clara diferença entre os períodos de ativação e desativação do laser, bem como aumentos distintos na conduta e Samplitude durante a fase de ativação do laser. O alinhamento cuidadoso e preciso do caminho do laser em direção ao tampão que envolve a membrana da bicamada lipídica é uma etapa crítica neste protocolo.O modelo preditivo térmico pode ser usado para fornecer a determinação matemática da quantidade de calor localizado gerado por cada PNB. Esta técnica determina a eficiência do fornecimento de calor dentro dos tecidos biológicos e destaca o papel dos tratamentos de hipertermia GNP irradiados direcionados in vivo.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Colóides de ouro Alkanethiolate estabilizado conhecidos como clusters monocamada protegidas (PPM) são sintetizados, caracterizados, e montada em filmes finos como uma interface para a adsorção eletroquímica proteína monocamada de proteína redox simples,...

Síntese, Assembléia e Caracterização de monocamada Protected Films nanopartículas de ouro para Eletroquímica monocamada Protein

Nanotubos de solução-suspendable ouro com dimensões controladas podem ser sintetizados por deposição electroquimica em porosos anódica de óxido de alumínio (AAO) membranas utilizando um núcleo de polímero hidrofóbico. Nanotubos de ouro e matrizes de nanotubos de manter a promessa para aplicações em biosensoriamento plasmonic, superfície melhorada espectroscopia Raman, foto-térmico de aquecimento, transporte iônico e molecular, microfluídica, catálise e sensoriamento eletroquímica.

Dirigido modelo de síntese de nanotubos de Ouro plasmônicos com Absorbância IR Tunable

Descrevemos os protocolos utilizados para investigar as interações de 13,56 MHz de radiofreqüência (RF) elétricos campos com colóides de nanopartículas de ouro em ambos os sistemas não-biológicos e biológicos (in vitro / in vivo). Essas interações estão sendo investigados para aplicações na terapia do câncer.

Protocolos para Avaliação de radiofreqüência Interações com Nanopartículas de Ouro e Sistemas biológicos para terapia não-invasiva Câncer Hipertermia

Descrevemos a síntese e as propriedades de nanopartículas multifuncionais de Fe2O3-Au produzidas por uma abordagem química úmida e investigamos suas propriedades fototérmicas usando irradiação a laser. As nanopartículas compostas de Fe2O3-Au retêm as propriedades de ambos os materiais, criando uma estrutura multifuncional com excelentes propriedades magnéticas e plasmônicas.

Híbrido multifuncional Fe<sub&gt; 2</sub&gt; ó<sub&gt; 3</sub&gt; -au Nanopartículas para Aquecimento plasmonic Eficiente

Este protocolo descreve um método de preparação simples para nanopartículas de ouro integrado lipossomas foto-sensível com os materiais disponíveis no mercado. Também mostra como medir o processo de cavitação microbolhas dos lipossomas sintetizados mediante o tratamento de laser pulsado.

Síntese de nanopartículas de ouro lipossomas Integrated Photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação

Apresenta-se um protocolo para funcionalizar vidro com manchas proteicas nanométricas rodeado por uma bicamada lipídica fluida. Estes substratos são compatíveis com microscopia óptica avançado e espera-se para servir como plataforma para estudos de adesão celular e de migração.

Matrizes ligando Nano-fragmentação em uma bicamada lipídica Compatível

Nós descrevemos um método de síntese de nanopartículas de ouro 10 nm biocompatíveis, acrescidas por revestimento Poli-etileno glicol para a superfície. Estas partículas podem ser usados em vitro e em vivo para distribuir terapêutica a nanoescala celular e extracelular espaços que são difíceis de acesso com tamanhos convencionais de nanopartículas.

Síntese de funcionalizados 10 nm polímero-revestida com partículas de ouro para o direcionamento do endotélio e entrega da droga

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o mecanismo molecular de translocação de prótons através das membranas lipídicas de lipossomas único, usando citocromo bo3  como exemplo. Combinando a eletroquímica e microscopia de fluorescência, mudanças de pH no lúmen do única vesículas, contendo uma única ou várias enzimas, podem ser detectados e analisados individualmente.

Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

Aqui, mostramos o uso da microscopia tradicional de campo escuro para monitorar a dinâmica dos nanorods de ouro (AuNRs) na membrana celular. A localização e orientação de AuNRs únicos são detectadas usando ImageJ e MATLAB, e os estados difusivos de AuNRs são caracterizados por uma análise de rastreamento de partículas únicas.

Visualizando dinâmica difusional de nanorods de ouro na membrana celular usando microscopia de campo escuro de nanopartícula única

Este protocolo descreve como usar a microscopia TIRF para rastrear canais iônicos individuais e determinar sua atividade em membranas lipídicas suportadas, definindo assim a interação entre o movimento da membrana lateral e a função do canal. Ele descreve como preparar as membranas, registrar os dados e analisar os resultados.

Imagem de molécula única da mobilidade lateral e atividade do canal iônico em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total (TIRF)

O método de punção termoplasmônica integra microscopia confocal, pinças ópticas e nanopartículas de ouro para estudar as respostas proteicas durante o reparo da membrana plasmática em células e vesículas unilamelares gigantes. A técnica permite a punção rápida e localizada da membrana, permitindo a identificação de proteínas-chave e seus papéis funcionais na intrincada maquinaria de reparo da membrana plasmática.

Uma Abordagem Termoplasmônica para Investigação do Reparo da Membrana Plasmática em Células Vivas e Membranas Modelo

Aprenda a monitorar a transferência de calor de nanopartículas de ouro para membranas lipídicas de bicamadas tethered usando espectroscopia de impedância em tempo real. Este método permite avaliar efeitos fototérmicos em sistemas biomiméticos.

Membranas lipídicas de bicamadas tethered para monitorar a transferência de calor entre nanopartículas de ouro e membranas lipídicas (Vídeo) | JoVE Journal

Membranas lipídicas de bicamadas tethered para monitorar a transferência de calor entre nanopartículas de ouro e membranas lipídicas

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