Injeções de pupal e adultos para edição de genes RNAi e CRISPR em Nasonia vitripennis

Aqui, descrevemos métodos para injeções pupais eficientes e adultas em Nasonia vitripennis como alternativas acessíveis à microinjeção de embriões, permitindo a análise funcional de genes de interesse usando RNA-silenciamento via interferência de RNA (RNAi) ou nocaute genético via edição de genoma CRISPR/Cas9.

A pesquisa sobre o modelo de inseto não canônico, como a vespa parasitóide, é limitada porque a microinjeção embrionária é muito desafiadora. Nosso método contorna esse problema, permitindo mutações germinativas hereditárias e específicas do local. A injeção de pupas ou fêmeas adultas é rápida e elimina a necessidade de equipamentos caros ou treinamento especializado necessário para obter microinjeções embrionárias bem-sucedidas.

Essa técnica não permitirá que laboratórios especializados que não tenham acesso a equipamentos caros façam estudos funcionais em qualquer espécie de inseto que estejam usando como modelo. Após a otimização, este método pode ser usado para estudar a genética funcional de muitos outros genes em Nasonia. Também achamos que esse método pode ser usado para fornecer ácidos nucléicos para a transformação genética de Nasonia ou outros insetos.

Comece instalando aproximadamente 20 fêmeas acasaladas singularmente em pequenos tubos de ensaio de vidro tampados com algodão. Adicione dois hospedeiros de S.bullata por tubo e mantenha as vespas a 25 graus Celsius e 30% de umidade relativa com um ciclo escuro claro de 12:12 por dois a três dias. Após dois a três dias, remova suavemente as fêmeas usando uma escova de ponta fina para evitar uma posição contínua e uma sincronia no desenvolvimento da prole.

As fêmeas removidas podem, opcionalmente, ser hospedadas novamente ou armazenadas a cinco graus Celsius por até um mês. Mantenha o hospedeiro parasitado a 25 graus Celsius e 30% de umidade relativa com um ciclo claro escuro de 12:12 por sete dias se o estágio de injeção desejado exigir pupas brancas, por 13 dias, se o estágio de desenvolvimento necessário for pupas pretas ou 14 dias para adultos jovens recém-emergidos. Quando o estágio desejado for alcançado, abra o pupário hospedeiro com uma agulha de dissecação para recuperar as pupas de N. vitripennis e os adultos.

Prepare uma lâmina de vidro aplicando uma linha de cola escolar no centro. Espalhe a cola com a agulha de dissecação para obter uma camada espessa, que será usada para alinhar as pupas. Deixe a cola secar por aproximadamente dois minutos antes de transferir as pupas.

Sob um microscópio de dissecação, use uma agulha de dissecação para aplicar cola na parte de trás da cabeça da pupa. Prenda a pupa à camada de cola na lâmina com o abdômen voltado para cima. Alinhe 20 a 30 pupas lado a lado na lâmina.

Coloque a lâmina com as pupas e uma placa de Petri para deixar a cola agir por aproximadamente 10 minutos. Antes de iniciar as injeções, teste a aderência das pupas à cola empurrando-as suavemente com a agulha de dissecação. Se a maioria das pupas estiver solta, prepare uma nova lâmina.

Em alternativa, remova todas as pupas soltas e proceda à injeção das que estão devidamente fixadas à lâmina. Carregue um tubo de vidro capilar em um extrator de agulhas e puxe as agulhas seguindo as instruções do fabricante. Carregue a agulha com cinco microlitros da mistura de injeção preparada usando pontas de pipeta microcarregadeiras.

Abra a agulha, deslizando a ponta sobre uma superfície feita de duas lâminas sobrepostas. Como alternativa, abra a ponta da agulha com uma pinça fina para criar uma borda afiada. Coloque a lâmina com as pupas alinhadas sob um microscópio de dissecação, insira a agulha no tubo de injeção do femtojet e aperte a cabeça do punho.

Olhando para a agulha sob o microscópio, ligue o femtojet e defina os parâmetros de pressão de compensação e pressão de injeção girando os botões giratórios. Insira cuidadosamente a agulha entre o segundo e o terceiro segmentos abdominais visíveis com um ângulo vertical de cerca de 30 graus. Injetar com um fluxo contínuo até que todo o abdómen fique verde no caso das pupas brancas ou até que o abdómen aumente de tamanho no caso das pupas pretas.

Pare de injetar quando estiver claro que o abdômen não pode absorver mais líquido ou quando o líquido começar a fluir para fora do corpo. Mova-se cuidadosamente para a próxima pupa e repita essas etapas. Transfira a lâmina com as pupas injetadas para uma placa de Petri.

Cubra o prato com a tampa e coloque-o a 25 graus Celsius até a emergência da vespa. Para a preparação de adultos, separe grupos de 20 fêmeas virgens em um pequeno tubo de ensaio limpo com um pincel fino. Coloque uma lâmina de vidro em cima do gelo e alinhe a fêmea lado a lado na lâmina fria com o abdômen voltado para cima sob um escopo de dissecação.

Carregue uma agulha com a solução de ribonucleoproteína usando uma ponta de microcarga e insira a agulha no pacote de conectores do conjunto do tubo aspirador. Apoie as fêmeas do lado oposto com agulhas de dissecação embotadas, enquanto injeta lentamente no abdômen. Evite tocar no ovipositor.

Isso danificará gravemente essa estrutura reprodutiva crítica. Insira cuidadosamente a agulha entre o segundo e o terceiro segmentos abdominais visíveis com um ângulo vertical de cerca de 30 graus. Injete a solução no abdômen feminino, parando quando não houver mais líquido ou quando for observado vazamento do excesso de solução.

Mova-se cuidadosamente para a próxima fêmea e repita essas etapas. Quando terminar, transfira suavemente uma única fêmea injetada para um novo tubo com um hospedeiro usando um pincel. Deixe-os se recuperar em temperatura ambiente por aproximadamente uma hora, confirme a sobrevivência e devolva os tubos à incubadora de criação.

Após a eclosão adulta das pupas injetadas, coloque vespas individuais em um copo para tampar com algodão e insira um hospedeiro de S. bullata. Para experimentos de nocaute CRISPR/Cas9, permita que as fêmeas parasitem o hospedeiro por um dia e substituam o hospedeiro a cada dia por três dias consecutivos. Posicionar o hospedeiro parasitado, fixado 25 graus Celsius até a emergência da prole G0 macho, aproximadamente 13 a 14 dias.

Sob um microscópio de dissecação, rastreie os machos G0 para os fenótipos mutados. O gene cinábrio é responsável pela pigmentação ocular. Vespas com olhos castanhos são do tipo selvagem e vespas com olhos vermelhos brilhantes ou variações entre olhos vermelhos e castanhos são mutantes.

Este protocolo pode ser usado para microinjeção em pupas ou adultos. As taxas de sobrevivência deste procedimento variam de 15 a 100%A eficiência de alcançar o fenótipo desejado via RNAi ou CRISPR sem a necessidade de injeções laboriosas de ovos é mostrada aqui. Ao injetar pupas ou fêmeas adultas, a agulha deve ser afiada e introduzida de forma que o líquido não vaze imediatamente após a injeção.

Se isso acontecer, remova a agulha, certifique-se de que a ponta esteja fina e afiada, troque-a se necessário ou injete em um local diferente. A análise da função pode ser realizada no gene de interesse visado por este procedimento. Isso responderá a uma pergunta sobre a função do gene e se o gene é necessário para o fenótipo específico estudado.