Injeções de pupal e adultos para edição de genes RNAi e CRISPR em Nasonia vitripennis
4 de dezembro de 2020
Aqui, descrevemos métodos para injeções pupais eficientes e adultas em Nasonia vitripennis como alternativas acessíveis à microinjeção de embriões, permitindo a análise funcional de genes de interesse usando RNA-silenciamento via interferência de RNA (RNAi) ou nocaute genético via edição de genoma CRISPR/Cas9.
A pesquisa sobre o modelo de inseto não canônico, como a vespa parasitóide, é limitada porque a microinjeção embrionária é muito desafiadora. Nosso método contorna esse problema, permitindo mutações germinativas hereditárias e específicas do local. A injeção de pupas ou fêmeas adultas é rápida e elimina a necessidade de equipamentos caros ou treinamento especializado necessário para obter microinjeções embrionárias bem-sucedidas.
Essa técnica não permitirá que laboratórios especializados que não tenham acesso a equipamentos caros façam estudos funcionais em qualquer espécie de inseto que estejam usando como modelo. Após a otimização, este método pode ser usado para estudar a genética funcional de muitos outros genes em Nasonia. Também achamos que esse método pode ser usado para fornecer ácidos nucléicos para a transformação genética de Nasonia ou outros insetos.
Comece instalando aproximadamente 20 fêmeas acasaladas singularmente em pequenos tubos de ensaio de vidro tampados com algodão. Adicione dois hospedeiros de S.bullata por tubo e mantenha as vespas a 25 graus Celsius e 30% de umidade relativa com um ciclo escuro claro de 12:12 por dois a três dias. Após dois a três dias, remova suavemente as fêmeas usando uma escova de ponta fina para evitar uma posição contínua e uma sincronia no desenvolvimento da prole.
As fêmeas removidas podem, opcionalmente, ser hospedadas novamente ou armazenadas a cinco graus Celsius por até um mês. Mantenha o hospedeiro parasitado a 25 graus Celsius e 30% de umidade relativa com um ciclo claro escuro de 12:12 por sete dias se o estágio de injeção desejado exigir pupas brancas, por 13 dias, se o estágio de desenvolvimento necessário for pupas pretas ou 14 dias para adultos jovens recém-emergidos. Quando o estágio desejado for alcançado, abra o pupário hospedeiro com uma agulha de dissecação para recuperar as pupas de N. vitripennis e os adultos.
Prepare uma lâmina de vidro aplicando uma linha de cola escolar no centro. Espalhe a cola com a agulha de dissecação para obter uma camada espessa, que será usada para alinhar as pupas. Deixe a cola secar por aproximadamente dois minutos antes de transferir as pupas.
Sob um microscópio de dissecação, use uma agulha de dissecação para aplicar cola na parte de trás da cabeça da pupa. Prenda a pupa à camada de cola na lâmina com o abdômen voltado para cima. Alinhe 20 a 30 pupas lado a lado na lâmina.
Coloque a lâmina com as pupas e uma placa de Petri para deixar a cola agir por aproximadamente 10 minutos. Antes de iniciar as injeções, teste a aderência das pupas à cola empurrando-as suavemente com a agulha de dissecação. Se a maioria das pupas estiver solta, prepare uma nova lâmina.
Em alternativa, remova todas as pupas soltas e proceda à injeção das que estão devidamente fixadas à lâmina. Carregue um tubo de vidro capilar em um extrator de agulhas e puxe as agulhas seguindo as instruções do fabricante. Carregue a agulha com cinco microlitros da mistura de injeção preparada usando pontas de pipeta microcarregadeiras.
Abra a agulha, deslizando a ponta sobre uma superfície feita de duas lâminas sobrepostas. Como alternativa, abra a ponta da agulha com uma pinça fina para criar uma borda afiada. Coloque a lâmina com as pupas alinhadas sob um microscópio de dissecação, insira a agulha no tubo de injeção do femtojet e aperte a cabeça do punho.
Olhando para a agulha sob o microscópio, ligue o femtojet e defina os parâmetros de pressão de compensação e pressão de injeção girando os botões giratórios. Insira cuidadosamente a agulha entre o segundo e o terceiro segmentos abdominais visíveis com um ângulo vertical de cerca de 30 graus. Injetar com um fluxo contínuo até que todo o abdómen fique verde no caso das pupas brancas ou até que o abdómen aumente de tamanho no caso das pupas pretas.
Pare de injetar quando estiver claro que o abdômen não pode absorver mais líquido ou quando o líquido começar a fluir para fora do corpo. Mova-se cuidadosamente para a próxima pupa e repita essas etapas. Transfira a lâmina com as pupas injetadas para uma placa de Petri.
Cubra o prato com a tampa e coloque-o a 25 graus Celsius até a emergência da vespa. Para a preparação de adultos, separe grupos de 20 fêmeas virgens em um pequeno tubo de ensaio limpo com um pincel fino. Coloque uma lâmina de vidro em cima do gelo e alinhe a fêmea lado a lado na lâmina fria com o abdômen voltado para cima sob um escopo de dissecação.
Carregue uma agulha com a solução de ribonucleoproteína usando uma ponta de microcarga e insira a agulha no pacote de conectores do conjunto do tubo aspirador. Apoie as fêmeas do lado oposto com agulhas de dissecação embotadas, enquanto injeta lentamente no abdômen. Evite tocar no ovipositor.
Isso danificará gravemente essa estrutura reprodutiva crítica. Insira cuidadosamente a agulha entre o segundo e o terceiro segmentos abdominais visíveis com um ângulo vertical de cerca de 30 graus. Injete a solução no abdômen feminino, parando quando não houver mais líquido ou quando for observado vazamento do excesso de solução.
Mova-se cuidadosamente para a próxima fêmea e repita essas etapas. Quando terminar, transfira suavemente uma única fêmea injetada para um novo tubo com um hospedeiro usando um pincel. Deixe-os se recuperar em temperatura ambiente por aproximadamente uma hora, confirme a sobrevivência e devolva os tubos à incubadora de criação.
Após a eclosão adulta das pupas injetadas, coloque vespas individuais em um copo para tampar com algodão e insira um hospedeiro de S. bullata. Para experimentos de nocaute CRISPR/Cas9, permita que as fêmeas parasitem o hospedeiro por um dia e substituam o hospedeiro a cada dia por três dias consecutivos. Posicionar o hospedeiro parasitado, fixado 25 graus Celsius até a emergência da prole G0 macho, aproximadamente 13 a 14 dias.
Sob um microscópio de dissecação, rastreie os machos G0 para os fenótipos mutados. O gene cinábrio é responsável pela pigmentação ocular. Vespas com olhos castanhos são do tipo selvagem e vespas com olhos vermelhos brilhantes ou variações entre olhos vermelhos e castanhos são mutantes.
Este protocolo pode ser usado para microinjeção em pupas ou adultos. As taxas de sobrevivência deste procedimento variam de 15 a 100%A eficiência de alcançar o fenótipo desejado via RNAi ou CRISPR sem a necessidade de injeções laboriosas de ovos é mostrada aqui. Ao injetar pupas ou fêmeas adultas, a agulha deve ser afiada e introduzida de forma que o líquido não vaze imediatamente após a injeção.
Se isso acontecer, remova a agulha, certifique-se de que a ponta esteja fina e afiada, troque-a se necessário ou injete em um local diferente. A análise da função pode ser realizada no gene de interesse visado por este procedimento. Isso responderá a uma pergunta sobre a função do gene e se o gene é necessário para o fenótipo específico estudado.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo apresenta um método para injeções eficientes em pupas e adultos em Nasonia vitripennis, fornecendo uma alternativa prática à microinjeção embrionária tradicional. A técnica permite a análise funcional de genes através de interferência de RNA (RNAi) e edição do genoma CRISPR/Cas9.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Engenharia genética em modelos de insetos não canônicos
- Genética funcional de Nasonia vitripennis
- Aplicações das técnicas de RNAi e CRISPR/Cas9
Contexto
- Desafios na microinjeção embrionária para vespas parasitoides
- A necessidade de métodos acessíveis em estudos genéticos
- Importância do uso de Nasonia como um organismo modelo
Métodos Utilizados
- Técnicas de injeção em pupas e adultos para manipulação genética
- Nasonia vitripennis como o sistema biológico
- Utilização das tecnologias RNAi e CRISPR/Cas9
Principais Resultados
- Implementação bem-sucedida do método de injeção com altas taxas de sobrevivência (15-100%)
- Observação de fenótipos desejados através da edição genética
- Verificação da eficácia da RNAi e CRISPR sem procedimentos complicados
Conclusões
- O método demonstra um avanço significativo no campo da genética de insetos
- Abre novos caminhos para estudos genéticos funcionais em várias espécies de insetos
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Functional genetic validation in non-canonical insect models is constrained by embryonic microinjection challenges, limiting target de-risking in early discovery. This pupal and adult injection method enables site-specific and heritable germline edits without specialized equipment, supporting scalable target validation workflows. It expands mechanistic screening capacity for parasitoid wasps and related species, improving predictive confidence in pathway interrogation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in Nasonia vitripennis to validate therapeutic targets in epigenetics, symbiont interactions, and venom pathways.
- Operational Value: Eliminates need for embryonic microinjection expertise and costly equipment, reducing barriers to target validation in non-model insects.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantifiable phenotypic outputs (e.g., eye color mutations) for RNAi and CRISPR screening assays.
- Operational Value: Standardizes injection procedures across pupal and adult stages, improving reproducibility for compound or guide RNA evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling functional genetics in a haplo-diploid sex determination model with translational relevance to genetic conflict and speciation.
- Operational Value: Facilitates continuity from target hit to preclinical-like validation through heritable germline mutation generation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling target hypothesis testing prior to lead identification, particularly for invertebrate-derived targets or symbiont-mediated mechanisms.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking through direct gene knockout or knockdown in vivo.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized delivery of RNAi or CRISPR reagents for phenotypic screening.
- Analytics: Generates measurable phenotypic readouts (e.g., eye pigmentation shifts) to compare experimental conditions and assess editing efficiency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by establishing heritable mutant lines for multi-generational phenotypic assessment.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable injection platform adaptable across insect species, reducing revalidation costs for cross-functional teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by enabling direct functional assessment of genes in vivo.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through slide-based alignment and consistent injection parameters.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by improving target confidence early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets from non-canonical models through accessible functional validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection and microinjection techniques under dissecting microscopy.
- Depends on capillary needle preparation and injection apparatus (e.g., femtojet) for precise reagent delivery.
- Necessitates standardized host parasitization and environmental controls (25°C, 30% RH, 12:12 light cycle) for developmental staging.
- Involves adaptation considerations for varying insect sizes and cuticle thickness when extending to other species.
- Limited by survival rate variability (15–100%) dependent on injection precision and post-procedure handling.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:04
Nasonia Rearing
2:19
Alignment of White and Black Pupae
3:21
Needle Preparation
3:53
Adult Injection with Aspirator Tube
5:04
Adult Injection with Aspirator Tube
6:32
Post-Injection Care and Mutant Screening
7:27
Results: Survival and Efficiency Rate of RNAi and CRISPR/Cas9 via Pupal and Adult Injections
7:52
Conclusion
