Transplante de Macrófagos Cardíacos de Camundongos Neonatais em Camundongos Adultos
March 20th, 2021
Fornecemos um protocolo para separação e transplante de macrófago cardíaco neonatal em um coração de rato adulto, o que pode ser uma maneira promissora de promover a reparação cardíaca.
Este protocolo demonstra a separação de macrófagos cardíacos médios e o transplante em camundongos adultos, o que pode ser uma maneira permissiva de promover a reparação cardíaca. As implicações desta técnica podem ser estendidas ao campo de regeneração cardíaca. Comece pré-resfriamento da plataforma operacional bronze durante a noite a 20 graus Celsius.
Tire o rato anestesiado da geladeira e coloque-o na plataforma. Ancore o mouse em uma posição supina usando fita adesiva médica. Coloque a plataforma de operação com o mouse sob um estereoscópio, e desinfete o baú do mouse usando uma almofada de preparação encharcada com betadina e 70% de álcool.
Incise a pele com um corte de um centímetro na quarta área intercostal da cavidade torácica, e separe os músculos intercostais usando uma tesoura microcirúrgica até que o coração seja acessado. Pressione alternadamente o peito e o abdômen com a ajuda de dois fórceps até que o coração seja exteriorizado para fora do peito sem qualquer dano mecânico. Coloque as costelas abaixo e acima da pequena incisão como uma fixação natural para imobilizar o coração, localizar o ápice do ventrículo esquerdo e cortar um milímetro de diâmetro de tecido ápice ventricular usando sua tesoura de iridectomia.
Confirme se a câmara ventricular esquerda está exposta e começa a escorrer. Pressione suavemente o coração de volta para a cavidade torácica usando um cotonete de algodão, suturar os músculos, costelas e pele usando oito por zero suturas de prolene e limpe o rato completamente após a operação. Transfira o mouse da plataforma operacional para um manta de aquecimento de 37 graus para aquecer o corpo imediatamente após a operação.
Confirme a antibiose do camundongo observando os sinais de restauração espontânea da respiração, mudança de cor da pele de pálido para rosa e movimento dos membros. Leve o rato operado de volta para sua mãe uma vez que ele se recupere. Misture o rato operado e são materiais de aninhamento da mãe, se necessário.
Colher o coração de um rato CX3-CR1-GFP neonatal eutanizado um dia após a ressecção apical e imergi-lo em um prato de 10 centímetros com PBS. Corte os vasos e o tecido conjuntivo restante longe dos ventrículos. Corte o apêndice auricular e o trato de saída do coração.
Depois que o coração parar de bater corte o coração em pedaços cúbicos de um a dois milímetros cúbicos em tampão salino fosfato usando tesoura microcirúrgica. Transfira-os para um tubo contendo 2,5 mililitros de mistura de enzimas pré-aques e feche firmemente o tubo. Inverta o tubo e coloque-o com a tampa para baixo, em seguida, execute o programa de Dissociação Cardíaca Neonatal.
Retire o tubo do dissociador após o programa ser concluído. Adicione 7,5 mililitros de 1x DMEM com 10% de FBS ao tubo. Filtre e transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
Centrifugar a suspensão da célula a 300 vezes G por cinco minutos. Suspenda a pelota celular em um mililitro da solução de lise celular e incubar por dois minutos à temperatura ambiente. Adicione 5 a 10 mililitros de tampão salino fosfato à suspensão e centrífuga a 300 vezes G por cinco minutos.
Suspenda novamente a pelota celular em um mililitro de DMEM com 10% FBS, depois classifique macrófagos cardíacos neonatais positivos de GFP por fax. Classifique macrófagos em um tubo estéril contendo 500 mililitros de DMEM com 10% de FBS. Conte os macrófagos positivos do GFP e suspenda-os no DMEM com 10% de FBS na concentração de um milhão de macrófagos por 200 mililitros de DMEM para injeção posterior.
Macrófagos cardíacos neonatais foram injetados no coração do camundongo adulto infartado do miocárdio e a eficiência dos cardiomiócitos proliferativos foi confirmada pela coloração imunofluorescente. A análise estatística mostra que a proliferação de cardiomiócitos aumenta após o transplante de macrófago. Imagens de ecocardiograma mostram a função cardíaca em um rato adulto um mês após o infarto do miocárdio.
A função cardíaca é aprimorada após o transplante de macrófago. A massa na coloração mostra que a área infarta em um camundongo adulto um mês após o infarto do miocárdio foi notavelmente reduzida após o transplante de macrófago cardíaco neonatal. O transplante de macrófago cardíaco neonatal pode ser uma estratégia de promoção para promover a regeneração do coração bucal adulto.
Este protocolo ajuda os pesquisadores a buscar o desenvolvimento de aplicações regenerativas e explorar o mecanismo de regeneração cardíaca.
Visão Geral
Este protocolo descreve a separação e o transplante de macrófagos cardíacos neonatais em um coração de camundongo adulto, apresentando uma nova abordagem para melhorar o reparo cardíaco.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia cardíaca
- Medicina regenerativa
- Biologia dos macrófagos
Fundo
- Os macrófagos cardíacos desempenham um papel crucial no reparo cardíaco.
- Macrófagos neonatais podem ter propriedades regenerativas aprimoradas.
- As técnicas de transplante podem potencialmente melhorar a função cardíaca pós-infarto.
- Entender o comportamento dos macrófagos em corações adultos é essencial para estratégias regenerativas.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um protocolo para isolar macrófagos cardíacos neonatais.
- Avaliar os efeitos do transplante de macrófagos no reparo cardíaco.
- Explorar as implicações para terapias de regeneração cardíaca.
Métodos Utilizados
- Preparação da plataforma de operação e anestesia do camundongo.
- Isolamento de macrófagos cardíacos neonatais de camundongos eutanasiados.
- Transplante de macrófagos no coração adulto infartado de camundongos.
- Avaliação da função cardíaca por meio de ecocardiografia e coloração imunofluorescente.
Principais Resultados
- Aumento da proliferação de cardiomiócitos observado após o transplante.
- Melhoria da função cardíaca em camundongos adultos após a injeção de macrófagos.
- Redução da área infartada observada um mês após o transplante.
- A análise estatística apoia a eficácia do método de transplante.
Conclusões
- O transplante de macrófagos cardíacos neonatais mostra-se promissor para a regeneração cardíaca.
- Este protocolo auxilia no desenvolvimento de aplicações regenerativas.
- Mais pesquisas são necessárias para entender completamente os mecanismos envolvidos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Transplantation of neonatal cardiac macrophages into adult infarcted hearts addresses a critical challenge in regenerative medicine by enabling functional recovery and cardiomyocyte proliferation. This approach offers predictive confidence for early-stage cardiac repair strategies and informs portfolio decisions in cell-based therapy development. The method positions macrophage transplantation as a potential inflection point for advancing regenerative cardiac therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of macrophage-mediated regenerative pathways in cardiac tissue.
- Supports biological de-risking by clarifying the functional role of neonatal macrophages in heart repair.
- Provides predictive confidence for selecting cell-based targets in regenerative portfolios.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated macrophage populations for downstream transplantation studies.
- Enables reproducible quantification of cardiomyocyte proliferation and cardiac function post-transplantation.
- Supports assay standardization for evaluating regenerative efficacy in preclinical models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of myocardial infarction for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of macrophage-based therapies through quantitative functional readouts.
- Provides mechanistic de-risking by linking macrophage transplantation to measurable cardiac regeneration outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This transplantation protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for cardiac regenerative therapies, supporting both hypothesis testing and translational validation.
- Discovery Biology: Advances understanding of macrophage-driven regenerative mechanisms in cardiac injury models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for cardiomyocyte proliferation and cardiac function.
- Analytics: Employs immunofluorescent staining and echocardiography for robust statistical comparison of regenerative outcomes.
- Translational Research: Bridges early discovery findings to preclinical validation in disease-relevant myocardial infarction models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for evaluating cell-based regenerative strategies across cardiac models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in macrophage-mediated cardiac repair and target validation.
- Operational Value: Standardizes isolation, transplantation, and quantitative assessment protocols for reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for cell therapy programs targeting cardiac regeneration.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regenerative candidates based on functional and proliferative outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac surgery, cell isolation, and flow cytometry-based cell sorting.
- Demands access to specialized instrumentation for immunofluorescent imaging and echocardiography.
- Necessitates cross-team standardization of transplantation and assessment protocols.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or cardiac injury models.
- Throughput and scalability are limited by manual surgical and cell preparation steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:34
Apical Resection Operation in Neonatal 1-day-old Cx3cr1GFP/+Mouse
2:36
Preparation of the Neonatal Cardiac Macrophage Suspension
4:45
Results: Immunofluorescence, Echocardiogram, Masons Staining, and Statistical Analysis of Neonatal Cardiac Macrophage Transplantation
5:37
Conclusion
