Name: Produção de anticorpos monoclonais contra aminopeptidase N no epitélio da mucosa intestinal suína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprenda a produção de anticorpos monoclonais contra aminopeptidase N em epitélio intestinal suíno usando hibridoma e expressão recombinante em células CHO. Este método avança o desenvolvimento de vacinas e terapêuticas mucosas.

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Este estudo foi apoiado pela Bolsa da Fundação Nacional de Ciência da China (No. 32072820, 31702242), subsídios da Bolsa do Governo de Jiangsu para Estudos no Exterior (JS20190246) e Talentos de Alto Nível da Fundação de Pesquisa Científica da Universidade de Yangzhou, um projeto fundado pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento da Instituição de Ensino Superior de Jiangsu.

Todos os experimentos com animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Yangzhou (SYXK20200041).
1. Preparação do antígeno da proteína APN suína
NOTA: A cepa pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) e as células pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 expressas de APN foram construídas em um estudo anterior11.
<ol><li>Recuperar bactérias de um estoque congelado de glicerol e estriar em placas de Luria-Bertani (LB) contendo 50 μg/mL de canamicina (Km+) para isolamento de colônia única.</li>
	<li>Selecionar uma única colônia da placa recém-estriada, cultivar em 4 mL de meio LB (10 g/L de triptona, 10 g/L de cloreto de sódio (NaCl) e 5 g/L de extrato de levedura, pH 7,2) suplementado com Km+ (50 μg/mL), e deixar crescer durante a noite (12-16 h) com agitação (178 rpm) a 37 °C.</li>
	<li>Diluir as bactérias preparadas a 1:100 em caldo fresco Km+ LB e incubar a 37 °C com agitação durante 2-3 h até que o OD600 atinja 0,4-0,6.</li>
	<li>Adicionar isopropil β-d-1-thiogalactopiranosídeo (IPTG) ao meio até uma concentração final de 0,4 mM e incubar as culturas por mais 10 h a 16 °C.</li>
	<li>Consequentemente, centrifugar e colher as bactérias usando indução IPTG (10.000 × g, 4 °C 15 min).</li>
	<li>Ressuspender o pellet celular usando 5 mL de tampão LEW (Lysis/Equilibration/Wash) (50 mM de fosfato de sódio anidro monobásico (NaH2PO4) e NaCl 300 mM, pH 8,0) contendo 1 mg/mL de lisozima. Agite a suspensão bacteriana por 30 min no gelo e sonicate completamente (15 s pulso e 20 s desligado, 15 min) usando um homogeneizador ultra-sônico.</li>
	<li>Centrifugar o lisado celular bruto a 4 °C e 10.000 × g durante 30 minutos para remover os detritos celulares. Transfira o sobrenadante para uma coluna pré-equilibrada e incube 1-2 min antes da drenagem por gravidade. Repita esta etapa três vezes.</li>
	<li>Lavar a coluna com 20 mL de tampão LEW e drenar por gravidade. Eluir a proteína APN marcada com histidina usando 9 mL de tampão de eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl e 250 mM imidazol, pH 8,0) e coletar em tubos de diálise.</li>
	<li>Diálise da solução proteica durante a noite a 4 °C em tampão carbonato de sódio-bicarbonato de sódio (PBS, NaCl 135 mM, cloreto de potássio 4,7 mM, NaH 2 PO4 mM e fosfato de sódio dibásico dodecahidratado 10 mM, pH7,2).</li>
	<li>Analisar usando um gel de SDS-PAGE a 12,0% e western blotting para avaliar a pureza da proteína APN.<ol><li>Coloque 5 μg de proteína em cada poço do gel e deixe correr a 110 V por 1,5 h. Em seguida, transfira a proteína para uma membrana de PVDF por 50 min a 15 V. Determine a concentração da proteína purificada usando um ensaio de BCA.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Imunização animal
<ol><li>Subcutâneo (s.c) injetar camundongos BALB/c fêmeas, 6-8 semanas de idade, com 50 μg de proteína APN ou PBS (controle negativo) misturado com adjuvantes uma vez a cada 2 semanas. Use o adjuvante de Freund completo que contém as micobactérias mortas pelo calor para a imunização inicial, e o adjuvante de Freund incompleto para as imunizações de reforço. Misturar volumes iguais de proteína APN (ou PBS) e adjuvante de Freund ou adjuvante de Freund incompleto, respectivamente.</li>
	<li>Detectar títulos de anticorpos contra APN no soro desses camundongos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) usando uma placa de microtitulação revestida com 5 μg/mL de proteína APN diluída em PBS 0,05 M (pH 9,6). .</li>
</ol>3. Tecnologia de hibridoma para produção de anticorpos monoclonais contra PNA
<ol><li>Intraperitonealmente (i.p.) injetar 100 μg de proteína APN nos camundongos selecionados para um reforço final do antígeno.</li>
	<li>Três dias depois, eutanasiar os camundongos com pentobarbital sódico (50 mg/kg, v/v, intraperitoneal) e luxação cervical.</li>
	<li>Colete baços e lave com DMEM duas vezes para remover o sangue e as células de gordura. Filtrar a suspensão de células do baço usando uma grade de cobre de 200 malhas para remover detritos de tecido e colher células do baço usando centrifugação (1500 × g, 10 min) para remover a membrana do baço.</li>
	<li>Células SP2/0 de mieloma múltiplo de camundongo em frasco de 25cm2 contendo 5 mL de DMEM suplementado com 6% de soro fetal bovino (SFB) e cultura a 37 °C, atmosfera de 6% de CO2 para manter a viabilidade celular. Após 5-6 dias de cultura, as células atingem 80%-90% de confluência pós-ressuscitação e estão em fase log de crescimento. Sob o microscópio, as células são redondas, brilhantes e claras.</li>
	<li>Um dia antes da hibridização, coletar macrófagos das cavidades peritoneais dos camundongos de acordo com método previamente publicado12,19.</li>
	<li>Macrófagos peritoneais de sementes a uma densidade de 0,1-0,2 × 105/mL em placas de 96 poços, cada poço contendo 100 μL de meio HAT (DMEM suplementado com 10% FBS e 1x HAT Supplement), e incubam a 37 °C, 6 % CO2 atmosfera umidificada durante a noite.</li>
	<li>Para hibridização, aspirar suavemente as células SP2/0 com uma pipeta de 8-10 frascos e suspender em 10 mL de meio DMEM sem soro. Lavar as células com DMEM fresco, centrifugar (1500 × g, 10 min) duas vezes e, em seguida, ressuspender em 10 mL de DMEM.</li>
	<li>Misturar as células quantificadas do baço com as células SP2/0 na proporção de 10:1 e transferir para tubos de 50 ml. Centrifugar (1500 × g, 10 min) e descartar o sobrenadante. Colete os pellets de células no fundo dos tubos e bata com a palma da mão para soltar os pellets antes da hibridização.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de polietilenoglicol 1500 (PEG 1500), pré-aquecido a 37 °C, gota a gota, usando um conta-gotas para a pastilha de célula solta durante o período de tempo de 45 s, girando suavemente o fundo do tubo.</li>
	<li>Adicionar lentamente 1 mL de DMEM pré-aquecido a 37 °C à mistura acima durante o período de 90 s, seguido por mais 30 mL de DMEM fresco. Colocar o tubo de fusão num banho-maria a 37 °C durante 30 minutos.</li>
	<li>Após a incubação no banho quente, colher as células e ressuspender em meio HAT. Em seguida, cultura em placa de 96 poços inoculada com macrófagos peritoneais.</li>
	<li>Cinco dias depois, adicionar 100 μL de meio HAT fresco a cada poço e incubar a placa por mais 5 dias, após o que substituir o meio por meio HT (DMEM suplementado com 10% FBS e 1x HT Supplement).</li>
	<li>Utilizar uma placa de microtitulação revestida com 5 μg/mL de proteína APN diluída em PBS 0,05 M (pH 9,6) para analisar anticorpos monoclonais no sobrenadante do hibridoma usando ensaio ELISA.<ol><li>Quando o meio nos poços da placa de 96 poços fica amarelo (devido ao crescimento celular e liberação de metabólitos, o pH no meio diminui para 6,8 e o vermelho fenólico passa de fúcsia para amarelo) ou aglomerados celulares são observados, adquira 100 μL de sobrenadante dos poços selecionados e adicione aos poços da placa ELISA revestida. Use um leitor de microplacas para medir os valores OD450.</li>
		<li>Usar os anticorpos policlonais contra PNA e soro de camundongos não infectados como controle positivo e negativo, respectivamente, e usar PBS como controle em branco. Neste estudo, a razão OD450 amostra/controle negativo (P/R) ≥ 2,1 foi reconhecida como padrão de seleção positiva.</li>
	</ol></li>
	<li>Após três rodadas consecutivas de seleção positiva, selecione o hibridoma que apresenta resposta sorológica aumentada contra a proteína APN para um ensaio de diluição limitada.<ol><li>Preparar macrófagos peritoneais e sementes em placas de 96 poços, conforme descrito anteriormente.</li>
		<li>Suspender células de hibridoma em meio HT a uma média de 0,5-2 células por poço e cultivar em estufa a 37 °C, 6% CO2 . Repita essa etapa três ou quatro vezes até que a taxa de positividade indicada pelo imunoensaio ELISA atinja 100%.</li>
	</ol></li>
	<li>Sob a pressão de congelamento e descongelamento contínuos, selecione as células positivas do hibridoma capazes de secretar de forma estável anticorpos anti-APN e proliferar normalmente.<ol><li>Administrar uma única injeção i.p. de 0,3 ml de pristano a cada rato (8-10 semanas). Aos 10 dias após receber o pristine, injetar em cada camundongo 2-5 x10 5 células de hibridoma em 0,5 mL de PBS (pH 7,2).</li>
		<li>Coletar cuidadosamente líquido peritoneal da cavidade peritoneal desses camundongos 8 a 10 dias após a injeção.</li>
		<li>Colher os sobrenadantes por centrifugação a 5.000 × g por 15 min e purificar os anticorpos nos sobrenadantes usando precipitação de sulfato de amônio saturado a 33% [(NH 4)2SO4] e proteína A agarose.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Caracterização de mAbs contra proteína APN
<ol><li>Determinar o subtipo de imunoglobulina dos mAbs coletados usando um SBA Clonotyping System-HRP20. Use SDS-PAGE e western blotting para avaliar a pureza e especificidade do mAb.</li>
	<li>Analise a especificidade do epítopo mAb contra a proteína APN usando ELISA21. O valor de aditividade, AV, é a razão entre ODmAbs (a+b) e (OD mAbs-a+ODmAbs-b), que é usado para avaliar se os mAbs reconhecem o mesmo sítio antigênico; ODmAbs-a e ODmAbs-b representam os valores de OD450 de diferentes anticorpos monoclonais contra APN isoladamente, e OD mAbs(a+b) representam os valores de OD450 de uma mistura 1:1 de dois mAbs contra APN.<ol><li>Avalie cada amostra pelo menos quatro repetições e repita todo o experimento pelo menos três vezes.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Expressão de rAbs contra APN
<ol><li>Extrair o RNA total das células e baços do hibridoma acima mencionados de camundongos imunizados com APN (por exemplo, TRIzol)22. Sintetize DNA complementar (cDNA) usando um kit de síntese de cDNA de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Amplificar regiões variáveis de mAbs usando nested PCR e determinar sequências de cadeia pesada (VH) e cadeia leve (VL) usando sequenciamento. Analisar os genes que codificam VH e VL usando a ferramenta de análise do genoma de camundongos IMGT (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).</li>
	<li>Combinar os genes VH e VL com sequências líderes e subcloná-los sequencialmente nos vetores pET28a (+) e pIRES2-ZsGreen1, respectivamente, usando tecnologia de clonagem contínua para permitir a inserção de fragmentos de DNA sem cicatrizes. Os primers específicos estão listados na Tabela 1.</li>
	<li>Cultivar as bactérias transformadas em pET28a (+)-rAbs-APN-BL21 na presença de IPTG 0,4 mM em agitadores orbitais a 37 °C por 10 h. Em seguida, induzir, purificar e avaliar a expressão da proteína rAbs usando purificação proteica de rotina.</li>
	<li>Seme 100 μL 0,5 x 105 células CHO por poço em uma placa de 96 poços e incube a 37 °C em uma atmosfera de 6% de CO2 por 18-24 h. Quando as células atingirem 80-90% de confluência, diluir o plasmídeo pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN com Opti-MEM até uma concentração final de 0,1 μg/μL e incubar 5 min à temperatura ambiente antes de usar para transfecção.</li>
	<li>Misturar suavemente 50 μL do plasmídeo pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN diluído com 1 μL de Lipofectamina 2000 e 49 μL de Opti-MEM e incubar a mistura durante mais 20 minutos à temperatura ambiente. Adicionar 100 μL de mistura a cada poço de uma placa de 96 poços contendo células CHO e incubar a 37 °C em atmosfera de CO2 a 6% durante 4-6 horas.</li>
	<li>Em 4-6 h pós-transfecção, substituir o meio por meio DMEM-F12 suplementado com 10% de SFB e incubar a placa por mais 48 h. Em seguida, adicionar 400 μg/mL de G418 a cada poço para selecionar as células transfectadas de forma estável.</li>
	<li>Após 10 dias de seleção usando meio DMEM-F12 suplementado com FBS 10% e G418 400 μg/mL, classificar as células (3,0 × 107 células/mL) por triagem celular ativada por fluorescência. Aproximadamente 10-15% da população celular foi positiva.</li>
	<li>Diluir serialmente as células positivas colhidas, semear em média 0,5-2 células por poço em uma placa de 96 poços e cultura em uma incubadora de 37 °C e 6% de CO2 . Manter as células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO transfectadas de forma estável usando seleção com G418 (200 μg/mL).</li>
	<li>A concentração de FBS no meio de cultura celular descrito acima diminui gradualmente de 10% para 0% durante a fase de crescimento logarítmico ao longo do período de tempo de 3 semanas. Em seguida, adaptar as células CHO aderentes ao crescimento em suspensão em meio sem soro.</li>
	<li>Cultivar as células pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO semeadas na fase logarítmica de crescimento em meio livre de soro a uma densidade de 0,8-1,0 × 105 células/mL em frascos de agitação a 80-110 rpm e 37°C, 6% CO2.</li>
	<li>Coletar a suspensão celular a cada 12 h para determinar mudanças na viabilidade e vitalidade celular usando um kit de contagem de células (por exemplo, CCK-8) de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>A expressão de anticorpos atinge níveis máximos quando a viabilidade celular diminui para 80% e a densidade celular atinge 1,0-2,0 × 106 células/mL. Colher sobrenadantes celulares usando centrifugação, filtrar usando um filtro de membrana de politetrafluoretileno de 0,22 μm e purificar usando a proteína A agarose.</li>
	<li>Confirmar a produção de anticorpos específicos para PNA usando ensaios de imunofluorescência indireta (RIFI).</li>
	<li>Determine os títulos de anticorpos e as afinidades de ligação usando o ensaio ELISA, conforme descrito anteriormente. 23 Calcular a constante de dissociação de equilíbrio (valor de KD ) dos anticorpos com uma equação logística de quatro parâmetros usando software.</li>
</ol>

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<li>Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+results+obtained+by+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+the+determination+of+antibody+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).</li>
<li>Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+oral+subunit+vaccine+design%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Advances in oral subunit vaccine design.</a> Vaccines. 9, 1(2020).</li>
<li>Baert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-glucan+microparticles+targeted+to+epithelial+APN+as+oral+antigen+delivery+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system.</a> Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).</li>
<li>Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+antibodies+possessing+novel+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recombinant antibodies possessing novel effector functions.</a> Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).</li>
</ol>

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse. Todos os autores aprovaram e deram seu consentimento explícito para a publicação do manuscrito.

A indução da imunidade da mucosa é uma das abordagens mais eficazes no combate a patógenos e na prevenção e tratamento de várias doenças. A PNA, uma proteína ligada à membrana altamente expressa na mucosa intestinal, está envolvida na indução da resposta imune adaptativa e na endocitose viral e bacteriana mediada por receptores 1,5,8. A PNA é usada como particulada antigênica em muitos formatos de carregamento de antígenos e ent...

A aminopeptidase N (APN), enzima pertencente à família das metaloproteinases M1, atua como marcador, receptor e molécula sinalizadora tumoral por vias dependentes e independentes de enzimas 1,2. Além de clivar os resíduos de aminoácidos N-terminais de vários peptídeos bioativos para a regulação de sua atividade biológica, a PNA desempenha um papel importante na patogênese de várias doenças inflamatórias. A PNA participa do processamento e apresentação de antígenos por peptídeos aparados que se ligam firmemente a moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade 2,3. A PNA também exerce efeitos anti-inflamatórios ao se ligar a receptores acoplados à proteína G, participando de transdução de múltiplos sinais, modulando a secreção de citocinas e contribuindo para a fagocitose mediada pelo receptor gama Fc na resposta imune 4,5,6,7.
Como uma exopeptidase ligada à membrana amplamente distribuída, a PNA é abundante na mucosa do intestino delgado suíno e está intimamente associada à endocitose mediada por receptores 1,5,8. A PNA reconhece e liga a proteína spike do vírus da gastroenterite transmissível para entrada celular e interage diretamente com a subunidade FaeG das fímbrias F4 de Escherichia coli enterotoxigênicas para afetar a aderência bacteriana com as células hospedeiras 9,10,11. Assim, a PNA é um potencial alvo terapêutico no tratamento de doenças infecciosas virais e bacterianas.
Desde o desenvolvimento da tecnologia de hibridoma e outras estratégias para a produção de anticorpos monoclonais (mAbs) em 1975, os mAbs têm sido amplamente utilizados em imunoterapia, liberação de fármacos e diagnóstico12,13,14. Atualmente, os mAbs são utilizados com sucesso no tratamento de doenças, como câncer, doença inflamatória intestinal e esclerosemúltipla12,15. Devido à sua forte afinidade e especificidade, os mAbs podem ser alvos ideais no desenvolvimento de conjugados anticorpo-droga (ADC) ou novas vacinas16,17. A proteína APN é crítica para a entrega seletiva de antígenos a células específicas, podendo provocar uma resposta imune específica e forte da mucosa contra patógenos sem qualquer interferência, incluindo baixa expressão proteica, inatividade enzimática ou alterações estruturais 5,8,18. Portanto, produtos terapêuticos à base de mAbs específicos para APN mostram-se promissores contra infecções bacterianas e virais. Neste estudo, descrevemos a produção de mAbs específicos para APN usando tecnologia de hibridoma e a expressão de anticorpos recombinantes anti-APN (rAbs) usando vetores procarióticos e eucarióticos. O resultado indica que a proteína APN foi reconhecida tanto por rAbs expressos em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO quanto por mAbs derivados de hibridomas.

<table><tbody><tr><td>Freund completo' s adjuvante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881</td><td>Imunização animal</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnologia</td><td>C1002</td><td>Contracoloração nuclear</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Anti-camundongo IgG de cabra conjugada Dylight 549 Anticorpo secundário</td><td>Abbkine</td><td>A23310</td><td>Análise indireta de imunofluorescência</td></tr><tr><td>Kit de Contagem de Células Aprimorada-8</td><td>Beyotime&nbsp; Medição de Biotecnologia</td><td>C0042</td><td> de&nbsp; célula&nbsp; viabilidade e vitalidade</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10091</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Geneticina Antibiótico Seletivo</td><td>Gibco</td><td>11811098</td><td>Antibiótico seletivo</td></tr><tr><td>Software GraphPad Prism 8.0</td><td>GraphPad</td><td>8.0</td><td>Análise de dados científicos e gráficos</td></tr><tr><td>HAT Suplemento (50X)</td><td>Gibco</td><td>21060017</td><td>Seleção de células</td></tr><tr><td>HT Suplemento (100X)</td><td>Gibco</td><td>11067030</td><td>Seleção de células</td></tr><tr><td>Incompleta Freund' s adjuvante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5506</td><td>Imunização animal</td></tr><tr><td>isopropil &beta;-d-1-tiogalactopiranosídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td>Expressão proteica</td></tr><tr><td>canamicina</td><td>Beyotime&nbsp; Antibiótico</td><td>bactericida</td>Biotechnology <td>ST102</td></tr><tr><td>Microscópio confocal Leica TCS SP8 STED</td><td>Leica Microsystems</td><td>&nbsp; SP8 STED</td><td>Imagem de fluorescência</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 Reagente</td><td>Thermofisher</td><td>11668019</td><td>Transfecção</td></tr><tr><td>LSRFortessa classificação de células ativadas por fluorescência</td><td>BD</td><td>FACS LSRFortessa</td><td>Citometria de fluxo Leitor</td></tr> de <tr><td>microplacas</td><td>BioTek</td><td>BOX 998</td><td>Análise ELISA</td></tr><tr><td>Micro espectrofotômetro</td><td>Thermo Fisher</td><td>Nano Drop one</td><td>Ácido nucleico detecção de concentração</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Reagente Químico</td><td>10019308</td><td>Caldo de cultura</td></tr> <tr><td>(NH4)2SO4</td><td>Sinopharm Reagente Químico</td><td>10002917</td><td>Caldo de cultura</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985088</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 1500</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10783641001</td><td>Fusão celular</td></tr><tr><td>Kit de Síntese de cDNA PrimeScript 1ª fita</td><td>Takara Bio</td><td>RR047</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>proteína A agarose</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnologia</td><td>P2006</td><td>Purificação de proteína de anticorpo</td></tr><tr><td>Protino Ni+-TED 2000 Colunas Embaladas</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>745120.5</td><td>Sistema</td></tr> de <tr><td>Clonotipagem de Proteínas SBA-HRP</td><td>Southern Biotech</td><td>May-00</td><td>Isotipagem de anticorpos monoclonais de camundongo</td></tr><tr><td>Kit de Clonagem Sem Costura</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnologia</td><td>D7010S</td><td>Construção de plasmídeos Frascos agitados</td></tr><tr><td></td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnologia</td><td>E3285</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Carbonato de sódio-tampão de bicarbonato de sódio</td><td>Beyotime&nbsp; Biotecnologia</td><td>C0221A</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td><td>Bio-rad</td><td>&nbsp; 170-3940</td> Western <td>blot</td></tr><tr><td>Triptona Oxóide</td><td></td><td>LP0042</td><td>Caldo de cultura</td></tr><tr><td>Homogeneizador ultrassônico</td><td>Ningbo Xinzhi Biotecnologia</td><td>JY92-IIN</td><td>Homogeneização de amostra</td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Oxóide</td><td>LP0021</td><td>Caldo</td></tr><tr><td>de cultura Microplaca de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>Cultura de células</td></tr></tbody></table>

produção de anticorpos monoclonais contra aminopeptidase n no epitélio da mucosa intestinal suína

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

A aminopeptidase N suína (PNA), uma metalopeptidase ligada à membrana abundantemente presente na mucosa do intestino delgado, pode iniciar uma resposta imune mucosa sem qualquer interferência, como baixa expressão proteica, inatividade enzimática ou alterações estruturais. Isso torna a APN uma candidata atraente no desenvolvimento de vacinas que visam seletivamente o epitélio da mucosa. Estudos anteriores mostraram que a PNA é uma proteína receptora tanto para Escherichia coli (E. coli) F4 enterotoxigênica quanto para o vírus da gastroenterite transmissível. Assim, a APN mostra-se promissora no desenvolvimento de conjugados anticorpo-droga ou novas vacinas baseadas em anticorpos específicos da APN. Neste estudo, comparamos a produção de anticorpos monoclonais específicos para APN (mAbs) usando a tecnologia tradicional de hibridoma e o método de expressão de anticorpos recombinantes. Nós também estabelecemos uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO) transfectada de forma estável usando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN e uma cepa BL21(DE3) de expressão de E. coli abrigando o vetor pET28a (+)-rAbs-APN. Os resultados mostram que anticorpos expressos em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e mAbs produzidos usando hibridomas podem reconhecer e se ligar à proteína APN. Isso fornece a base para uma maior elucidação da função do receptor de APN para o desenvolvimento de terapêuticas direcionadas a diferentes epítopos específicos de APN.

Neste estudo, a proteína solúvel purificada de APN (2,12 mg/mL) foi usada para imunização em camundongos. Camundongos imunizados com a proteína APN quatro vezes em intervalos de 14 dias exibiram um título mais alto de anticorpos contra APN em seus soros. Embora 14 hibridomas tenham sido obtidos usando os experimentos de fusão, apenas 9 hibridomas sobreviveram aos três ciclos contínuos de congelamento-descongelamento, resultando em 9 clones estáveis que secretaram anticorpos contra a PNA. Todas essas células são redondas,...

A proteína de anticorpos recombinantes expressa em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e anticorpos monoclonais produzidos usando a tecnologia tradicional de hibridoma pode reconhecer e ligar-se à proteína N aminopeptidase suína (APN).

Produção de anticorpos monoclonais contra aminopeptidase N no epitélio da mucosa intestinal suína

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Os anticorpos monoclonais derivados são usados principalmente em reagentes imunes terapêuticos diagnósticos, destacando a necessidade de produzir anticorpos estáveis e confiáveis em produção limitada preparados. Os métodos aqui descritos provaram que a produção de anticorpos recombinantes pode aumentar a eficiência da produção de anticorpos monoclonais e minimizar os custos associados à mão de obra e ao tempo. Os métodos são usados para desenvolver conjugados de drogas à base de aminoácidos e anticorpos à base de anticorpos e outros produtos terapêuticos, o que ajuda a esclarecer o papel da PNA na prevenção e tratamento de infecções bacterianas e virais.Quem demonstrará o procedimento será Yan Li, aluno de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, injete intraperitonealmente 100 microgramas de proteína APN nos camundongos fêmeas adultas selecionados para um reforço final de antígeno. Após três dias de injeção, colete os baços de camundongos e lave com DMEM duas vezes para remover o sangue e as células de gordura.Filtrar a suspensão de células do baço usando uma grade de cobre de 200 malhas para remover restos de tecido e colher células do baço usando centrifugação para remover a membrana do baço. Semeando as células do mieloma SP20 de camundongos em um frasco de 25 centímetros quadrados contendo cinco mililitros de DMEM suplementado com 6% de soro fetal bovino e cultivar as células a 37 graus Celsius e 6% de atmosfera de dióxido de carbono para manter a viabilidade celular. Após cinco a seis dias de cultura, as células devem atingir 80 a 90% de confluência após a ressuscitação e aparecer redondas, brilhantes e claras ao microscópio.Um dia antes da hibridização, coletar macrófagos das cavidades peritoneais dos camundongos. Sementes de macrófagos peritoneais a uma densidade de 0,1 a 0,2 vezes 10 a quinto por mililitro em placas de 96 poços, cada uma contendo 100 microlitros de meio HAT e incubá-los durante a noite. Para hibridização, aspirar suavemente as células SP20 com uma pipeta de 8 a 10 frascos e suspendê-las em 10 mililitros de meio DMEM sem soro.Lave as células com DMEM fresco e centrifugue-as duas vezes, depois ressuspenda-as em 10 mililitros de DMEM. Misture as células quantificadas do baço com as células SB20 na proporção de 10:1 e transfira-as para tubos de 50 mililitros. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e colete os pellets no fundo dos tubos.Bata no tubo para soltar os pellets antes da hibridização. Usando um conta-gotas, adicione um mililitro de polietilenoglicol 1500 pré-aquecido a 37 graus Celsius gota a gota ao pellet de célula solto durante 45 segundos enquanto gira suavemente o fundo do tubo. Em seguida, adicione lentamente um mililitro de DMEM pré-aquecido a 37 graus Celsius à mistura por 90 segundos, seguido por outros 30 mililitros de DMEM fresco e coloque o tubo de fusão em banho-maria de 37 graus Celsius por 30 minutos.Após a incubação, colher as células. Ressuspender o meio HAT e cultura em placa de 96 poços inoculada com macrófagos peritoneais. Após cinco dias, adicione 100 microlitros de meio HAT fresco a cada poço.E novamente após cinco dias de incubação, substitua o meio por meio HAT. Utilizar uma placa de microtitulação revestida com cinco microgramas por mililitro de proteína APN diluída em PBS 0,05 molar para analisar anticorpos monoclonais no sobrenadante de hibridomas usando ensaio de ELISA. Cultivar o pET28a mais anticorpos recombinantes aminopeptidase NBL21 bactérias transformadas na presença de 0,4 milimolar beta-d-1-thiogalactopyranoside em um agitador orbital a 37 graus Celsius por 10 horas.Semear 100 microlitros 0,5 vezes 10 até a quinta célula do ovário de hamster chinês por poço em uma placa de 96 poços para incubação a 37 graus Celsius e uma atmosfera de dióxido de carbono de 6% por 18 a 24 horas. Quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, diluir os anticorpos recombinantes pIRES2-zs Green one aminopeptidase e plasmídeo com Opti-MEM para uma concentração final de 0,1 microgramas por microlitro. Após cinco minutos, misturar os 50 microlitros de anticorpos recombinantes anti-aminopeptidases e plasmídeos pIRES2-zs Green diluídos com um microlitro de Lipofectamina 2000 e 49 microlitros de Opti-MEM.Após 20 minutos de incubação, adicione 100 microlitros da mistura a cada poço de uma placa de 96 poços contendo células CHO. De quatro a seis horas após a transfecção, substituir o meio por DMEM F12 suplementado com SFB a 10%. Após 48 horas de incubação, adicione 400 microgramas por microlitro G418 a cada poço para selecionar as células transfectadas de forma estável.Após 10 dias de seleção usando meio DMEM F12 suplementado com 10% FBS e 400 microgramas por microlitro G418, classificar as células com classificação celular ativada por fluorescência. Diluir serialmente as células positivas colhidas. Semeá-los a uma média de 0,5 a 2 células por poço em uma placa de 96 poços e cultivar em 37 graus Celsius, incubadora de dióxido de carbono a 6%.Na análise microscópica representativa, todas as células do hibridoma apareceram redondas, brilhantes e claras. Os anticorpos monoclonais purificados possuindo cadeias pesadas de 50 kilodalton e leves de 25 quilodalton foram confirmados por SDS-PAGE e foram encontrados na ascite purificada. Os títulos desses anticorpos monoclonais anti-APN em sobrenadantes de cultura e ascite são mostrados aqui.A isotipagem de anticorpos monoclonais em camundongos revelou que anticorpos derivados dos clones 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 e 6C56 possuíam subclasses de imunoglobulina G2B, enquanto APN 2A20 era um anticorpo tipo kappa da imunoglobulina G2A e o anticorpo monoclonal APN 3FD9, 3F10 e 10F3 pertenciam às cadeias leves kappa processadas do tipo M e da imunoglobulina M. A maioria desses anticorpos monoclonais mostrou valores AV de mais de 50%, indicando que eles visaram diferentes epítopos na PNA, enquanto o anticorpo APN 5C51 reconheceu epítopos antigênicos como aqueles reconhecidos pelos anticorpos monoclonais APN 3C48, 5B31 e 6C56. O gene amplificado APN 5B36 VHVL foi ligado a um vetor pET28a positivo ou pIRES2-zs Green one para construir os plasmídeos de expressão recombinante pET28a positivo para RABS APN e pIRES2-zs Green one RABS APN, respectivamente.Os anticorpos expressos tanto pelo pET28a mais anticorpos recombinantes aminopeptidase NBL21 quanto pelos anticorpos recombinantes pIRES2-zs Green one aminopeptidase NCHO foram purificados e analisados por ELISA e RIFI. No entanto, apenas o anticorpo expresso no sobrenadante de pIRES2-zs Green um anticorpos recombinantes aminopeptidase células NCHO reconhecem a proteína APN. A ligação dos anticorpos monoclonais APN 5B36 às proteínas APN atingiu um equilíbrio mais precoce do que os anticorpos recombinantes.A purificação dos anticorpos monoclonais no sobrenadante usando a proteína A agarose é melhor do que usando precipitação de sulfato de amônia saturada.

production-monoclonal-antibodies-targeting-aminopeptidase-n-porcine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um ensaio para produzir anticorpos monoclonais contra a aminopeptidase suína N (APN), uma metalopeptidase ligada à membrana, usando uma tecnologia tradicional de hibridoma. Ao imunizar um camundongo com APN, as células do baço são colhidas e fundidas com células de mieloma imortais para produzir hibridomas. Os hibridomas são então selecionados e proliferados usando o meio HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina) para produzir anticorpos monoclonais específicos para...

Uma tecnologia de hibridoma para produção de anticorpos monoclonais contra uma metalopeptidase

Este vídeo demonstra um procedimento para a produção de anticorpos recombinantes contra a metalopeptidase. Plasmídeos recombinantes que transportam genes para o anticorpo, proteína fluorescente verde e resistência a antibióticos são transfectados em células epiteliais com lipofectamina. As células transfectadas são selecionadas e cultivadas para gerar anticorpos recombinantes.

Um método para produzir anticorpos recombinantes contra metalopeptidase

Aqui, direcionamos seletivamente anticorpos contra um membro específico de uma família de proteínas altamente conservadas, imunizando animais com suas regiões mais divergentes, seguido pela remoção de anticorpos de reação cruzada por pré-adsorção.

Produção de Nurr-1 policlonal específico Anticorpos Livre de reactividade cruzada contra o seu próximo homólogos, NOR1 e Nur77

Um protocolo otimizado é apresentado para a geração de anticorpos monoclonais baseados na tecnologia de hibridoma. Os camundongos foram imunizados com um imunoconjugado. As células do baço foram fundidas por PEG e um impulso elétrico com células de mieloma imortal. As células de hibridoma produtoras de anticorpos foram selecionadas por HAT e triagem ELISA antígeno-específica.

Geração de anticorpos monoclonais murinos pelo hibridoma Tecnologia

Aqui, os autores apresentam um protocolo simples e eficiente para definir um epítopo antigênico linear usando um anticorpo monoclonal purificado e varredura peptídica por meio de hibridização dot-blot. O epítopo identificado pode então ser usado em aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Nós descrevemos um método para a produção de anticorpos humanos específicos para um antígeno de interesse, a partir de raras células B que circulam no sangue humano. Geração destes anticorpos naturais é rápida e eficiente, e os anticorpos obtidos podem discriminar entre antígenos altamente relacionados.

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação e avaliação de anticorpos monoclonais contra produtos naturais para uso em diversos imunoensaios. Esse procedimento inclui imunização, fusão celular, indirecto ELISA competitivo para clone positivo triagem e preparação de hibridoma monoclonal. As especificações para a caracterização de anticorpo usando análises de ELISA e MALDI-TOF-MS também são fornecidas.

Geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais

Um método para a produção de anticorpos de domínio único de alpacas, incluindo imunização, coleta de sangue, célula B isolamento e seleção é descrito.

Imunização de alpaca (Lama pacos) com antígenos da proteína e a produção de anticorpos de domínio único antígeno-específicas

Neste trabalho, descrevemos um protocolo de cultivo de organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais criopreservadas. Descrevemos também um método para estabelecer monocamadas celulares derivadas de organoides 3D, permitindo o acesso ao lado apical de células epiteliais.

Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares

Um protocolo é apresentado para o enriquecimento de proteínas da célula hospedeira (HCPs) a partir de produtos farmacêuticos (PD) e detecção de peptídeos usando esferas de enriquecimento de proteoma. O método é demonstrado usando uma substância medicamentosa (MD) de anticorpos monoclonais (mAb) fabricada internamente, que é um material de referência bem caracterizado para avaliar e comparar diferentes métodos em termos de desempenho.

Análise de Proteína de Células Hospedeiras usando Contas de Enriquecimento Acopladas a Digestão Limitada

Aprenda a produção de anticorpos monoclonais contra aminopeptidase N em epitélio intestinal suíno usando hibridoma e expressão recombinante em células CHO. Este método avança o desenvolvimento de vacinas e terapêuticas mucosas.

Produção de anticorpos monoclonais contra aminopeptidase N no epitélio da mucosa intestinal suína

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