Co-cultura de neurônios glutamatergicos e células glioma pediátricas de alto grau em dispositivos microfluidos para avaliar interações elétricas

As interações entre as células malignas do glioma e seus neurônios circundantes estão ganhando interesse. Aqui, mostramos o desenvolvimento de um modelo in vitro co-culminando neurônios glutamatericos derivados e células tumorais. Os dispositivos microfluidos usados para co-culturas acoplado a matrizes multieletrísicas permitem o estudo de diferentes tipos de células e realizam registros de atividade elétrica em diferentes pontos de tempo das culturas.

Este método é particularmente útil para estudos funcionais e mecanicistas e para a análise dos efeitos de agentes farmacológicos que bloqueiam a migração celular pediátrica de alto grau e a interação com os neurônios. Para começar a culminar os neurônios glutamatericos cortical derivados do IPS humano comercializados, esvazie os reservatórios de entrada e saída do dispositivo microfluido por aspiração de pipeta, permitindo que apenas os canais do dispositivo sejam preenchidos com meio. Semear as células IPS humanas adicionando 10 microlitrais de 6,5 milhões de células IPS humanas por suspensão mililitro no meio e deixar o dispositivo ficar sob o capô por 15 minutos para permitir que as células se conectem.

Após 15 minutos, encha tanto os reservatórios de entrada quanto os reservatórios de saída com 50 microliters do quarto dia de cultura média, em seguida, transfira o dispositivo para a incubadora para manter as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 23 dias. Substitua o meio a cada três ou quatro dias, conforme descrito no texto. Para contar as células e avaliar a viabilidade usando um microscópio de contraste de fase padrão, tire fotos microscópicas no 4º dia, 21º dia e 23º dia.

Cultura tanto as linhas celulares UW479 quanto BT35 em DMEM e F-12 GlutaMAX suplementadas com soro bovino 10% fetal em um frasco de cultura celular. Manter a cultura celular sob um ambiente controlado a 37 graus Celsius em condições normóxias durante todo o experimento. Observe cada linha celular para atingir 80% de confluência.

No dia 21 pós-cultura de neurônios glutamatericos, comece a co-cultura experimentando células UW479 e BT35. Semente as células UW479 e BT35 experimentadas em cima dos neurônios glutamatericos adeptos maduros em cada dispositivo microfluido dedicado. Mantenha as co-culturas por dois dias sob um ambiente controlado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com neurônio glutamatergic D11 e meio em diante.

Conte células de glioma pediátricas de alto grau usando as imagens microscópicas analisadas com o software de análise de imagens para avaliar sua viabilidade e calcular a porcentagem de células. Coloque o MFD no dispositivo de gravação e use um software comercialmente disponível para realizar o registro eletrofisiológico de neurônios glutamatericos no 21º dia. Antes de semear células de glioma pediátricas de alto grau, realize um segundo registro eletrofisiológico dos neurônios glutamatergicos diferenciados cultivados como controle paralelo à co-cultura.

Realize outra gravação eletrofisiológica no dia 23 após dois dias da co-cultura. Os neurônios glutaméricos cortical derivados do IPS humano foram caracterizados e avaliados usando nestin, SOX2, receptores de glutamato metabotrópico II e imunostaining VGLUT1. Nestin é uma proteína de filamento intermediário e foi expressa em células CNS indiferenciadas.

SOX2 também foi expresso em células indiferenciadas do epitélio neural em CNS. A porcentagem de células nestin e SOX2-positivas diminuiu do quarto dia para o 21º dia, confirmando o estado diferenciado dos neurônios glutamatericos. As imagens microscópicas revelaram uma distribuição progressiva de neurônios glutamatericos através de dispositivos microfluidos.

Quando BT35 e UW479 foram adicionados à cultura, observou-se que as células flutuantes estavam presentes após a semeadura de células glioma no 21º dia, que progressivamente desapareceu até o 23º dia e se tornou aderente no dispositivo. As porcentagens de células viáveis para BT35 e UW479 foram comparáveis e implicaram que as linhas celulares derivadas do paciente poderiam ser usadas adequadamente. A detecção de picos e o enredo raster no 23º dia de cultura mostraram aumento da atividade elétrica depois de adicionar células de glioma pediátricas de alto grau.

Para monitorar a sincronicidade da atividade da rede neural, foi registrada a taxa de disparo instantânea em neurônios BT35 ou glutamatergic. A diferença na atividade elétrica entre os neurônios glutamatergicos individualmente cultivados e co-cultivados foi significativa no 23º dia. O desenvolvimento metodológico adicional pode incluir a avaliação funcional da rede com análise de estouro e correlações interversais temporais especiais da rede.

Agora, os pesquisadores têm uma ferramenta promissora para explorar interações e alvos farmacológicos de linhas de tumor glioma pediátrica de alto grau e neurônios altos do PSC. Várias linhas tumorais e vários tipos de neurônios podem ser usados.