Modelos Animais Ex Vivo e In Vivo para Lesões Mecânicas e Químicas do Epitélio da Córnea

Modelos animais ex vivo e in vivo foram montados para o estudo de lesões corneanas mecânicas e químicas. A técnica fornece uma plataforma de fácil construção para os pesquisadores estudarem lesões mecânicas e químicas da córnea. Para criar uma ferida epitelial corneana murina, marque a córnea central do camundongo anestesiado usando um punch de biópsia de pele para confirmar uma área bem circunscrita e bem mensurável da ferida.

Recue suavemente o punção sobre a córnea central para deixar uma marca circular Desbride o epitélio corneano até a camada de Bowman utilizando um removedor de anel de ferrugem corneano portátil com uma rebarba de 0,5 milímetro garantindo não danificar a camada de Bowman. Remova os tecidos soltos residuais na margem da ferida com pinça corneana. Confirme a área de desbridamento com coloração fluorescente colocando uma gota de soro fisiológico em um papel fluoresceína para dissolver a fluoresceína e, em seguida, colocando a gota contendo fluoresceína no defeito epitelial murino para visualizá-la sob luz azul de cobalto.

Prosseguir com a cultura ex vivo do modelo de ferida de abrasão corneana murina pressionando suavemente as bordas orbitais superior e inferior de camundongos eutanasiados para empurrar o globo ocular para fora. Introduzir a ponta da tesoura corneana fechada no espaço retrobulbar ao longo da parede orbitária inferior, garantindo que não penetre no globo ocular. Mantenha o globo ocular firme com pinça corneana de 0,3 milímetro e, em seguida, corte o nervo óptico e o tecido mole periorbital com tesoura corneana para isolar o globo ocular.

Para a cultura ex vivo de globos oculares murinos, prepare uma placa de 48 poços com cera derretida dentro do poço e aguarde a solidificação, em seguida, com a ponta da pinça da conjuntiva, crie um orifício redondo na superfície da cera solidificada para acomodar os globos oculares. Coloque os globos oculares colhidos diretamente na placa de 48 poços com fundos cobertos de cera e paredes laterais para estabelecer a estabilização. Cultura dos globos oculares com DMEM contendo 1% de soro fetal bovino com ou sem antibióticos, dependendo do objetivo do estudo.

Imergir a superfície ocular com o meio de cultura sem fazer com que o globo ocular flutue e documentar o curso da cicatrização de feridas pela coloração de fluoresceína e coletar fotografias com uma câmera digital sob luz azul de cobalto. Para induzir uma lesão por queimadura alcalina, coloque um papel de filtro circular com um diâmetro de 8 milímetros em uma placa de Petri. Usando um conta-gotas, adicione 0,5 hidróxido de sódio normal na placa de Petri para molhar os papéis de filtro e drenar o excesso de solução do papel de filtro antes de colocá-los na córnea de coelho anestesiada.

Depois de abrir as pálpebras com um espéculo palpebral, certifique-se de que a membrana nictitante do coelho não está interferindo com a inserção de papel de filtro e coloque o papel de filtro embebido em álcali na córnea central por 30 segundos. Retire o papel de filtro e lave a superfície ocular com 10 mililitros de soro fisiológico normal para lavar o material alcalino. Para completar o defeito corneano, desbridar o epitélio corneano dentro da área opacificada até a membrana de Bowman usando um removedor de anel de ferrugem corneana.

Confirmar a área de desbridamento com coloração de fluoresceína sob a luz azul de cobalto e remover o epitélio corneano residual usando pinças corneanas. Para garantir a condição da ferida com tarsorrafia, confirme se a membrana nictitante cobre suavemente a superfície ocular e o defeito epitelial da córnea no lado nasal. Realizar uma tarsorrafia temporária com ou sem agentes tópicos usando uma sutura 6-0 para proteger a superfície ocular e evitar que o coelho a coça, certifique-se de que a sutura para tarsorrafia esteja a 3 a 4 milímetros das margens superior e inferior da pálpebra com quatro a cinco laços e nós mais longos para evitar que o coelho rompa as suturas.

No modelo de cicatrização ex vivo do epitélio corneano de camundongos, a área corneana central levemente deprimida com coloração fluoresceína positiva foi observada nos dois milímetros centrais após o desbridamento in vivo do epitélio corneano de camundongos. A cultura ex vivo dos globos oculares murinos fixados em uma placa de cultura de 48 poços revestida com cera foi examinada e documentada diariamente dentro de uma placa de cultura de 48 poços sob um microscópio estéreo. Um dia após a debridação do epitélio corneano murino, um defeito epitelial circular corado com fluoresceína de 2 milímetros de diâmetro foi revelado em fotografias digitais obtidas sob luz azul de cobalto.

Após a criação de uma lesão alcalina no epitélio corneano de coelhos, a coloração positiva com fluoresceína foi observada com ou sem luz azul de cobalto sobre a córnea central com uma margem circular clara e completa. A reepitelização da ferida epitelial corneana com crescimento do pannus foi observada a partir do limbo. Os passos mais importantes são procedimentos para criar defeitos epiteliais lisos e até mesmo nas superfícies corneanas de camundongos e coelhos.

Novas terapêuticas médicas e cirúrgicas podem ser testadas nessas plataformas. O efeito da reepitelização pode ser monitorado após os procedimentos. A neovascularização da córnea e a opacidade após lesão neste protocolo seriam uma necessidade não atendida para novas pesquisas.