Name: Ex Vivo Liberação de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina do sistema trigeminovascular em roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a quantificar a liberação de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina em três sítios distintos do sistema trigeminovascular de roedores. Este método ex vivo permite investigar mecanismos farmacológicos relevantes para a neurobiologia da dor e enxaqueca.

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Este trabalho foi financiado pela Candys Foundation.

Todos os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram realizados em conformidade com o guia da Comunidade Europeia para o cuidado e uso de animais (2010/63/UE). Camundongos machos C57BL/6JBomTac, com 10 semanas de idade, e ratos Sprague Dawley machos, com 10 semanas de idade, foram usados para demonstrar esse protocolo.
1. Preparação do fluido intersticial sintético
<ol><li>Preparar fluido intersticial sintético (SIF) de acordo com a seguinte receita: 108 mM NaCl, 3,48 mM KCl, 3,50 mM MgSO 4, 26 mM NaHCO3, 11,70 mM NaH 2 PO4, 1,50 mM CaCl2,9,60 mM Na-gluconato, 5,50 mM de glicose e 7,60 mM de sacarose (ver Tabela de Materiais). NOTA: O SIF pode ser variado dependendo do alvo de estimulação, por exemplo, uma solução livre de cálcio pode ser usada ao estudar os canais de cálcio.</li>
	<li>Ajustar o pH para 7,4 e estabilizar o pH por gaseificação de carbogênio (5% de CO 2 e 95% de O2)46.</li>
</ol>2. Eutanásia
<ol><li>Anestesiar camundongos e ratos adultos com uma mistura de 70% de CO 2 e 30% de O2. Decapitar ratos usando uma tesoura e ratos usando uma guilhotina (ver Tabela de Materiais). NOTA: Use uma cepa e idade que se encaixe no objetivo da pesquisa. Tanto machos quanto fêmeas podem ser usados neste modelo.</li>
	<li>Separe a cabeça do corpo no nível C3-C4 da medula espinhal. NOTA: A eutanásia também pode ser realizada com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital (100-150 mg/kg).</li>
</ol>3. Dissecção
<ol><li>Prepare o tecido do rato seguindo os passos abaixo.<ol><li>Remova a pele e o músculo ao redor da cabeça e pescoço usando uma tesoura (Figura 1A).</li>
		<li>Use um aparador ósseo e uma tesoura para separar as mandíbulas inferiores da cabeça (Figura 1B-C).</li>
		<li>Abra a medula espinhal inserindo um aparador ósseo caudalmente na parte dorsal das vértebras e remova a parte dorsal das vértebras para expor a medula espinhal e o tronco encefálico (Figura 1D).</li>
		<li>Cortar a parte caudal do crânio pelas bordas dos ossos occipital e interparietal para remover essas estruturas ósseas que expõem o cerebelo (Figura 1E). NOTA: É importante não danificar o tronco cerebral e a medula espinhal ao cortar e remover as vértebras.</li>
		<li>Isole o TNC (Sp5C) correndo caudalmente aproximadamente 13-16 mm do bregma de cada lado, cortando a parte dorsolateral do tronco encefálico com uma tesoura de mola. Mergulhe o TNC do lado esquerdo e direito no SIF (Figura 1E-I). NOTA: A descrição corresponde a ratos adultos.</li>
		<li>Corte a cabeça no meio do sagito para dividir o crânio em dois usando uma serra (Figura 1J-L).</li>
		<li>Remova cuidadosamente o cérebro sem tocar na dura-máter ligada ao crânio usando uma espátula e cortando o nervo trigêmeo onde ele entra no tronco encefálico (Figura 1M-P).</li>
		<li>Para isolar o TG, corte-o, incluindo seus ramos ao redor das bordas visuais. Corte o ramo mandibular onde entra no forame oval. Corte os ramos oftálmicos e maxilares que entram no crânio, pois eles não são divididos macroscopicamente. Ao dissecar o TG, retire a dura-máter que cobre o TG (Figura 1Q-T).</li>
		<li>Mergulhe as metades do crânio e os TGs no SIF.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare o tecido do rato seguindo os passos abaixo.<ol><li>Remover a pele e o músculo ao redor da cabeça e pescoço com tesoura pequena (Figura 2A-B).</li>
		<li>Abra a medula espinhal inserindo uma pequena tesoura caudalmente na parte dorsal das vértebras e remova a parte dorsal das vértebras para expor a medula espinhal e o tronco encefálico (Figura 2C). NOTA: É importante não danificar a medula espinhal ao cortar e remover as vértebras.</li>
		<li>Cortar o crânio pelas bordas dos ossos occipital e interparietal para remover essas estruturas ósseas expondo o cerebelo (Figura 2D-F).</li>
		<li>Em seguida, corte o osso parietal no meio sagitalmente e retire o osso para expor o cérebro (Figura 2G-I).</li>
		<li>Remova cuidadosamente o cerebelo com uma espátula para expor o tronco encefálico (Figura 2J).</li>
		<li>Isole a parte do tronco encefálico contendo TNC usando uma tesoura de mola (Figura 2K-N). Imergir o tronco encefálico com TNC em SIF (Figura 2O).</li>
		<li>Remova o cérebro e corte o nervo trigêmeo onde ele entra no tronco encefálico (Figura 2P-Q).</li>
		<li>Para isolar o TG, corte-o, incluindo seus ramos ao redor das bordas visuais. Corte o ramo mandibular onde entra no forame oval. Corte os ramos oftálmicos e maxilares que entram no crânio, pois eles não são divididos macroscopicamente. Ao dissecar o TG, remova a dura-máter que cobre o TG (Figura 2R-S).</li>
		<li>Mergulhe os TGs no SIF (Figura 2T).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Lavagem
<ol><li>Lave as metades do crânio, TNCs e TGs no SIF por 30 minutos enquanto substitui o SIF a cada 5 minutos à temperatura ambiente. NOTA: As etapas de lavagem podem ser realizadas mantendo o tecido em recipientes de plástico com uma tampa de tule para facilitar a troca de SIF (Figura 3A-B).</li>
	<li>Prepare o tecido do rato seguindo os passos abaixo.<ol><li>Transfira as metades TNC para separar as tampas dos tubos de microcentrífuga com 350 μL de SIF (Figura 3C).</li>
		<li>Transfira os TGs para tampas de tubo de microcentrífuga - um TG por tampa de tubo de microcentrífuga com 350 μL de SIF (Figura 3C).</li>
		<li>Coloque as metades do crânio em plataformas feitas de argila ou uma placa de cultura de 6 poços e preencha o crânio com 400 μL de SIF (Figura 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare o tecido do rato seguindo os passos abaixo.<ol><li>Transfira o tronco encefálico com TNC para uma tampa de tubo de microcentrífuga com 250 μL de SIF (Figura 3D).</li>
		<li>Transfira os dois TGs para uma tampa de tubo de microcentrífuga com 250 μL de SIF (Figura 3D). NOTA: Coloque dois TGs por tampa de tubo de microcentrífuga ao usar tecido de camundongos.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocar crânios de rato e tampas de tubos de microcentrífuga com tecido de rato e rato numa incubadora humidificada a 37 °C. Substitua o SIF usando uma pipeta a cada 5 minutos por 20 minutos. NOTA: É importante não tocar no tecido ao adicionar e remover o SIF.</li>
</ol>5. Teste de drogas
<ol><li>Determine os níveis basais de liberação de CGRP.<ol><li>Após a última lavagem, adicionar 250 μL de SIF ao TG e ao TNC do rato. Adicionar 350 μL ao TG e TNC do rato e 400 μL a cada crânio de rato.</li>
		<li>Após 10 min de incubação, recolher 200 μL da amostra num tubo de microcentrífuga e adicionar 50 μL de tampão EIA 10x (fornecido com o kit de imunoensaio enzimático CGRP, ver Tabela de Materiais) para permitir a medição da libertação basal de CGRP (passo 6). Descarte o líquido restante. NOTA: O tempo de incubação deve ser o mesmo para todas as amostras.</li>
		<li>Conservar imediatamente as amostras a -20 °C.</li>
		<li>Após a amostragem dos níveis basais de liberação de CGRP, siga um dos três métodos: (A) Estimulação única (etapa 5.2); (B) Estimulação concentração-resposta (etapa 5.3); e (C) Inibição da estimulação (etapa 5.4) (Figura 4). NOTA: O composto de ensaio e as concentrações utilizadas dependem do objectivo do estudo.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize uma única estimulação seguindo os passos abaixo.<ol><li>Adicionar o composto de ensaio ou veículo ao tecido e deixá-lo durante 10 minutos (volume: 250 μL para TG e TNC de rato, 350 μL para TG e TNC de rato e 400 μL para cada crânio de rato).</li>
		<li>Após 10 min de incubação, coletar 200 μL da amostra em um tubo de microcentrífuga com 50 μL de tampão EIA 10x. Rejeitar o líquido restante e conservar imediatamente as amostras a -20 °C. NOTA: O tempo de incubação deve ser o mesmo para todas as amostras.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize a estimulação de concentração-resposta seguindo os passos abaixo.<ol><li>Diluir o composto ou veículo de ensaio até às concentrações pretendidas. Adicionar o composto de ensaio em concentrações crescentes, começando pela concentração mais baixa. NOTA: O composto de ensaio e as concentrações utilizadas dependem do objectivo do estudo. Por exemplo, 1 μM, 10 μM e 100 μM de supercinamaldeído foram utilizados para o presente estudo.</li>
		<li>Adicionar a concentração mais baixa (1 μM para o presente estudo) do composto de ensaio e do veículo correspondente a duas preparações teciduais idênticas e incubar durante 10 min (volume: 250 μL para o tecido do rato, 350 μL para o TG do rato e o TNC e 400 μL para cada crânio do rato).</li>
		<li>Após 10 min de incubação, coletar 200 μL da amostra em um tubo de microcentrífuga com 50 μL de tampão EIA 10x.</li>
		<li>Descarte o líquido restante e adicione a segunda menor concentração (10 μM para o presente estudo) ao tecido.</li>
		<li>Conservar imediatamente as amostras a -20 °C.</li>
		<li>Repetir este procedimento com as concentrações restantes (100 μM para o presente estudo).</li>
	</ol></li>
	<li>Realize a inibição da estimulação seguindo os passos abaixo.<ol><li>Adicionar o bloqueador ou veículo ao tecido e incubar durante 10 min (volume: 250 μL para o tecido do rato, 350 μL para o TG e o TNC do rato e 400 μL para cada crânio de rato). NOTA: O bloqueador e a concentração utilizados dependem do objetivo do estudo. Por exemplo, 3 μM de glibenclamida foram utilizados para o resultado representativo na Figura 5.</li>
		<li>Após 10 min de incubação, coletar uma amostra de 200 μL em um tubo de microcentrífuga com 50 μL de tampão EIA 10x. Rejeitar o líquido restante e conservar imediatamente as amostras a -20 °C.</li>
		<li>Adicione o agonista ou agonista + bloqueador (ver Tabela de Materiais) ao tecido e incube por 10 min. NOTA: O agonista, o bloqueador e as concentrações utilizadas dependem do objetivo do estudo. No presente estudo, foram utilizados 3 μM de glibenclamida e 1 μM de capsaicina, Figura 5.</li>
		<li>Após 10 min de incubação, coletar uma amostra de 200 μL em um tubo de microcentrífuga com 50 μL de tampão EIA 10x. Rejeitar o líquido restante e conservar imediatamente as amostras a -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize um controle positivo para o experimento.<ol><li>Quando apropriado, adicione um controle positivo (por exemplo, 1-10 μM de capsaicina, ver Tabela de Materiais) ao tecido no final do protocolo e colete uma amostra de 200 μL em um tubo de microcentrífuga com 50 μL de tampão EIA 10x após um período de incubação de 10 min. NOTA: É vantajoso incluir um controle positivo para garantir que a configuração e os tecidos estejam funcionando. A capsaicina 48,49,50 ou o estímulo despolarizante do potássio (40-60 mM de KCl)46,47,49 são rotineiramente utilizados para causar a liberação de CGRP do sistema trigeminovascular. 40-60 mM de KCl SIF é preparado como SIF, exceto que o NaCl é trocado por KCl em uma base equimolar.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Análise das concentrações de CGRP
<ol><li>Meça a quantidade de CGRP liberada usando um kit de imunoensaio enzimático (EIA) seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Meça a densidade óptica a 410 nm usando um fotômetro de placa. Se um kit CGRP EIA diferente for usado, meça a densidade óptica no comprimento de onda fornecido no protocolo do fabricante. NOTA: As amostras devem ser diluídas para corresponder à curva padrão.</li>
	<li>Realizar análise de dados.<ol><li>Apresente os dados como concentrações absolutas ou normalize a liberação basal de CGRP do tecido específico.</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método descrito foi desenvolvido após estudos que mostraram a importância da CGRP na fisiopatologia da enxaqueca. É adequado para investigar os mecanismos envolvidos na liberação de CGRP do sistema trigeminovascular, que é crucial para a sinalização da dor na região da cabeça. A quantidade de CGRP obtida neste modelo mede diretamente a liberação de CGRP dos nervos trigêmeos que inervam dura-máter, TG e TNC. A quantidade de liberação de CGRP é quantitativamente maior45,54 do que a liberação medida no plasma após termocoagulação em humanos, estimulação do trigêmeo em gato 39,55,56 e durante ataques de enxaqueca23. Uma explicação poderia ser que a CGRP é diluída e degradada no sangue54. No entanto, deve-se notar que a estimulação direta com produtos químicos pode ser superior à ativação fisiopatológica. Outras vantagens são que é possível localizar a liberação de três locais diferentes dentro do sistema trigeminovascular e que ela pode ser usada em conjunto com a manipulação farmacológica e em tecidos de roedores geneticamente modificados.
Ultimamente, muitos modelos pré-clínicos de roedores se concentram na administração sistêmica de substâncias e subsequentes leituras relacionadas à dor ou enxaqueca usando o teste de von Frey 57,58, caretas 59,60,61 ou aversão à luz 62,63,64. Esses métodos são úteis para entender as propriedades indutoras e de alívio da dor de diferentes substâncias. No entanto, estas abordagens não fornecem informações sobre os tecidos-alvo específicos envolvidos. No presente método, o sistema trigeminovascular é dividido em três estruturas: dura-máter, TG e TNC. Isso permite a exposição local de cada estrutura e a avaliação do local de ação de uma substância específica. Isso foi utilizado em um estudo de 2011, onde o papel dos canais de cálcio dependentes de voltagem em ratos foi explorado, e a inibição desses canais mostrou-se diferente nas três estruturas da via trigeminovascular47. Ao dissecar estruturas do sistema nervoso, a axotomia é inevitável. Demonstrou-se que a axotomia altera a transcrição de vários genes65. Essas alterações transcricionais são muito lentas para impactar os resultados desse método, mas as alterações na fosforilação não podem ser excluídas quando comparadas a situações in vivo 46. Embora neuropeptídeos como o CGRP sejam formados no soma-célula, a liberação e a ação dos neuropeptídeos geralmente estão nos terminais nervosos centrais ou periféricos. Assim, estudos de neurônios intactos, incluindo terminais, são interessantes quando se estuda a liberação de neuropeptídeos. Portanto, métodos de estudo de culturas de neurônios de gânglios isolados foram estabelecidos para servir como um modelo dos terminais. No entanto, as culturas de células neuronais estão sujeitas a vários problemas, pois a dissociação mecânica pode destruir neurônios em uma cultura46. O maior período de tempo associado à cultura de células torna esse método sensível a alterações transcriptômicas decorrentes de axotomia e condições de cultura65. Além disso, a adição de fatores de crescimento e cultura em revestimentos superficiais têm propriedades neuronais alteradas como expressão de transmissores e receptores66,67,68,69. Esses problemas são evitados ao estudar gânglios intactos recém-isolados em vez de culturas de células neuronais.
Um desafio com o método de liberação ex vivo de CGRP é a dissecção precisa do tecido necessário para resultados reprodutíveis. A dissecação especialmente precisa do TNC é um desafio, pois esta é uma estrutura dentro do tronco cerebral sem bordas visíveis. Além disso, a dura-máter é frágil e a remoção do cérebro precisa ser cuidadosamente realizada para garantir uma estrutura intacta. Esses obstáculos podem resultar em diferentes tamanhos de tecido e, portanto, níveis basais e de CGRP induzidos por estimulação. No entanto, essa variação pode ser explicada pela normalização para a liberação basal do CGRP. Também deve ser notado que, ao isolar o TNC de camundongos, toda a parte inferior do tronco encefálico é isolada e não a parte mais específica contendo TNC, como feito em ratos. Em geral, pode ser uma vantagem o uso de tecido de rato, pois isso permite a medição da liberação de CGRP da dura-máter e a dissecção mais precisa do TNC. Além disso, o tamanho do tecido também permite o uso de um rato como seu controle de veículo, pois um rato resulta em duas metades cranianas, dois TGs e dois TNCs, onde um pedaço do tecido é usado para estimulação de substâncias e o outro para o veículo. Ao usar camundongos, dois animais são necessários para um experimento, pois ambos os TGs são agrupados em uma amostra, e os TNCs são dissecados como um tronco encefálico. Portanto, dois TGs e um tronco encefálico são usados para estimulação de substâncias, e dois TGs e um tronco cerebral de outro rato são usados para controle de veículos. Isso resulta no uso de duas vezes mais camundongos em comparação com ratos para obter o mesmo número de replicações. Para reduzir o número de camundongos utilizados, um método para medir a liberação de CGRP a partir de fatias do tronco encefálico foi sugerido49. É uma vantagem que o método tenha sido modificado para permitir o uso de ratos. Isso permite o uso de muitas cepas de camundongos transgênicos já disponíveis, uma ferramenta útil para estudar, por exemplo, vias de sinalização. Um controle positivo no final de um experimento deve ser incluído para garantir que o tecido usado no experimento possa liberar CGRP. O controle positivo pode ser a capsaicina agonista TRPV1 ou o estímulo despolarizante potássio (KCl), que liberam CGRP do sistema trigeminovascular em camundongos e ratos 46,47,48,49,50. Além disso, o método também foi adaptado para medir a liberação de outros peptídeos relevantes como peptídeo ativador de adenilato ciclase hipofisário (PACAP) - outro peptídeo de grande interesse dentro da pesquisa sobre enxaqueca70.
O método fornece uma ferramenta útil para investigar a liberação de CGRP de tecidos-alvo específicos em ratos e camundongos. É um método relativamente rápido que evita problemas associados à cultura de neurônios. O protocolo do método pode ser facilmente modificado para estudar a relação concentração-resposta ou inibição de uma resposta por vários compostos farmacológicos. O método de liberação ex vivo de CGRP é um dos vários métodos pré-clínicos úteis para estudar o papel da CGRP e outros mecanismos relacionados à liberação de CGRP na fisiopatologia da enxaqueca.

A enxaqueca é um distúrbio neurológico que, segundo a OMS, estima-se que afete mais de 1 bilhão de pessoas e seja uma das principais causas de incapacidade em todo o mundo1. Assim, a enxaqueca tem um impacto significativo nos pacientes e na sociedade. Apesar do recente sucesso clínico dos medicamentos antagonizantes da CGRP, uma grande proporção de pacientes necessita de melhores opções de tratamento 2,3,4,5. É necessária a elucidação da fisiopatologia da enxaqueca que leva a novos tratamentos eficazes. A sinalização dentro do sistema trigeminovascular constituído pelas meninges, gânglios do trigêmeo (TG) e núcleo caudal do trigêmeo (TNC) é fundamental para a fisiopatologia da enxaqueca 6,7.
O peptídeo neuropeptídico de 37 aminoácidos calcitonina gene-related peptide (CGRP) foi descoberto pela primeira vez no início da década de 1980, quando Amara e colegas demonstraram que o RNA-transcrito primário do gene da calcitonina poderia ser processado para dar mRNA codificando para CGRP, além da calcitonina 8,9. A pesquisa subsequente sugeriu uma ligação com a fisiopatologia da enxaqueca10. A RCPG é um neurotransmissor com potentes propriedades vasodilatadoras 11,12,13,14,15,16,1 7, e está amplamente distribuída no sistema nervoso central e periférico 13,14,18,19,20,21,22 . O envolvimento da CGRP na enxaqueca foi ressaltado com a descoberta de níveis aumentados de CGRP na circulação extracerebral durante os ataques de enxaqueca em humanos23, e que a infusão de CGRP causa dor semelhante à enxaqueca em pacientes24. Dois anos depois, foi publicado o primeiro estudo de prova de conceito da efetividade do antagonista da CGRP olcegepant no tratamento da enxaqueca25.
A RCPG é abundante no sistema trigeminovascular, como demonstrado no TG21,26, fibras nervosas sensoriais que inervam a dura-máter27,28,29 e TNC30. No sistema trigeminovascular, a CGRP é encontrada nos neurônios de pequeno a médio porte do TG, nas fibras C não mielinizadas e é expressa em quase 50% da população neuronal do TG. O receptor CGRP é expresso principalmente em neurônios maiores e encontrado em fibras Aδ mielinizadas31,32. A CGRP é liberada dos neurônios por estimulação química ou elétrica33,34. Estudos de vias que levam à liberação de CGRP e a localização dessa ativação são cruciais para entender a fisiopatologia da enxaqueca. Ao longo das últimas 5 décadas, estudos pré-clínicos contribuíram para o amplo conhecimento sobre a sinalização relacionada à enxaqueca e contribuíram para o desenvolvimento de novos tratamentos35. Muitos métodos que consideram o envolvimento vascular e neurogênico têm sido modificados e aplicados na pesquisa da enxaqueca. Modelos in vivo e in vitro de respostas arteriais a compostos biológicos ou tratamentos farmacológicos17,36,37 e estimulação elétrica nervosa38,39 podem ser mencionados. Além disso, neurônios ativados no TNC podem ser detectados pela expressão de c-Fos 40,41,42 e registros eletrofisiológicos nessa área43,44. Ambos os métodos medem sinais nociceptivos transmitidos ao cérebro a partir da cabeça, por exemplo, dura-máter. O uso de apenas um modelo pré-clínico não apresenta o quadro completo da fisiopatologia da enxaqueca. Portanto, é importante combinar diferentes modelos que cobrem o maior número possível de aspectos da fisiopatologia da enxaqueca. O desenvolvimento contínuo de novos modelos cobrirá vários aspectos dos mecanismos da enxaqueca e, com o tempo, o mistério da fisiopatologia da enxaqueca será descoberto.
Aqui, é apresentado um protocolo detalhado do método de liberação de CGRP, realizado ex vivo em TG e TNC isolados de camundongos após estimulação química. A liberação de CGRP também pode ser estudada na dura-máter de ratos. Assim, no protocolo experimental para ratos, a dura-máter é descrita juntamente com TG e TNC. A base para o método de liberação de CGRP foi descrita pela primeira vez em 1999, onde Ebersberger e colegas de trabalho realizaram pesquisas pioneiras e descobriram que a CGRP foi liberada da dura-máter após estimulação química e elétrica de aferentes durais em ratos45. Mais tarde, essa abordagem foi estendida para a liberação CGRP do TG46 e do TNC47. Posteriormente, o método foi modificado para aplicação ao TG e TNC em camundongos. Até agora, a liberação de CGRP da dura-máter tem sido desafiadora em camundongos.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de 6 poços</td><td>NUNC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Merck</td><td>1.02382.1000</td><td>Para tampão SIF</td></tr><tr><td>Tampas para recipientes de plástico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536617</td><td></td></tr><tr><td>Capsaicina</td><td>Merck</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>CGRP kits</td><td>AH Diagnostics</td><td>A05482.96</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Strandm&oslash; llen</td><td>4.6</td><td>Para gaseificação de carbogênio de SIF</td></tr><tr><td>Delicado Aparador de Ossos</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>16109-14</td><td></td></tr><tr><td>Glibenclamida</td><td>Tocris</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>Para tampão SIF</td></tr><tr><td>Guilhotina para ratos</td><td>Scandidact</td><td>NS-802</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Merck</td><td>M5921</td><td>Para tampão SIF</td></tr><tr><td>Tubos de microcenrífugo + tampas/tampas</td><td>VWR</td><td>700-5239</td><td></td></tr><tr><td>Mini Serra de Hacksaw</td><td>BAHCO</td><td>208</td><td></td></tr><tr><td>O2</td><td>Strandm&oslash; llen</td><td>4.5</td><td>Para gaseificação de carbogênio de SIF</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Glostrup farmácia</td><td>NA</td><td>Fórmula magistral</td></tr><tr><td>Recipientes de plástico</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>536455</td><td></td></tr><tr><td>Fotômetro de placa - Infinite M200</td><td>Tecan</td><td>NA</td><td>Infinite M200 é descontinuado. Um Infinite 200 PRO está disponível em Tecan. Software: SW Magellan v.6.3</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Merck</td><td>P9333</td><td>Para tampão SIF</td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Allgaier Instruments</td><td>307-156-170</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura pequena</td><td>Allgaier Instruments</td><td>04-520-115</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Merck</td><td>S6014</td><td>Para tampão SIF</td></tr><tr><td>Cloreto</td> <td>de sódioMerck</td><td>S9888</td><td>para tampão SIF</td></tr><tr><td>dihidrogenofosfato de sódio monohidratado</td><td>Merck</td><td>1.06346.1000</td><td>para tampão SIF</td></tr><tr><td>gluconato de sódio</td><td>Merck</td><td>S2054</td><td>para tampão SIF</td></tr><tr><td>Espátula</td><td>Bochem Lab Supply</td><td>3018</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Merck</td><td>84097</td><td>para Tampão SIF</td></tr><tr><td>Supercinamaldeído</td><td>Merck</td><td>S3322</td><td></td></tr><tr><td>Tule (tecidos)</td> <td>NA</td><td>NA</td><td>Comprado na loja de tecidos local</td></tr></tbody></table>

ex vivo liberação de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina do sistema trigeminovascular em roedores

Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents

O peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) foi descoberto pela primeira vez na década de 1980 como uma variante de emenda do gene da calcitonina. Desde a sua descoberta, o seu papel na fisiopatologia da enxaqueca tem sido bem estabelecido, primeiro pelas suas potentes propriedades vasodilatadoras e, posteriormente, pela sua presença e função como neurotransmissor no sistema trigeminovascular sensorial. A capacidade provocadora de enxaqueca da CGRP deu suporte à indústria farmacêutica para desenvolver anticorpos monoclonais e antagonistas inibindo o efeito da CGRP. Um novo paradigma de tratamento tem se mostrado eficaz no tratamento profilático da enxaqueca. Uma das ferramentas úteis para entender melhor os mecanismos de enxaqueca é o modelo ex vivo de liberação de CGRP do sistema trigeminovascular. É um método relativamente simples que pode ser usado com várias ferramentas farmacológicas para obter know-how para desenvolver novos tratamentos eficazes para a enxaqueca. O presente protocolo descreve um modelo de liberação de CGRP e a técnica para quantificar o efeito de agentes farmacológicos sobre a quantidade de CGRP liberada do sistema trigeminovascular em roedores. Um procedimento descrevendo a abordagem experimental da eutanásia para a medição dos níveis de proteína é fornecido. O isolamento essencial do gânglio do trigêmeo e do núcleo caudal do trigêmeo de camundongos e ratos e a preparação da dura-máter de ratos são descritos em detalhes. Além disso, resultados representativos de ambas as espécies (ratos e camundongos) são apresentados. A técnica é uma ferramenta fundamental para investigar os mecanismos moleculares envolvidos na fisiopatologia da enxaqueca usando vários compostos farmacológicos e animais geneticamente modificados.

Esta técnica é uma ferramenta para investigar os mecanismos moleculares relacionados à CGRP envolvidos na enxaqueca. Tem a vantagem de avaliar a liberação de CGRP a partir de diferentes níveis do sistema trigeminovascular e pode ser aplicado tanto em camundongos e ratos do tipo selvagem quanto transgênicos em combinação com vários compostos farmacológicos. Aqui, experimentos de concentração-resposta e bloqueio de ratos e resultados de concentração-resposta de camundongos do tipo selvagem e transgênicos são apresentados.
O método de liberação de CGRP foi usado para estudar o efeito do inibidor do canal KATP glibenclamida na liberação de CGRP de TG e dura-máter em ratas alodínicas espontâneas do trigêmeo (STA) de ratos. Primeiro, a concentração ideal de capsaicina foi encontrada usando um desenho de estudo de concentração-resposta. A exposição à capsaicina induziu uma liberação significativa de CGRP da dura-máter e TG em comparação com o veículo (Figura 5). Na dura-máter, a liberação máxima de CGRP foi encontrada a 1 μM de capsaicina e, no TG, a liberação máxima de CGRP foi encontrada a 10 μM de capsaicina (Figura 5A-B). Com base nos experimentos de concentração-resposta, 1 μM de capsaicina e 3 μM de glibenclamida foram utilizados para os experimentos de bloqueio. A glibenclamida não mostrou efeito sobre a liberação basal de CGRP da dura-máter (P = 0,441) e TG (P = 0,881) quando analisada com ANOVA one-way51. A glibenclamida reduziu significativamente a liberação de CGRP induzida por capsaicina na dura-máter em 40% (P = 0,031) e TG em 39% (P = 0,003) em comparação com a capsaicina com o veículo quando analisada com uma ANOVA unidirecional (Figura 5C-D)51.
Em camundongos, o protocolo foi usado para examinar o envolvimento do canal iônico potencial receptor transitório anquirina 1 (TRPA1) em um modelo de enxaqueca em camundongo GTN, onde a hipersensibilidade induzida por GTN foi totalmente dependente dos canais TRPA1. Verificou-se que o supercinamaldeído agonista TRPA1 (SCA) liberou CGRP de forma dose-dependente do TG com 1 μM, 10 μM e 100 μM de SCA, resultando em 9% (P = 0,23), 51% (P = 0,011) e 69% (P = 0,0097) aumento da liberação de CGRP em comparação com o veículo, respectivamente quando analisado com ANOVA de duas vias. Essa liberação foi ausente no TG de camundongos nulos Trpa1, onde a exposição a 1 μM, 10 μM e 100 μM de SCA resultou em 11% (P &gt; 0,99), -13% (P &gt; 0,99) e 9% (P = 0,97) por cento de mudança na liberação de CGRP em comparação com o veículo, respectivamente quando analisada com ANOVA bidirecional. A estimulação subsequente com 10 μM de capsaicina (controle positivo) mostra que todas as amostras de tecido poderiam liberar CGRP (Figura 6)50.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig01.jpg"> Figura 1: Dissecção passo a passo do tecido de ratos. Os detalhes (A-T) são fornecidos na seção do protocolo (etapa 3.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig02.jpg"> Figura 2: Dissecção passo a passo do tecido de camundongos. Os detalhes (A-T) são fornecidos na seção de protocolo (etapa 3.2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig03.jpg"> Figura 3: Lavagem e incubação do tecido roedor. (A-B) Tecido recém-isolado em recipientes plásticos com SIF. Os recipientes são cobertos com tule para permitir a fácil troca de SIF. (C) Tecido de rato - Duas metades cranianas com dura-máter cobrindo os revestimentos internos do crânio colocadas em uma placa de cultura de 6 poços. O núcleo caudal do trigêmeo direito e esquerdo em tampas separadas do tubo de microcentrífuga (fileira superior de pálpebras). Os dois gânglios do trigêmeo em tampas individuais de tubos de microcentrífuga (fileira inferior de tampas). (D) Tecido do rato - A parte do tronco encefálico do núcleo do trigêmeo caudal em uma tampa de tubo de microcentrífuga separada (topo). Dois gânglios do trigêmeo de camundongo estão em uma tampa de tubo de microcentrífuga (parte inferior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig04.jpg"> Figura 4: Desenhos de estudo para liberação de CGRP. Três protocolos diferentes para a realização de experimentos de liberação CGRP. As drogas devem ser diluídas em líquido intersticial sintético (SIF). (A) Estimulação única. (B) Estimulação concentração-resposta. (C) Inibição de uma estimulação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig05.jpg"> Figura 5: A glibenclamida inibe a liberação de CGRP induzida por capsaicina da dura-máter e do gânglio trigêmeo do rato. Os níveis de CGRP de gânglio trigêmeo e dura-máter isolados de ratas alcanínicas espontâneas do trigêmeo (STA) fêmeas (215-318 g) originalmente provenientes da Thomas Jefferson University52 foram medidos com kits comerciais de EIA CGRP humanos. (A-B) Liberação de CGRP da dura-máter (A) e do gânglio trigêmeo (B) após o aumento das concentrações de capsaicina (10 nM, 100 nM, 1 μM e 10 μM) (n = 4). Os dados são apresentados como pontos individuais e analisados com ANOVA two-way. p &lt; 0,0001 (C-D) Níveis de CGRP liberados de (C) dura-máter e (D) gânglio trigêmeo após 10 min de exposição ao veículo, 3 μM de glibenclamida (glib), 1 μM de capsaicina e 1 μM de capsaicina + 3 μM de glib (n = 6-11). Os dados são apresentados como pontos individuais e valores médios e foram analisados com ANOVA one-way. *em comparação com o veículo. #capsaicina em comparação com capsaicina + glib. #P &lt; 0,05, ** e ##P &lt; 0,01, ****P &lt; 0,0001. As análises foram seguidas com o teste de comparação múltipla de Bonferroni. Um nível significativo de α = 0,05 foi utilizado para todos os testes. Este número foi modificado a partir de Christensen et al. 51. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63723/63723fig06.jpg"> Figura 6: A exposição à SCA resulta na liberação de CGRP dependente de TRPA1 do gânglio trigêmeo do camundongo. Os níveis de CGRP liberados do gânglio trigêmeo isolado de WT e Trpa1 nulo (Trpa1tm1/Dpc)53 camundongos machos (8-10 semanas) foram medidos com kits de EIA CGRP de ratos após exposição ao supercinamaldeído (SCA) a 1 μM, 10 μM e 100 μM e capsaicina a 10 μM como controle positivo (n = 6). Os dados de cada rato são apresentados como pontos individuais, e as barras indicam os valores médios. Estatística: A comparação entre AEC e veículo em cada concentração e entre controle basal e positivo foi realizada com ANOVA repetida de duas vias. Um nível significativo de α = 0,05. *P &lt; 0,05, **P &lt; 0,01. Este número foi modificado a partir de Christensen et al. 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63723/63723fig06large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O presente protocolo descreve o modelo de liberação ex vivo do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP) e a estratégia para quantificar o efeito de agentes farmacológicos sobre a quantidade de CGRP liberada do sistema trigeminovascular em roedores.

Ex Vivo Liberação de peptídeo relacionado ao gene da calcitonina do sistema trigeminovascular em roedores

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) was first discovered in the 1980s as a splice variant from the calcitonin gene. Since its discovery, its role in ...

Este método é uma ferramenta para investigar mecanismos envolvidos na liberação de CGRP do sistema vascular do trigêmeo. A principal vantagem deste método é a capacidade de dividir o sistema vascular do trigêmeo em três locais diferentes e avaliar a liberação do CGRP dentro de cada local distinto. Demonstrando o procedimento estaremos eu e Inger Jansen-Olesen, cientista sênior do nosso grupo.Para começar, prepare o tecido do rato removendo a pele e o músculo ao redor da cabeça e pescoço usando uma tesoura. Em seguida, use um aparador de ossos e uma tesoura para separar as mandíbulas inferiores da cabeça. Agora exponha a medula espinhal e o tronco encefálico inserindo um aparador de ossos caudalmente na parte dorsal das vértebras e remova-o.Em seguida, corte a parte caudal do crânio pelas bordas dos ossos occipital e interparietal para remover essas estruturas ósseas, expondo o cerebelo. Para isolar o TNC correndo caudalmente aproximadamente 13 a 16 milímetros do bregma de cada lado, corte a parte dorsolateral do tronco encefálico com uma tesoura de mola. Isso é seguido pela imersão do TNC do lado esquerdo e direito no SIF.Em seguida, corte a cabeça no meio da flacidez para dividir o crânio em dois usando uma serra. Agora remova cuidadosamente o cérebro sem tocar na dura-máter ligada ao crânio usando uma espátula. Para isolar o TG, corte-o incluindo seus ramos ao redor das bordas visuais com o ramo mandibular entrando no forame oval e os ramos oftálmico e maxilar entrando no crânio.Em seguida, mergulhe as metades do crânio e os TGs no SIF. Para preparar o tecido do rato, remova a pele e o músculo ao redor da cabeça e pescoço usando uma tesoura. Agora exponha a medula espinhal e o tronco encefálico inserindo um par de tesouras caudalmente na parte dorsal das vértebras e remova-a.Em seguida, corte a parte caudal do crânio pelas bordas dos ossos occipital e interparietal para remover essas estruturas ósseas que expõem o cerebelo. Corte o osso parietal no meio da saggitally e remova o osso para expor o cérebro. Remova cuidadosamente o cerebelo para expor o tronco encefálico usando uma espátula.Isole o TNC que contém parte do tronco encefálico com uma tesoura de mola, seguido de imersão do tronco encefálico em SIF. Agora, remova cuidadosamente o cérebro usando uma espátula e corte o nervo trigêmeo onde ele entra no tronco cerebral. Para isolar o TG, corte-o incluindo seus ramos ao redor das bordas visuais com o ramo mandibular onde entra no forame oval e ramos oftálmicos e maxilares que entram no crânio.Em seguida, mergulhe os TGs no SIF. Para facilitar a troca de SIF, adicione uma tampa de pedágio aos recipientes de plástico e comece a lavar o tecido de rato e rato no SIF por 30 minutos, substituindo o SIF a cada cinco minutos. Após 30 minutos de lavagem à temperatura ambiente, transfira metades TNC de rato e TGs de rato para separar tampas de tubos de microcentrífuga com 350 microlitros de SIF.Transfira o tronco encefálico do rato com TNC para uma tampa de tubo de microcentrífuga com 250 microlitros de SIF. Finalmente, transfira os dois TGs de rato para uma tampa de tubo de microcentrífuga com 250 microlitros de SIF. Coloque as metades do crânio do rato em uma placa de cultura de seis poços e encha o crânio com 400 microlitros de SIF.Coloque crânios de ratos em tampas de tubos de microcentrífuga com tecido de rato e rato em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius. Substitua o SIF usando uma pipeta a cada cinco minutos por 20 minutos sem tocar no tecido. Preparar tubos de microcentrífuga para coleta de amostras por rotulagem apropriada.Em seguida, adicione 50 microlitros de tampão EIA de 10 forças a cada tubo de microcentrífuga. Em seguida, preparar a solução composta de ensaio e a solução do veículo diluindo em SIF para todas as concentrações. Após a última lavagem, adicione 250 microlitros de SIF ao TG e TNC do rato, 350 microlitros SIF ao TG e TNC do rato e 400 microlitros SIF a cada crânio de rato.Após 10 minutos de incubação, coletar 200 microlitros da amostra em um tubo de microcentrífuga pré-marcado com 50 microlitros de tampão EIA de 10 forças para permitir a medição da liberação basal de CGRP. Descarte o líquido restante e armazene imediatamente as amostras a menos 20 graus Celsius. Adicionar o composto de ensaio no veículo correspondente em concentrações crescentes, começando pela concentração mais baixa, e incubar durante 10 minutos.Após 10 minutos de incubação, coletar 200 microlitros da amostra em um tubo de microcentrífuga pré-marcado com 50 microlitros de tampão EIA de 10 forças. Descarte o líquido restante e adicione a segunda menor concentração ao tecido. Conservar imediatamente as amostras a menos 20 graus Celsius e repetir este procedimento com a concentração restante.Para realizar um controle positivo para o experimento, adicione o controle positivo ao tecido no final do protocolo. Após um período de incubação de 10 minutos, coletar uma amostra de 200 microlitros em um tubo de microcentrífuga com 50 microlitros de tampão EIA de 10 forças. As concentrações de CGRP liberadas nas amostras coletadas são medidas usando um kit EIA, seguindo as instruções do fabricante fornecidas com o kit EIA.No rato, a exposição à capsaicina induziu uma libertação significativa de CGRP da dura-máter e TG em comparação com o veículo. Na dura-máter, a liberação máxima de CGRP foi encontrada em um micromolar de capsaicina. E no TG, a liberação máxima de CGRP foi encontrada em 10 micromolares de capsaicina.Quando analisada com uma ANOVA unidirecional, a glibenclamida não mostrou efeito sobre a liberação basal de CGRP da dura-máter e TG. A glibenclamida reduziu significativamente a liberação de CGRP induzida por capsaicina na dura-máter em 40% e TG em 39% em comparação com a capsaicina com o veículo quando analisada com uma ANOVA unidirecional. Verificou-se que o potencial receptor transitório do agonista anquirina-1 super cinamaldeído libera CGRP de maneira dependente da concentração do TG com 1, 10 e 100 micromolares de super cinamaldeído, resultando em 9% 52% e 69% de aumento da liberação de CGRP em comparação com o veículo, respectivamente, quando analisado com ANOVA bidirecional. O aumento da liberação de CGRP foi ausente no TG a partir do potencial receptor transitório Ankyrin-1 knockout camundongos onde a exposição a 1, 10 e 100 micromolares de super cinamaldeído resultando em 11% menos 13% e 9% de mudança na liberação de CGRP em comparação com o veículo, respectivamente, quando analisado com ANOVA bidirecional.É importante ter cuidado para não tocar no tecido durante a coleta de amostras e ser preciso ao cronometrar o tempo de incubação para todas as amostras. Se kits ELISA adequados estiverem disponíveis, é possível aplicar este procedimento para medir a liberação de outros peptídeos presentes no sistema vascular do trigêmeo.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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