Name: In vivo Leituras de lesões vasculares na retina de camundongos para promover a reprodutibilidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a quantificar lesões retinianas em camundongos usando angiografia fluoresceínica e tomografia de coerência óptica. Este protocolo padronizado permite medir espessura das camadas, vazamento vascular e desorganização tecidual com alta reprodutibilidade entre animais experimentais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pela bolsa do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (NSF-GRFP) DGE - 1644869 (para CKCO), o National Eye Institute (NEI) 5T32EY013933 (para AMP), o Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (RO1 NS081333, R03 NS099920 para CMT) e o Departamento de Defesa Exército / Força Aérea (DURIP para CMT).

Este protocolo segue a declaração da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) para o uso de animais em pesquisas oftálmicas e de visão. Experimentos com roedores foram aprovados e monitorados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Columbia.
NOTA: A imagem foi feita em camundongos machos C57BL/6J de 2 meses de idade que pesavam aproximadamente 23 g.
1. Preparação de reagentes para imagens da retina
<ol><li>Preparação de solução injetável de fluoresceína. NOTA: A fluoresceína é muito sensível à luz. Proteja da luz e use-o logo após a preparação.<ol><li>Diluir a fluoresceína a uma concentração de 1% em solução salina estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de cetamina/xilazina<ol><li>Diluir cetamina e xilazina em solução salina estéril de acordo com a seguinte concentração: cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg).</li>
	</ol></li>
	<li>Solução salina estéril<ol><li>Prepare uma seringa de 5 ml com uma agulha de 26 G com solução salina estéril.</li>
	</ol></li>
</ol>2. OCT e imagens fluoresceínas
<ol><li>Ligue a caixa de luz do microscópio de imagem da retina, a máquina OCT e a plataforma de mouse aquecida.</li>
	<li>Ligue o computador e abra o programa de criação de imagens.</li>
	<li>Adicione uma gota de fenilefrina e tropicamida a cada olho.</li>
	<li>Injete 150 μL de anestesia (cetamina (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg)) por via intraperitoneal (IP). Determine a profundidade da anestesia por beliscão do dedo do pé e espere até que o animal não responda. Aplique pomada oftálmica ou lágrimas artificiais em ambos os olhos.</li>
	<li>Acomodem o mouse na plataforma.</li>
	<li>Ajuste a altura e o ângulo da plataforma até que a visão do fundo retiniano esteja clara e focada. Tire uma foto do fundo.</li>
	<li>Abra o software de imagem e OCT. No programa OCT, ajuste o empurrão para 5.</li>
	<li>Tire uma imagem OCT a 75 μm distal da queimadura. Repita para os outros três quadrantes da retina.</li>
	<li>Injete 100 μL de 1% de fluoresceína IP.</li>
	<li>Mude a câmera para um filtro de 488 nm. Aumente o ganho da câmera para 5.</li>
	<li>Tire uma foto do fundo de olho exatamente 5 minutos após a injeção de fluoresceína. NOTA: Evite a exposição prolongada do olho à luz da câmera na configuração máxima, pois a fluoresceína pode exacerbar os fotodanos da retina. Mantenha a fonte de luz desligada até que o tempo de espera de 5 minutos tenha decorrido e o mouse esteja pronto para a geração de imagens.</li>
</ol>3. Cuidados posteriores
<ol><li>Injete 1 mL de solução salina estéril IP. Aplique colírios lubrificantes em ambos os olhos. Aplique pomada oftálmica ou lágrimas artificiais em ambos os olhos.</li>
	<li>Observe o rato enquanto ele se recupera da anestesia. Retornar à gaiola com outros animais somente quando totalmente recuperado, geralmente após cerca de 40 min.</li>
</ol>4. Avaliação dos critérios de exclusão
<ol><li>Abra a imagem do fundo de olho tirada 24 horas após o procedimento para avaliar os critérios de exclusão. Exclua o olho se algum dos seguintes critérios for identificado.</li>
	<li>Avaliar se a imagem tem zero oclusões<ol><li>Avalie a imagem para o número de vasos ocluídos. NOTA: Uma oclusão bem-sucedida geralmente tem alguma pigmentação roxa sobre ou ao redor da queimadura, vaso muito fino ou descontínuo através da queimadura, aparência de vaso fraco ou inexistente fora da área da queimadura e descoloração da retina por hipóxia. Se todo o vaso pode ser visto através da queimadura branca pelo laser, o vaso não conseguiu ocluir. Às vezes, o vaso aparecerá parcialmente obstruído, mas se parecer ininterrupto fora da queimadura, o vaso provavelmente não ocluiu.</li>
		<li>Para casos ambíguos, use imagens de AF ao mesmo tempo para avaliar as oclusões. Nessas imagens, uma oclusão aparecerá como uma quebra na continuidade de um vaso, muitas vezes com um afunilamento do vaso circundante.</li>
		<li>Se forem identificadas oclusões zero, exclua o olho da análise, pois o RVO é considerado ineficaz. NOTA: As oclusões geralmente se resolvem em 48-72 h pós-RVO, e a presença de oclusões não deve mais ser usada como critério de exclusão nesses momentos.</li>
	</ol></li>
	<li>Avaliar as imagens de fundo de olho e OCT para descolamento excessivo de retina NOTA: O acúmulo de líquido sub-retiniano é comum após a indução de RVO e causa a separação da retina neural da EPR. Os critérios de exclusão para o descolamento excessivo de retina são definidos da seguinte forma: a OCT será completamente invisível ou algumas camadas parecerão incrivelmente distorcidas. A qualidade da imagem é fraca, com perda de resolução das camadas plexiformes e PSE externas. A separação entre a retina neural e a coroide é maior do que o que o campo de visão OCT permite. Na imagem do fundo, o tom da retina será quase completamente branco, com algumas manchas roxas. Parte da retina pode parecer distorcida e fora de foco. Isso ocorre porque ele se desprendeu e está a uma distância focal diferente do resto da retina.<ol><li>Se a avaliação das imagens de um olho determinar o descolamento periférico ou completo da retina, exclua o olho da análise.</li>
	</ol></li>
	<li>Excluir imagens com evidência de catarata corneana NOTA: Uma catarata da córnea aparece como um ponto branco opaco na córnea do rato. A catarata geralmente ocorre devido à lubrificação insuficiente dos olhos enquanto o animal está anestesiado e pode ser amplamente evitada tomando cuidado para aplicar a pomada ocular generosamente. A catarata geralmente pode ser identificada antes da imagem, inspecionando o animal. Os ratos que desenvolveram catarata devem ser excluídos do conjunto de dados sem a necessidade de se submeterem ao processo de imagem. Na imagem, a catarata obscurecerá a retina da câmera e a OCT aparecerá deformada.</li>
	<li>Avalie a imagem para hemorragia excessiva NOTA: A hemorragia excessiva pode ser identificada como quantidades de líquido vermelho na imagem, geralmente obscurecendo o fundo da retina, o vaso e a queimadura. Essas áreas de fluido vermelho serão um vermelho mais brilhante e opaco do que as manchas roxas que são normais no RVO bem-sucedido. As hemorragias aparecem na camada de células ganglionares na imagem OCT e interferem na capacidade de visualizar outras camadas da retina sob a hemorragia.<ol><li>Se a imagem for determinada como tendo uma hemorragia excessiva, exclua o olho da análise.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Processamento de imagem fluoresceína
<ol><li>Abra a imagem fluoresceína no software de processamento de imagem.</li>
	<li>Duplicar a imagem</li>
	<li>Usando uma ferramenta de seleção, trace cuidadosamente os principais vasos.<ol><li>Os principais vasos são as veias e artérias mais espessas que irradiam para fora do disco óptico. Ignore quaisquer vasos que se ramificam a partir desses vasos.</li>
		<li>Se o vazamento impedir que o contorno do vaso seja visto perto do local de oclusão, rastreie o vazamento na localização aproximada do vaso (mantenha a espessura, conecte o último ponto visível ao próximo ponto visível).</li>
	</ol></li>
	<li>Na primeira imagem, exclua a seleção, deixando apenas o plano de fundo. Salve esta imagem mascarada.</li>
	<li>Mova a seleção para a segunda imagem, inverta a seleção e exclua, isolando os vasos. Salve esta imagem mascarada.</li>
	<li>Abra as duas imagens no ImageJ. Abra a imagem de fundo e meça a densidade integrada.</li>
	<li>Abra a imagem do vaso, selecione o contorno dos vasos e, em seguida, meça a intensidade média.</li>
	<li>Divida a densidade integrada do fundo pela intensidade média dos vasos, gerando a razão de vazamento para o olho.</li>
	<li>Registre essa razão de vazamento para cada olho em uma coorte experimental.</li>
	<li>Para maior controle do fundo, normalize os olhos experimentais para a razão média de vazamento dos olhos de controle não lesionados. NOTA: A fim de criar uma quantificação padronizada do vazamento de fluoresceína na imagem FA, este cálculo usa uma razão da densidade de fundo (onde o vazamento estará presente) com o brilho dos principais vasos para criar resultados que controlam a variação no brilho de imagem para imagem e podem ser quantificados de forma confiável. Os olhos que não estão danificados não têm vazamento e teoricamente devem ter proporções de zero. As razões calculadas a partir desses olhos de controle não danificados, portanto, representam ruído de fundo, e esse valor é usado para normalizar ainda mais os valores experimentais.</li>
</ol>6. Espessura da camada retiniana
<ol><li>Abra a imagem da OCT no software de processamento de imagem.</li>
	<li>Trace as bordas da camada de células ganglionares, camada plexiforme interna, camada nuclear interna, camada plexiforme externa, camada fotorreceptora e camada RPE. Meça a espessura média de cada camada.</li>
	<li>Repita para imagens OCT dos outros três quadrantes da retina. Média das espessuras médias da camada nos quatro quadrantes para obter a espessura média de cada camada da retina para o olho.</li>
	<li>Repetir para cada olho na coorte experimental.</li>
</ol>7. Desorganização das camadas internas da retina (DRIL)
<ol><li>Abra a imagem da OCT no ImageJ.</li>
	<li>Usando a ferramenta de linha, meça a distância em que a borda superior da camada plexiforme externa é indistinta. NOTA: É importante diferenciar entre DRIL e áreas de baixa visibilidade de camada causada por artefatos de imagem. A má qualidade da imagem OCT pode invalidar um olho para análise DRIL se a resolução de imagem suficiente não for possível. Imagens com DRIL normalmente terão outras regiões ou camadas da retina que são claramente resolvidas e organizadas, o que pode ser um bom indicador de qualidade de imagem suficiente.<ol><li>Meça horizontalmente a partir da latitude onde a desorganização começa até a latitude onde a borda superior da camada plexiforme externa se torna visível novamente, se for o caso. Mesmo que a camada plexiforme externa se desloque para cima ou para baixo verticalmente, meça perfeitamente horizontalmente.</li>
		<li>Pode haver várias áreas de desorganização separadas por áreas sem desorganização. Meça-os individualmente e calcule a soma das distâncias.</li>
	</ol></li>
	<li>Divida o comprimento da desorganização pelo comprimento total da retina visível em cada imagem OCT para obter a proporção de desorganização para a imagem.</li>
	<li>Repita a medição e o cálculo para imagens OCT dos outros três quadrantes da retina.</li>
	<li>Tomemos a média das proporções de desorganização das quatro imagens da OCT. Este número representa a desorganização média para toda a retina. Repetir para cada olho na coorte experimental.</li>
</ol>

<ol><li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burden+of+cerebrovascular+disease+in+the+united+states%5BTitle%5D)+AND+%22Preventing+Chronic+Disease%22%5BJournal%5D)">The burden of cerebrovascular disease in the united states.</a> Preventing Chronic Disease. 16, 180411(2019).</li>
<li>Nakahara, T., Mori, A., Kurauchi, Y., Sakamoto, K., Ishii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+interactions+in+the+retina%3A+physiological+and+pathological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Neurovascular interactions in the retina: physiological and pathological roles.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 123 (2), 79-84 (2013).</li>
<li>Jaulim, A., Ahmed, B., Khanam, T., Chatziralli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branch+retinal+vein+occlusion%3A+epidemiology%2C+pathogenesis%2C+risk+factors%2C+clinical+features%2C+diagnosis%2C+and+complications.+An+update+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Branch retinal vein occlusion: epidemiology, pathogenesis, risk factors, clinical features, diagnosis, and complications. An update of the literature.</a> Retina. 33 (5), 901-910 (2013).</li>
<li>Ho, M., Liu, D. T. L., Lam, D. S. C., Jonas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vein+occlusions%2C+from+basics+to+the+latest+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Retinal vein occlusions, from basics to the latest treatment.</a> Retina. 36 (3), 432-448 (2016).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+mouse+model+of+branch+retinal+vein+occlusion+and+retinal+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Development of a new mouse model of branch retinal vein occlusion and retinal neovascularization.</a> Japanese Journal of Ophthalmology. 51 (4), 251-257 (2007).</li>
<li>Ebneter, A., Agca, C., Dysli, C., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+retinal+morphology+alterations+using+spectral+domain+optical+coherence+tomography+in+a+mouse+model+of+retinal+branch+and+central+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Investigation of retinal morphology alterations using spectral domain optical coherence tomography in a mouse model of retinal branch and central retinal vein occlusion.</a> PLoS One. 10 (3), 0119046(2015).</li>
<li>Fuma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pharmacological+approach+in+newly+established+retinal+vein+occlusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A pharmacological approach in newly established retinal vein occlusion model.</a> Scientific Reports. 7, 43509(2017).</li>
<li>Cavallerano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ophthalmic+fluorescein+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Optometry%22%5BJournal%5D)">Ophthalmic fluorescein angiography.</a> Clinical Optometry. 5 (1), 1-23 (1996).</li>
<li>Laatikainen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescein+angiography+revolution%3A+a+breakthrough+with+sustained+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">The fluorescein angiography revolution: a breakthrough with sustained impact.</a> Acta Ophthalmologica Scandinavica. 82 (4), 381-392 (2004).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li>
<li>Oberwahrenbrock, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+intra-retinal+layer+thickness+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability of intra-retinal layer thickness estimates.</a> PLoS One. 10 (9), 0137316(2015).</li>
<li>Avrutsky, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+of+caspase-9+promotes+neurovascular+injury+in+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion.</a> Nature Communications. 11 (1), 3173(2020).</li>
<li>Colón Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J., Smart, J., Troy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+retinal+vein+occlusion+mouse+model+to+limit+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (174), e62980(2021).</li>
<li>Schmidt-Erfurth, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+management+of+retinal+vein+occlusion+by+the+European+society+of+retina+specialists+%28EURETINA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the management of retinal vein occlusion by the European society of retina specialists (EURETINA).</a> Ophthalmologica. 242 (3), 123-162 (2019).</li>
<li>Yoshimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+inflammatory+immune+mediators+in+vitreoretinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases.</a> PLoS One. 4 (12), 8158(2009).</li>
<li>Mezu-Ndubuisi, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+angiography+quantifies+oxygen-induced+retinopathy+vascular+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Optometry+and+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery.</a> Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).</li>
<li>Hui, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+spatial+and+temporal+analysis+of+fluorescein+angiography+dynamics+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative spatial and temporal analysis of fluorescein angiography dynamics in the eye.</a> PLoS One. 9 (11), 111330(2014).</li>
<li>Berry, D., Thomas, A. S., Fekrat, S., Grewal, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+disorganization+of+retinal+inner+layers+with+ischemic+index+and+visual+acuity+in+central+retinal+vein+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology.+Retina%22%5BJournal%5D)">Association of disorganization of retinal inner layers with ischemic index and visual acuity in central retinal vein occlusion.</a> Ophthalmology. Retina. 2 (11), 1125-1132 (2018).</li>
<li>Nicholson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+accuracy+of+disorganization+of+the+retinal+inner+layers+in+detecting+macular+capillary+non-perfusion+in+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Diagnostic accuracy of disorganization of the retinal inner layers in detecting macular capillary non-perfusion in diabetic retinopathy.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 43 (8), 735-741 (2015).</li>
<li>Obrosova, I., Chung, S., Kador, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+cataracts%3A+mechanisms+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2FMetabolism+Research+and+Reviews%22%5BJournal%5D)">Diabetic cataracts: mechanisms and management.</a> Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 26 (3), 172-180 (2010).</li>
<li>Hegde, K., Henein, M., Varma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+mouse+as+a+model+animal+for+the+study+of+diabetic+cataracts%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of the mouse as a model animal for the study of diabetic cataracts.</a> Ophthalmic Research. 35 (1), 12-18 (2003).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+collateral+vessel+formation+after+retinal+vein+occlusion+visualized+by+OCTA+and+elucidation+of+factors+in+their+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Time course of collateral vessel formation after retinal vein occlusion visualized by OCTA and elucidation of factors in their formation.</a> Heliyon. 7 (1), 05902(2021).</li>
<li>Haj Najeeb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+angiography+in+diabetic+macular+edema%3A+A+new+approach+to+its+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Investigation+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Fluorescein angiography in diabetic macular edema: A new approach to its etiology.</a> Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (10), 3986-3990 (2017).</li>
<li>Alam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+optical+coherence+tomography+angiography+features+for+objective+classification+and+staging+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Retina%22%5BJournal%5D)">Quantitative optical coherence tomography angiography features for objective classification and staging of diabetic retinopathy.</a> Retina. 40 (2), 322-332 (2020).</li>
<li>Uddin, M., Jayagopal, A., McCollum, G., Yang, R., Penn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+retinal+hypoxia+using+HYPOX-4-dependent+fluorescence+in+a+mouse+model+of+laser-induced+retinal+vein+occlusion+%28RVO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Investigation+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of retinal hypoxia using HYPOX-4-dependent fluorescence in a mouse model of laser-induced retinal vein occlusion (RVO).</a> Investigation Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3818-3824 (2017).</li>
<li>Qiang, W., Wei, R., Chen, Y., Chen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+pathological+features+and+current+animal+models+of+type+3+macular+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Clinical pathological features and current animal models of type 3 macular neovascularization.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 734860(2021).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+laser-induced+choroidal+neovascularization+in+the+rodent+retina+using+optical+coherence+tomography+angiography%5BTitle%5D)+AND+%22Investigation+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging laser-induced choroidal neovascularization in the rodent retina using optical coherence tomography angiography.</a> Investigation Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 331(2016).</li>
<li>Chen, J., Qian, H., Horai, R., Chan, C., Caspi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+optical+coherence+tomography+and+electroretinography+to+evaluate+retinal+pathology+in+a+mouse+model+of+autoimmune+uveitis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of optical coherence tomography and electroretinography to evaluate retinal pathology in a mouse model of autoimmune uveitis.</a> PLoS One. 8 (5), 63904(2013).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A imagem não invasiva da retina de roedores apresenta uma via para estudar a patologia e desenvolver intervenções. Estudos prévios desenvolveram e otimizaram um modelo de RVO em camundongos, limitando a variabilidade e permitindo a tradução confiável de patologias clínicas comuns na retina murina 5,7,13. Os desenvolvimentos na tecnologia de imagem oftálmica permitem ainda o uso de técnicas clínicas de imagem in vivo, co...

A doença neurovascular é um importante problema de saúde responsável por acidentes vasculares cerebrais isquêmicos, uma das principais causas de mortalidade e morbidade, e doenças vasculares da retina que levam à perda de visão 1,2. Para modelar a doença neurovascular, empregamos um modelo de camundongo de oclusão da veia retiniana (RVO). Este modelo não é invasivo e utiliza técnicas de imagem in vivo semelhantes àquelas usadas para examinar pessoas com doença vascular da retina em um ambiente clínico. A utilização desse modelo aumenta, assim, o potencial translacional dos estudos que utilizam esse modelo. Tal como acontece com todos os modelos de mouse, é fundamental maximizar a reprodutibilidade do modelo.
As doenças vasculares da retina são uma das principais causas de perda de visão em pessoas com menos de 70 anos. A RVO é a segunda doença vascular retiniana mais comum depois da retinopatia diabética3. As características clínicas características da OVR incluem lesão isquêmica, edema de retina e perda de visão como consequência da perda neuronal 3,4. Modelos de RVO em camundongos utilizando fotocoagulação a laser de vasos importantes foram desenvolvidos e refinados para replicar as principais patologias clínicas observadas no RVO humano 5,6,7. Os avanços na imagem oftálmica também permitem a replicação de ferramentas diagnósticas não invasivas utilizadas em humanos, a saber, a angiografia fluoresceína (AF) e a tomografia de coerência óptica (OCT)6. A Angiografia por Fluoresceína permite a observação de vazamentos devido à quebra da barreira sangue-retina (BRB), bem como a dinâmica do fluxo sanguíneo na retina, incluindo locais de oclusão, utilizando a injeção de fluoresceína, um pequeno corante fluorescente 8,9. A OCT permite a aquisição de imagens transversais de alta resolução da retina e o estudo da espessura e organização das camadas retinianas10. A análise de imagens de AF tem sido historicamente em grande parte qualitativa, o que limita o potencial de comparação direta e reprodutível entre os estudos. Recentemente, vários métodos têm sido desenvolvidos para a quantificação da espessura da camada em imagens de OCT, embora atualmente não exista um protocolo de análise padronizado e o local de aquisição da imagem da OCT varie11. Para aproveitar adequadamente essas ferramentas, é necessária uma metodologia de análise de dados padronizada, quantitativa e replicável. Neste trabalho, apresentamos três dessas leituras vasculares utilizadas para avaliar o dano patológico em um modelo de camundongo de vazamento de RVO-fluoresceína, espessura da camada OCT e desorganização das camadas retinianas.

<table><tbody><tr><td>AK-Fluor 10%</td> <td>Akorn</td><td>NDC: 17478-253-10</td><td></td></tr><tr><td>Carprofeno</td> sensível à luz <td>Rimadyl</td><td>NADA # 141-199</td><td>manter em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>GenTeal</td><td>Alcon</td><td>00658 06401</td><td></td></tr><tr><td>Imagem J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>InSight 2D</td><td>Phoenix Technology Group</td><td></td><td>OCT software de análise</td></tr><tr><td>Cloridrato de cetamina</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-0702-1</td><td></td></tr><tr><td>Fenileprina</td><td>Akorn</td><td>NDCL174478-201-15</td><td></td></tr><tr><td>Phoenix Micron IV</td><td>Phoenix Technology Grupo</td><td></td><td>Microscópio de imagem de retina</td></tr><tr><td>Phoenix Micron Meridian Module</td><td>Phoenix Technology Group</td><td></td><td>Software de fotocoagulador a laser</td></tr><tr><td>Phoenix Micron Módulo de tomografia de coerência óptica Phoenix</td><td>Technology Group</td><td></td><td>Software de imagem OCT</td></tr><tr><td>Phoenix Micron StreamPix Module</td><td>Phoenix Technology Group</td><td></td><td>Segmentação de aquisição e imagem de fundo de fundo</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refresh</td><td>Allergan</td><td>94170</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamida</td><td>Akorn</td><td>NDC: 174478-102-12</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>NDCL 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo leituras de lesões vasculares na retina de camundongos para promover a reprodutibilidade

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Os avanços nas ferramentas de imagem oftálmica oferecem um nível sem precedentes de acesso a pesquisadores que trabalham com modelos animais de lesão neurovascular. Para alavancar adequadamente essa maior traduzibilidade, há uma necessidade de conceber métodos reprodutíveis de extrair dados quantitativos dessas imagens. A tomografia de coerência óptica (OCT) pode resolver a histologia da retina na resolução de micrômetros e revelar diferenças funcionais no fluxo sanguíneo vascular. Aqui, delineamos leituras vasculares não invasivas que usamos para caracterizar o dano patológico pós-insulto vascular em um modelo otimizado de oclusão da veia retiniana (RVO) em camundongos. Essas leituras incluem análise de imagens ao vivo da morfologia da retina, desorganização das camadas internas da retina (DRIL) medida de isquemia capilar e medidas de angiografia fluoresceína de edema retiniano e densidade vascular. Essas técnicas correspondem diretamente àquelas usadas para examinar pacientes com doença da retina na clínica. A padronização desses métodos permite a comparação direta e reprodutível de modelos animais com fenótipos clínicos de doença oftálmica, aumentando o poder translacional dos modelos de lesão vascular.

Esses métodos de análise permitem a quantificação da patologia da retina capturada por imagens de AF e OCT. Os experimentos dos quais os dados representativos são extraídos usaram camundongos machos C57BL/6J que serviram como controles não feridos ou foram submetidos ao procedimento RVO e receberam colírios de tratamento Pen1-XBir3 ou colírios de veículo Pen1-Saline. O modelo de lesão RVO envolveu a irradiação a laser (532 nm) das veias principais em cada olho de um rato anestesiado após uma injeção na veia da cauda de r...

Aqui, apresentamos três protocolos de análise de dados para angiografia fluoresceína (AF) e tomografia de coerência óptica (OCT) no estudo da Oclusão da Veia Retiniana (RVO).

In vivo Leituras de lesões vasculares na retina de camundongos para promover a reprodutibilidade

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Este protocolo permite ao usuário medir quantitativamente marcadores clinicamente análogos de danos na imagem da retina de camundongos, o que reforça a traduzibilidade dos achados subsequentes. Esses métodos nos permitem agilizar a análise e nos dão a capacidade de comparar de forma confiável imagens entre animais experimentais. Embora esses métodos tenham sido desenvolvidos para estudar uma visão geral do modelo de camundongo, eles podem facilmente se estender à pesquisa sobre quaisquer doenças da retina que usem as mesmas técnicas de imagem.Ligue a caixa de luz do microscópio de imagem da retina, a máquina de tomografia de coerência óptica e a plataforma aquecida do mouse. Ligue o computador e abra o programa de criação de imagens. Adicione uma gota de fenilefrina e tropicamida a cada olho.Injete 100 microlitros de 1% de fluoresceína intraperitoneal. Acomodem o mouse na plataforma. Ajuste a altura e o ângulo da plataforma até que a visão do fundo retiniano esteja clara e focada.Tire uma foto do fundo. Abra o software de imagem e tomografia de coerência óptica. No programa de tomografia de coerência óptica ajustar o empurrão para 10.Pegue uma imagem de tomografia de coerência óptica, adicione 75 micrômetros distais da queimadura. Repita para os outros três quadrantes da retina. Mude a câmera para um filtro de 488 nanômetros.Aumente o ganho da câmera para 5. Tire uma foto do fundo exatamente 5 minutos após a injeção de fluoresceína. Abra a imagem fluoresceína no software de processamento de imagem.Duplique a imagem. Usando uma ferramenta de seleção, trace cuidadosamente os principais vasos. Ignore quaisquer vasos que se ramificam a partir desses vasos.Na primeira imagem, exclua a seleção, deixando apenas a embarcação. Salve esta imagem mascarada. Mova a seleção para a segunda imagem, inverta a seleção e exclua, isolando o plano de fundo.Salve esta imagem mascarada. Abra a imagem de fundo e meça a densidade integrada. Abra a imagem dos vasos, selecione o contorno dos vasos e, em seguida, meça a intensidade média.Divida a densidade integrada do fundo pela intensidade média dos vasos, gerando a razão de vazamento para o olho. Registre essa razão de vazamento para cada olho em uma coorte experimental. Para maior controle do fundo, normalize os olhos experimentais para a razão média de vazamento dos olhos de controle não lesionados.Abra a imagem da tomografia de coerência óptica no software de processamento de imagem. Trace as bordas da camada de células ganglionares, camada plexiforme interna, camada nuclear interna, camada plexiforme externa, camada fotorreceptora e camada RPE. Exporte os arquivos como CSV.Meça a espessura média de cada camada e repita para cada olho na coorte experimental. Abra a imagem da tomografia de coerência óptica na imagem J.Usando a ferramenta de linha, meça a distância em que a borda superior da camada plexiforme externa é indistinta. Meça horizontalmente, mantendo a latitude onde a desorganização começa.Calcule a soma das distâncias desorganizadas na imagem. Divida o comprimento da desorganização pelo comprimento total da retina para obter a razão de desorganização. Repita a medição e o cálculo para imagens de tomografia de coerência óptica dos outros três quadrantes da retina.Tomemos a média das razões de desorganização das quatro imagens de tomografia de coerência óptica. Este número representa a desorganização média para toda a retina. Repetir para cada olho na coorte experimental.As imagens mascaradas utilizadas para o cálculo da razão de vazamento para cada imagem de retina podem ser comparadas a outras e analisadas, separando a vasculatura maior de outras áreas da retina. A quantificação da fluoresceína permite a comparação da gravidade da lesão e da eficácia do tratamento, bem como o estudo das alterações no vazamento ao longo do curso do tempo da lesão. Observa-se uma delimitação das camadas da retina em uma imagem OCT.A quantificação da espessura para cada camada retiniana mostra que a resposta edematosa inicial tem um efeito mais profundo sobre as camadas internas da retina. A partir de uma análise de um curso temporal de dano de oclusão da veia da retina, o inchaço inflamatório inicial das camadas da retina e o eventual afinamento degenerativo podem ser observados. A camada nuclear interna experimenta uma resposta muito maior à lesão inicial, mas a camada plexiforme interna demonstra um afinamento mais grave após o edema inicial ter sido estabilizado e retornar à linha de base.A desorganização da camada interna da retina se manifesta como um desaparecimento do limite superior da camada plexiforme externa, misturando as camadas plexiformes externas e nucleares internas. A desorganização retiniana de dois grupos experimentais foi comparada para investigar a eficácia de um inibidor na mitigação do dano retiniano. A qualidade da imagem é de vital importância para a qualidade da análise.Ao adquirir imagens da retina, reserve um tempo para garantir que as camadas de fundo e retina sejam o mais claras e focadas possível. Esses métodos não invasivos podem ser usados longitudinalmente e em conjunto com o estudo bioquímico e imuno-histoquímico do tecido para criar perfis mais multifacetados e detalhados da doença. Esta técnica permite a quantificação confiável de dados de imagem retiniana in vivo em modelos de doença neurovascular, de modo que os dados possam ser mais facilmente traduzidos para a doença humana.

in-vivo-vascular-injury-readouts-mouse-retina-to-promote

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um método para a incorporação de DNA plasmidial em células da retina de camundongos com o propósito de realizar qualquer ganho ou perda de função de...

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

A microscopia intravital pode ser usada em animais para visualizar e medir diâmetros vasculares da retina, velocidades da corrente sanguínea e fluxo sanguíneo total da retina.

Medições de microscopia de vídeo intravital do fluxo sanguíneo retiniano em camundongos

A retina de roedores tem sido reconhecida como uma janela de acesso para o cérebro. Neste documento técnico que proporcionam um protocolo que utiliza o modelo de ratinho de retinopatia induzida por oxigénio para estudar os mecanismos que levam à insuficiência de regeneração vascular dentro do sistema nervoso central após a lesão isquémica. O sistema descrito também pode ser aproveitada para explorar estratégias para promover o crescimento de vasos sanguíneos funcionais dentro da retina e do...

Assessment of Vascular regeneração no SNC Usando o rato Retina

Aqui, apresentamos a utilidade da imagem longitudinal na vivo na sequência de alterações morfológicas da neovascularização de coroide do laser-induzida em camundongos.

Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse

Muitas doenças oculares visão em risco estão associadas com microvessels da retina disfuncional. Portanto, a medição das respostas arteríola retinal é importante para investigar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Este artigo descreve um protocolo detalhado para isolamento de rato arteríola retinal e preparação para avaliar os efeitos de substâncias vasoativas no diâmetro vascular.

Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

A retinopatia induzida pelo oxigênio (OIR) pode ser usada para modelar doenças isquêmicas da retina, como a retinopatia da prematuridade e a retinopatia diabética proliferativa e servir de modelo para estudos de prova de conceito na avaliação de drogas antiangiogênicas para doenças neovasculares. O OIR induz a neovascularização robusta e reprodutível na retina que pode ser quantificada.

Modelo de Retinopatia Induzida por Oxigênio para Doenças Isquêmicas da Retina em Roedores

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação e a coloração da imunofluorescência de montagem e análise plana de retina de camundongos. O uso de fluoresceína fundus angiography (FFA) para filhotes de camundongos e processamento de imagem também são descritos em detalhes.

Monitoramento do crescimento dinâmico dos vasos retinais no modelo de rato de retinopatia induzido pelo oxigênio

Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para oclusão da veia retiniana usando rosa bengala e um sistema de microscópio de imagem retiniana guiado a laser com recomendações para maximizar sua reprodutibilidade em cepas geneticamente modificadas.

Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade

Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.

Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Este protocolo modela a lesão de isquemia-reperfusão retiniana em um olho de camundongo, induzindo isquemia retiniana por meio de canulação da câmara anterior e elevação da pressão intraocular, seguida de normalização da pressão intraocular para iniciar a reperfusão.

Indução de lesão de isquemia-reperfusão retiniana em um modelo de olho de camundongo

Aprenda a quantificar lesões retinianas em camundongos usando angiografia fluoresceínica e tomografia de coerência óptica. Este protocolo padronizado permite medir espessura das camadas, vazamento vascular e desorganização tecidual com alta reprodutibilidade entre animais experimentais.

In vivo Leituras de lesões vasculares na retina de camundongos para promover a reprodutibilidade

Explorar mais vídeos