Reativação de Modelos celulares desmembrados em Chlamydomonas reinhardtii

Este método pode ajudar a entender quais fatores afetam a mobilidade cilia. A principal vantagem dessa técnica é que os fenômenos que ocorrem apenas temporariamente in vivo, tais inversão de concentrações de íons de cálcio em cílios podem ser continuamente observados in vitro. Este método contribui especificamente para o campo de pesquisa da cílio motile.

Seria difícil para os iniciantes realizarem o passo de desmembranação. Por isso, é altamente recomendável realizar as etapas suavemente, mas com precisão. Comece por centrifugar aproximadamente 10 mililitros de cultura Chlamydomonas reinhardtii a 1.000 RCF a 20 graus Celsius por três minutos.

Decante o supernatante e aspire o remanescente por uma pipeta Pasteur. Resuspenda os precipitados em aproximadamente cinco mililitros de tampão de lavagem. Células centrífugas no tampão de lavagem a 1.000 RCF por três minutos a 20 graus Celsius.

Descarte o supernatante cuidadosamente com uma pipeta. Adicione aproximadamente 0,5 mililitros de tampão de demembranação à pelota celular. Agite o tubo suavemente para suspender as células do buffer e, em seguida, coloque o tubo no gelo.

Suspenda a pelota de célula restante suavemente com uma pipeta e coloque o tubo no gelo novamente. Pegue de 5 a 10 microlitros do modelo celular, diluir dez vezes com o tampão de diluição e observar sob o microscópio para confirmar que todos os modelos celulares estão desmembraados e não nadando. Em um tubo de 0,5 mililitro, misture 80 microliters de solução de reativação, 10 microliters de solução ATP e 10 microliters de modelos celulares tocando no tubo.

Coloque aproximadamente 30 microlitros da solução mista em um escorregador de vidro e coloque delicadamente um deslizamento de tampa sobre ele com espaçadores para evitar um choque mecânico no modelo celular. Observe os modelos celulares reativados sob um microscópio. Após a desmembranação da cultura C.reinhardtii, todos os modelos celulares tornaram-se imotile e a ília demembraada permaneceu presa ao corpo celular, confirmando que a imotilidade dos modelos celulares não foi causada pela desliação.

Depois de misturar os modelos celulares com o tampão de reativação em ATP, mais de 50% dos modelos de células tornaram-se motile. Mesmo sem o sistema de regeneração ATP, as células reativadas continuaram a se mover por aproximadamente 90 minutos com uma concentração final de ATP de um mililitro antes de parar gradualmente. O passo de demembranation é crítico.

Todas as células devem parar de nadar, mas não devem ser misturadas tão fortemente que ocorre a desciliação. Os pesquisadores podem modificar este protocolo para incluir reagentes como íons de cálcio ou AMP cíclico, ou realizar experimentos com um mutante sem uma proteína específica para identificar seu papel biológico.