Name: Reconstituição de Córtices de Actina Mínima Amarrados à Membrana em Bicamadas Lipídicas Suportadas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Aprenda a montar redes de actomiosina ligadas à membrana em bicamadas lipídicas suportadas para estudar dinâmica citoesquelética. Este método permite adição sequencial de proteínas sem perturbar a rede.

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Este trabalho foi apoiado pelo fundo de pesquisa AXA e pelo Programa de Biomedicina Quantitativa Warwick-Wellcome (Wellcome ISSF, RMRCB0058) para DVK, NCBS-TIFR para AB e ST, e a bolsa Wellcome-DBT Margdarshi (IA / M / 15 / 1 / 502018) para SM. A DSK DSK também gostaria de agradecer à Sociedade Biofísica por permitir o evento de rede virtual "Desafios na compreensão de redes citoesqueléticas multicomponentes da molecular à meso-escala", o que contribuiu para a criação dessa coleção de protocolos.

<ol><li>Köster, D. V., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+and+the+plasma+membrane%3A+Inextricably+intertwined%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined.</a> Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).</li>
<li>Rao, M., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+organization+of+membrane+constituents+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active organization of membrane constituents in living cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid+bound+actin+meshwork+organizes+liquid+phase+separation+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes.</a> eLife. 3, 01671(2014).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+relieves+constraints+from+steric+hindrance+in+the+generation+of+compact+actomyosin+asters+at+the+membrane+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex.</a> Science Advances. 6 (11), (2020).</li>
<li>Köster, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+dynamics+drive+local+membrane+component+organization+in+an+in+vitro+active+composite+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+MACs+%28minimal+actin+cortices%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The design of MACs (minimal actin cortices).</a> Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).</li>
<li>Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin arrays.</a> Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).</li>
<li>Mosby, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+filament+dynamics+in+actin+networks+revealed+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).</li>
<li>Seara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+production+rate+is+maximized+in+non-contractile+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin.</a> Nature Communications. 9 (1), 4948(2018).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7, 12615(2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> eLife. 2, 00116(2013).</li>
<li>Ditlev, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composition-dependent+molecular+clutch+between+T+cell+signaling+condensates+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin.</a> eLife. 8, 42695(2019).</li>
<li>Banjade, S., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+of+multivalent+proteins+can+promote+clustering+of+membrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors.</a> eLife. 3, 04123(2014).</li>
<li>Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+membrane+diffusion+modulated+by+a+minimal+actin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex.</a> Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).</li>
<li>Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+domain+organization+by+a+biomimetic+contractile+actomyosin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex.</a> eLife. 6, 24350(2017).</li>
<li>Block, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+at+lipid+membranes%3A+A+comparison+of+hydrodynamic+models+describing+and+experiments+quantifying+diffusion+within+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers.</a> Biomolecules. 8 (2), 30(2018).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Methods+Collection.+In+vitro+reconstitution+of+cytoskeleton+networks+for+biomaterials%2C+biophysics+and+active+matter+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+purification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myosin purification and characterization.</a> Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WH2+and+proline-rich+domains+of+WASP-family+proteins+collaborate+to+accelerate+actin+filament+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).</li>
<li>Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+ezrin+actin+binding+domain+to+probe+its+interaction+with+actin+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro.</a> PLoS One. 10 (4), 0123428(2015).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5, 5412(2014).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
<li>Seu, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+treatment+on+diffusion+and+domain+formation+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+equation+to+extract+diffusion+coefficients+from+confocal+FRAP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data.</a> Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+computational+framework+for+D%28t%29+from+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching+data+reveals+various+anomalous+diffusion+types+in+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes.</a> Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).</li>
<li>Lorén, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+in+material+and+life+sciences%3A+Putting+theory+into+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).</li>
<li>Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+and+control+of+Supported+lipid+bilayer+formation+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy.</a> ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).</li>
<li>Lin, W. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membrane+formation%2C+characterization%2C+functionalization%2C+and+patterning+for+application+in+biological+science+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).</li>
<li>Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers%3A+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li>
<li>Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+supported+membranes+on+topographically+patterned+polymeric+elastomers+and+their+applications+to+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing.</a> Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2022).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e63332(2021).</li>
<li>Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurrell%2C+M+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2022).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Este protocolo apresenta uma plataforma versátil e um ponto de partida para projetar experimentos para estudar a interface membrana-córtex das células. As etapas críticas são a preparação de lâminas de vidro limpas, usando lipídios frescos para a formação eficiente de SUV (ambos afetando a qualidade dos SLBs) e o uso de proteínas de miosina II recém-recicladas para a reorganização dinâmica do filamento de actina. Ao fazer a dinâmica da imagem por um longo período de tempo, é muito importante incorporar um sistema de sequestro de oxigênio (por exemplo, ácido protocatecúico e protocatecuato 3 4-dioxigenase 5,31).
O projeto de câmara aberta permite a adição sequencial de componentes a um sistema existente sem induzir fluxos lipídicos. Isso pode ser uma vantagem importante sobre as abordagens de câmara fechada comumente usadas ou trabalhar usando proteínas encapsuladas dentro de lipossomas36. Efeitos contrários, como a deformação da membrana induzida por proteínas, não podem ser estudados com bicamadas lipídicas adsorvidas em vidro.
As bicamadas lipídicas podem ser formadas com uma ampla gama de composições lipídicas. Inicia-se com a adsorção das vesículas lipídicas à superfície do vidro hidrofílico, seguida de ruptura espontânea da vesícula devido às interações superfície-vesícula e vesícula-vesícula direta ou das vesículas adsorvidas atingindo uma cobertura crítica após a qual uma pequena fração das vesículas se rompe, formando bordas ativas, o que eventualmente leva à formação de duas camadas32 . Além do vidro, vários substratos podem ser utilizados para formar bicamadas lipídicas suportadas, como Mica (por exemplo, para microscopia de força atômica), substratos moles (por exemplo, poli-di-metil-siloxano), almofadas poliméricas33,34,35, abrangendo entre orifícios de grades de microscopia eletrônica 14. As bicamadas de interface de gotículas são outro método interessante para criar bicamadas lipídicas estáveise independentes 36. A inclusão de redes de acto-miosina em vesículas ou emulsões é um método muito poderoso para estudar esse sistema mínimo em uma geometria semelhante a uma célula37,38, e que é descrito em detalhes em outro lugar 39.

A membrana plasmática de uma célula animal viva interage constantemente com o citoesqueleto de actina adjacente e, juntas, formam um material compósito ativo que cumpre uma infinidade de funções celulares 1,2. Para estudar os processos nesta interface membrana lipídica-actina, a reconstituição de redes citoesqueléticas em cima de bicamadas lipídicas suportadas (SLBs) provou ser muito útil. Esta abordagem de sistema mínimo permite o controle preciso dos componentes da rede do citoesqueleto e da composição lipídica. Em comparação com as membranas lipídicas independentes das vesículas unilamelares gigantes, a geometria planar dos SLBs permite o uso eficiente de técnicas de microscopia de última geração, como super-resolução3,4, fluorescência de reflexão interna total (TIRF)5,6,7 ou espalhamento interferométrico 8 estudar a organização espacial e a dinâmica das redes citoesqueléticas. O TIRF fornece o maior contraste para componentes marcados fluorescentemente, uma vez que o sinal de moléculas marcadas não ligadas na solução que contribuem para o sinal de fundo é mínimo.
Aqui, descrevemos um protocolo básico para a formação de redes de actomiosina amarradas a bicamadas lipídicas suportadas, que são amplamente utilizadas em campo para estudar a física de redes ativas, quase-2D 9,10,11 e seu efeito na organização da membrana 3,5,12,13,14,15,16 (Figura 1 ). Esta abordagem não se limita a redes baseadas em actina, mas também pode ser adaptada facilmente para explorar microtúbulos, filamentos intermediários ou redes compostas de natureza mista e para estudar uma variedade de interações entre proteínas da membrana lipídica e componentes citoesqueléticos usando métodos de microscopia sensíveis à superfície.
Para manter este protocolo focado, excluímos uma descrição detalhada da purificação e marcação das proteínas actina e miosina ou detalhes sobre como sintonizar e controlar a contratilidade e organização das redes de actomiosina. Deve-se referir a outros protocolos que são publicados ao lado deste na JoVE Methods Collection, In Vitro Reconstitution of Cytoskeleton Networks for Biomaterials, Biophysics and Active Matter Research17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig01.jpg"> Figura 1: Esquema do sistema composto ativo de membrana de actina in vitro . Criado com Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>1,2 dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- (lissamina rodamina B sulfonil)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158</td><td>16:0 RhoPE</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3- [(N-(5-amino-1 carboxipentil) ácido iminodiacético) succinil] (sal de níquel)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td>DGS-NTA-Ni2+</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td>DOPC</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355</td><td>DPPC</td></tr><tr><td>Frascos de vidro âmbar</td><td>ThermoFisher</td><td>B7990-2A</td><td></td></tr><tr><td>ATP sal dissódico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Câmara celular Attofluor</td><td>ThermoFisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador de banho</td><td>GT Sonic</td><td>1860QTS</td><td></td></tr><tr><td>beta-caseína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>12135</td><td></td></tr><tr><td>clorofórmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td>alternativamente da Electron Microscopy Sciences, 50980296</td></tr><tr><td>Lamínulas, #1, 25 mm de diâmetro, Selo Dourado</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-0705B</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas, #1, 40x22 mm, Selo Dourado</td><td>ThermoFisher</td><td>48404-031</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>G12635</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Himedia</td><td>MB130</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de vidro à prova de gás, com agulha removebla, romba, volumes 10 &micro; L, 100 &micro; L, 500 e micro; L</td><td>Hammilton</td> série <td></td><td>1700</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma Analytics</td><td>Z805939</td><td>solução de limpeza</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Himedia</td><td>RM380</td><td></td></tr><tr><td>KaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G13405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ThermoFisher</td><td>G13305</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G26708</td><td></td></tr><tr><td>Extrusora de lipídios</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>61000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>G15535</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator Microtip</td><td>Sonics</td><td>VC750</td><td>3 mm Diâmetro da ponta</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>ThermoFisher</td><td>G15955</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Himedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G15825</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G27815</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti Eclipse Microscópio TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td>Com uma unidade TIRF conectada por meio de uma fibra óptica de conservação de polarização a um combinador de laser monolítico Agilent MLC400 com várias linhas de laser com uma objetiva de óleo Nikon de 100X, 1,45 NA com duas câmeras EMCCD de 512 x 512 pixels (Photometrics Evolve 512) com uma objetiva de óleo Nikon de 100X, 1,45 NA com duas câmeras EMCCD de 512 x 512 pixels (Photometrics Evolve 512)</td></tr><tr><td>NOA88</td><td>Norland Products</td><td>8801</td><td></td></tr><tr><td>Pinça revestida com PTFE Style #2A</td><td>Structure Probe</td><td>0S2AT-XD</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>ThermoFisher</td><td>G15925</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador UV</td><td>Novascan</td><td>PSD PRO-UV</td><td>precisa de vácuo e fornecimento de O2</td></tr></tbody></table>

reconstituição de córtices de actina mínima amarrados à membrana em bicamadas lipídicas suportadas

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

A superfície de uma célula viva fornece uma plataforma ativa versátil para numerosos processos celulares, que surgem da interação da membrana plasmática com o córtex de actina subjacente. Nas últimas décadas, sistemas mínimos reconstituídos baseados em bicamadas lipídicas suportadas em combinação com redes de filamentos de actina provaram ser muito instrumentais no desvendamento de mecanismos básicos e consequências de redes de actina amarradas à membrana, bem como no estudo das funções de proteínas individuais associadas à membrana. Aqui, descrevemos como reconstituir tais sistemas compostos ativos in vitro que consistem em bicamadas lipídicas suportadas por fluidos acopladas via proteínas de ligação à actina associadas à membrana a filamentos dinâmicos de actina e motores de miosina que podem ser prontamente observados através de microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Um projeto de câmara aberta permite montar o sistema de maneira passo a passo e controlar sistematicamente muitos parâmetros, como concentração de proteína ligadora, concentração de actina, comprimento do filamento de actina, relação actina/miosina, bem como níveis de ATP. Finalmente, discutimos como controlar a qualidade do sistema, como detectar e solucionar problemas comuns e algumas limitações desse sistema em comparação com a superfície celular viva.

Para representação, aqui é mostrado um perfil típico de pós-bláspero da 1ª imagem após o fotobranqueamento (imagem em t = 0 s na Figura 3A) e seu ajuste à seguinte função28 (ver Figura 6A):
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq04.jpg" style="margin: auto;">
O valor de r e (23,94 μm) calculado pelo ajuste a esta curva é muito semelhante ao r e calculado no passo 2.8.4. (23,24 μm). Aqui, K é um parâmetro de profundidade de água sanitária que pode ser estimado diretamente a partir de F0 (descrito na etapa 2.8.4.). Da mesma forma, a Figura 6B mostra o perfil de recuperação e seu ajuste à seguinte função28:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq05.jpg" style="margin: auto;">
Encontramos o valor ajustado do coeficiente de difusão como sendo 1,34 μm 2/s, um valor que concorda estreitamente com o valor de 1,39 μm 2/s que é calculado pela fórmula na etapa2.8.4. Aqui, MF representa a fração móvel da bicamada lipídica que representa a fração da população branqueada que se recupera de volta. A mobilidade das moléculas ancoradas em lipídios depende, é claro, da composição lipídica e de seu estado físico (fase líquida ou gel). Para nossos experimentos usando membranas lipídicas à base de DOPC, a mobilidade deve ser &gt;1 μm2/s, e a fração móvel não deve ser inferior a 0,9 para indicar uma boa bicamada lipídica. Recomendamos o uso do método manual sem encaixe para um teste rápido da qualidade e mobilidade da bicamada. O método de ajuste pode ser útil ao automatizar a análise para muitas curvas FRAP. Além disso, se alguém quiser realizar um experimento FRAP mais sofisticado para caracterizar sistematicamente a difusão no sistema, recomendamos ao leitor esta revisão de Lorén et al.30 para obter mais detalhes sobre modelos de ajuste e possíveis armadilhas no delineamento experimental.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig06.jpg"> Figura 6: Quantificação do coeficiente de difusão das bicamadas lipídicas. (A) Perfil da linha da primeira imagem após o fotobranqueamento (t = 0 s na Figura 3A) e seu ajuste à equação 4 para calcular o raio efetivo de alvejante. (B) O perfil de recuperação da região branqueada e seu ajuste à equação 5 para cálculo do coeficiente de difusão e fração móvel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig06large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Um resultado típico dos experimentos descritos acima, mostrando a montagem dinâmica e a organização de uma rede de acto-miosina ligada em uma bicamada lipídica suportada por microscopia TIRF, é representado na Figura 7 e no Vídeo Suplementar S1.
A Figura 7 mostra uma montagem de imagem da proteína ligadora, F-actina e miosina-II.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig07.jpg"> Figura 7: Os fluxos contráteis de actomiosina conduzem ao agrupamento local da proteína ligadora membrana-actina HYE. Instantâneos TIRF de HYE (marcados com YFP), filamentos de actina (marcados com maleimida de Atto-635) e filamentos de miosina II (marcados com maleimida de Atto-565) após a adição de miosina II a um SLB contendo HYE e F-actina. O tempo é indicado no topo: 0 min é imediatamente antes que os miofilamentos fluorescentes comecem a aparecer no campo TIRF. HYE e F-actina são distribuídos homogeneamente sobre a bicamada lipídica antes da adição de miosina (0 min). A atividade da miosina induz fluxos contráteis de actomiosina, que emergem em estruturas semelhantes a aster no estado estacionário (15 min), levando ao agrupamento local do componente de membrana acoplado (HYE). A linha mais baixa é uma fusão de imagens de actina (amarelo) e miosina II (magenta) mostrando a organização da actina e miosina em diferentes pontos de tempo. As imagens usadas na confecção dessas montagens foram corrigidas em Fiji para sinal de fundo, padrões de intensidade não uniformes e movimento de translação. Barra de escala = 10 μm. Para obter detalhes, consulte Vídeo suplementar S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig07large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome do buffer</td>
			<td colspan="2">Composição</td>
		</tr><tr><td>Tampão de Reidratação Lipídica</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% de sacarose, pH 7,5</td>
		</tr><tr><td>Buffer de formação SLB</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6</td>
		</tr><tr><td>Buffer de armazenamento SLB</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Tampão de diluição de proteínas</td>
			<td colspan="2">20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1mM TCEP ou TDT, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>1X ME ou buffer de troca iônica Actin</td>
			<td colspan="2">50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (armazenar a 4°C)</td>
		</tr><tr><td>1X KMEH ou tampão de polimerização Actin</td>
			<td colspan="2">50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Estoque de ATP de 100 mM</td>
			<td colspan="2">Sal dissódico ATP de 100 mM, Tris de 50 mM, NaCl de 50 mM, MgCl2 de 5 mM, EGTA de 2 mM, pH 7,5 (armazenar a -20°C)</td>
		</tr><tr><td>2x buffer de destino</td>
			<td colspan="2">2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2mM ATP, 5mM TCEP (armazenado a 4°C)</td>
		</tr><tr><td>G-buffer</td>
			<td colspan="2">2 mM Tris, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04 % NaN3, pH 8 (armazenar a 4°C)</td>
		</tr><tr><td>Tampão de miosina II</td>
			<td colspan="2">500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7,0</td>
		</tr><tr><td>Tampão de cromatografia por filtração em gel</td>
			<td colspan="2">50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1% Tween-20, pH 7,5</td>
		</tr><tr><td>Tampando o tampão de armazenamento de proteína</td>
			<td colspan="2">Tris de 10 mM· Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5, 20% de glicerol</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Lista de composições de buffer usadas neste protocolo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Problemas comuns e sua solução de problemas</td>
			<td>Problema</td>
			<td colspan="4">Causa</td>
			<td colspan="4">Soluções possíveis</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>A bicamada lipídica não apresenta difusão</td>
			<td colspan="4">A causa mais provável para este problema é o vidro de cobertura sujo que pode acontecer quando a solução de limpeza é envelhecida ou o aquecimento não ocorreu durante a sonicação do banho. Essas bicamadas têm uma aparência "vesicular" porque as vesículas estouradas aderem ao vidro da tampa, mas não se fundem umas com as outras. Usar MLVs com mais de 6 semanas ou SUVs com mais de 6 dias, ou adicionar baixas quantidades de SUVs também pode levar à formação de bicamadas vesiculares.</td>
			<td colspan="4">Use uma solução de limpeza fresca. Certifique-se de que o aquecedor está ligado e a temperatura está entre 45-65°C. Use misturas lipídicas frescas. (O uso de uma sonda lipídica fluorescente versus uma sonda de proteína fluorescente às vezes pode se manifestar de forma diferente. Por exemplo, se a bicamada tiver defeitos de subdifração e a etapa de passivação superficial for ignorada (ou não funcionar), a sonda lipídica mostrará uma distribuição de intensidade uniforme, mas a sonda de proteína fluorescente poderá exibir pontos fluorescentes brilhantes.)</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>A bicamada lipídica tem manchas brilhantes</td>
			<td colspan="4">A incubação longa de SUVs para a formação de bicamadas pode criar uma bicamada lipídica que é difusora em geral, mas com manchas brilhantes ocasionais. Essas manchas podem ser bicamadas de várias camadas que podem atrair grandes quantidades de sonda fluorescente.</td>
			<td colspan="4">15-20 min de incubação com SUVs é suficiente. Certifique-se de que a sonda não está se agregando: um giro rápido e duro da proteína do ligador (300 x g por 15 min a 4 °C) pode remover os agregados</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>A bicamada lipídica tem buracos escuros</td>
			<td colspan="4">Isso acontece quando a bicamada é feita de SUVs antigos e fotografada por horas prolongadas (&gt; 4 horas após a formação), ou o pH da solução muda drasticamente devido a imagens prolongadas (por exemplo, no estado ATP alto e na presença de certos sequestradores de oxigênio), ou quando a superfície é passivada em excesso com beta-caseína (adicionando muita beta-caseína por mais de 10-15 minutos e ou não lavando-a).</td>
			<td colspan="4">Use lipídios frescos. Reduza a taxa de quadros de imagem ou o tempo efetivo de iluminação a laser. Use buffers com maior capacidade de buffering.</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>Bicamada lipídica apresenta difusão lenta</td>
			<td colspan="4">Bicamadas lipídicas com alta porcentagem de colesterol, lipídios saturados longos ou lipídios carregados difundem-se mais lentamente.</td>
			<td colspan="4">Nesses casos, prepare sua amostra a uma temperatura alta. Pode-se também usar uma composição lipídica simples e testada como controle, juntamente com composições lipídicas complexas e não testadas. Certifique-se de que o vidro está limpo.</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>A actina não polimeriza</td>
			<td colspan="4">O tampão alvo é antigo, o estoque de G-actina é muito antigo, o antigo e o novo G-actina foram copolimerizados.</td>
			<td colspan="4">Certifique-se de que o Ca 2+ é substituído por Mg2+ antes da polimerização (usando o tampão ME). Use ATP-Mg2+ fresco estoque. Use G-actina recém-reciclada. Certifique-se de que a concentração de F-actina (em termos de G-actina) adicionada à bicamada é superior a 0,2 μM. Para concentrações mais baixas, use faloidina estabilizada F-actina.</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>A actina não se liga à bicamada</td>
			<td colspan="4">O ligador membrana-actina não é adicionado ou adicionado em concentração muito baixa – isso pode ser inferido a partir da fluorescência da proteína ligadora. Se a fluorescência for decente, o ligador membrana-actina perdeu a capacidade de ligação à actina. Além disso, se a proteína ligadora não estiver especificamente ligada à superfície do vidro (quando a bicamada é ruim), ela pode não recrutar filamentos de actina.</td>
			<td colspan="4">Certifique-se de que a bicamada está se difundindo. Use proteína de ligação fresca</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>O sinal fluorescente de acetina F é fraco</td>
			<td colspan="4">A proporção de actina rotulada para actina escura é muito baixa. Ou a actina rotulada ou a actina não marcada é muito antiga e eles não estão copolimerizando uns com os outros.</td>
			<td colspan="4">Recicle a actina novamente e tente novamente a eloirização com actina recém-reciclada. O fotodano pode destruir ou despolimerizar a F-actina; se possível, use corantes vermelhos ou vermelhos para actina (e miosina).</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>A miosina não mostra contratilidade</td>
			<td colspan="4">pode-se observar que, após a adição de ATP ao sistema infundido com miosina, não há contratilidade da actomiosina.</td>
			<td colspan="4">Verifique se a concentração de miosina ou o nível de pureza é bom. Use miosina recém-reciclada (use dentro de 6 semanas após a reciclagem). Adicionar ATP fresco à mistura de miosina pode ajudar. Desgaseificação de buffers e uso de sequestradores de oxigênio, etc. pode reduzir o fotodano dos motores.  Mais informações podem ser encontradas nos protocolos de Plastino et al. ou Stam et al. da mesma coleção de métodos</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>Coverglass não é hidrofílico</td>
			<td colspan="4">O vidro da tampa não é limpo corretamente.</td>
			<td colspan="4">O vidro de cobertura hidrofílico limpo é crucial para a formação de bicamadas lipídicas. Uma leitura útil e visual da hidrofilicidade do vidro de cobertura após o protocolo de limpeza é observar a umectação do copo pela água. Adicione um pequeno volume de água a uma tampa plana. A água permanecerá na forma de uma gota redonda se a tampa não for limpa corretamente. No entanto, o mesmo volume de água se espalhará e formará uma camada fina, em uma coberta hidrofílica tratada. Este comportamento de umectação da água na superfície do vidro de cobertura pode ser usado para verificar se as etapas de limpeza com a solução de limpeza / NaOH funcionaram.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Guia de solução de problemas resumindo problemas comuns e soluções correspondentes. 
Vídeo Suplementar S1: Os fluxos de actomiosina contrátil conduzem o agrupamento local da proteína ligadora membrana-actina HYE. Timelapse TIRF de HYE (marcado com YFP), filamentos de actina (marcados com maleimida de Atto-635) e filamentos de miosina II (marcados com maleimida de Atto-565) após a adição de miosina II a um SLB contendo HYE e F-actina. O tempo é indicado no topo: 0 min é imediatamente antes que os miofilamentos fluorescentes comecem a aparecer no campo TIRF. Barra de escala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/S1Movie_Act_myo_Hye_merge_timestamp_15fps.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Este protocolo descreve a formação de bicamadas lipídicas suportadas e a adição de filamentos citoesqueléticos e proteínas motoras para estudar a dinâmica de redes citoesqueléticas reconstituídas e ligadas à membrana usando microscopia de fluorescência.

Reconstituição de Córtices de Actina Mínima Amarrados à Membrana em Bicamadas Lipídicas Suportadas

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Aqui, demonstramos um procedimento relativamente simples e direto para montar redes de actomiosina amarradas à membrana e estudar a dinâmica usando técnicas microscópicas de luz avançadas. A principal vantagem é que nosso ensaio permite a adição sequencial de proteínas e pequenas moléculas sem perturbar as redes ligadas à membrana. Este método pode ser facilmente adaptado para estudar outras proteínas citoesqueléticas ou redes compostas.A parte mais crítica do protocolo é garantir que a bicamada lipídica suportada seja formada corretamente, então, primeiro, tivemos que dominar essa etapa antes de começar a adicionar as proteínas do citoesqueleto. Para começar, pegue de três a cinco tampas de vidro retangulares e coloque-as dentro de um frasco de coplin. Ligue o sonicator de banho e defina a temperatura para 65 graus Celsius.Encha o frasco de coplin com uma solução de limpeza a 2% para submergir totalmente as tampas e coloque-o no sonicator durante 30 minutos em modo de pulso máximo. Use pinças revestidas de PTFE contundentes para remover as tampas uma a uma. Lave-os bem com água destilada e coloque-os em outro frasco de coplin cheio de dois hidróxidos de sódio normais.Sonicate as tampas por 20 minutos no modo de pulso completo. Retire as tampas, enxágue bem com água destilada e coloque em outro frasco de coplin cheio de água destilada. Antes de iniciar o experimento, pegue o frasco em um exaustor químico equipado com um suprimento de gás nitrogênio.Use luvas e pinças para remover as tampas para secá-las sob a corrente de nitrogênio. Seque ambos os lados e coloque-os em uma grade de plástico limpa com uma tampa. Coloque a caixa com as tampas em um exsicador para evitar o contato com partículas de poeira, em seguida, pegue tubos de PCR autoclavados e corte suas tampas e metades cônicas inferiores com uma lâmina cirúrgica afiada.Pegue os tubos cilíndricos semicortados, aplique adesivo curável UV na borda lisa de cada tubo de corte e coloque-o invertido em uma tampa recém-limpa, de modo que o aro fique plano no deslizamento da tampa. Não mova o cilindro lateralmente depois de posicionado na tampa para garantir que a cola não se derrame no espaço central da câmara. Coloque as tampas do rolamento da câmara dentro de um limpador de ozônio UV com um suprimento de oxigênio e aspirador.Ligue a luz UV e acenda por três a cinco minutos para permitir que o adesivo polimerize. Retire as tampas e teste as câmaras quanto a vazamentos e descarte as câmaras com vazamento. Lave cada câmara com tampão de formação SLB, deixando 100 microlitros de tampão no final.Marque o nível do tampão em 100 microlitros com um marcador permanente, em seguida, adicione dois microlitros de cloreto de cálcio molar 0,1 à câmara, seguido por oito microlitros da solução SUV a cada câmara e incube por 15 minutos a 25 graus Celsius. Remova 50 microlitros do tampão de formação SLB, deixando apenas 50 microlitros na câmara de amostra, em seguida, adicione 100 microlitros de um XKMEH à câmara e misture suavemente. Remova 100 microlitros do buffer sem tocar no fundo.Repita as lavagens oito a 10 vezes, adicionando 100 microlitros de um XKMEH e removendo 100 microlitros. Adicione 10 microlitros de um miligrama por mililitro de beta-caseína à bicamada, misture suavemente e incube por cinco a 10 minutos à temperatura ambiente. Lave a beta-caseína três vezes com um XKMEH e traga o nível do tampão de volta à marca de 100 microlitros.Durante a incubação da beta-caseína, retire uma alíquota da proteína ligadora membrana-actina por menos 80 graus Celsius descongelada rapidamente a 37 graus Celsius e, em seguida, mantenha-a no gelo. Diluir a alíquota com tampão de diluição proteica até uma concentração de um micromolar. Adicionar a proteína ligadora à solução a uma concentração final definida e misturar suavemente.Incubar durante 30 a 40 minutos à temperatura ambiente e lavar três a cinco vezes com um tampão XKMEH para remover a proteína HSE não ligada. Traga o nível de buffer em cada câmara de volta para a marca de 100 microlitros. A amostra agora está pronta para geração de imagens.Ligue o microscópio, os lasers de excitação e as câmeras de detecção. Certifique-se de que o laser esteja alinhado, a objetiva esteja limpa e o software esteja pronto para adquirir imagens. Coloque o óleo na objetiva 100 vezes, monte a amostra no estágio do microscópio e concentre a objetiva na bicamada.Certifique-se de que a posição do laser seja tal que sofra uma reflexão interna total na amostra. Use uma excitação de 488 nanômetros. Para determinar a integridade da bicamada, execute um ensaio rápido de FRAP selecionando uma região de interesse na bicamada e gravando algumas imagens do campo de visão usando condições de imagem que forneçam uma relação sinal-ruído de cinco para um ou superior.Pause a gravação e feche o diafragma de campo do microscópio TIRF para focar um feixe de laser concentrado em uma pequena região circular da bicamada para branquear localmente os fluoróforos. Ligue o laser até sua saída máxima para branquear a pequena região por três a 10 segundos e, em seguida, desligue o laser. Reabra o diafragma de campo ao seu raio original, reajuste a condição de imagem de volta às configurações pré-alvejante e retome imediatamente a gravação da recuperação do sinal fluorescente no campo de visão.Verifique se a bicamada é fluida e salve as imagens como arquivos TIF de 16 bits de pontos. Misture a G-actina não marcada e fluorescentemente marcada em uma proporção molar de 10 para um e complemente-a com G-buffer para que a concentração de G-actina seja de 20 micromolares. Adicione um décimo de 10 vezes o tampão ME à mistura para uma solução única e incube por dois minutos à temperatura ambiente.Em seguida, descongele o frasco para injetáveis de proteína de tampa rapidamente a 37 graus Celsius e, em seguida, mantenha-o no gelo. Diluir com tamponamentos G de tal forma que a concentração de proteína de cobertura seja agora o dobro da concentração final desejada e, em seguida, adicionar um volume igual da solução de proteína de cobertura diluída à mistura de actina. Finalmente, adicione um volume igual de tampão fresco de duas vezes alvo à mistura de reação.O volume final da solução deve ser quatro vezes o volume da mistura de actina. Certifique-se de que a concentração final de componentes seja a descrita no manuscrito do texto. Incubar as amostras no escuro a 25 graus Celsius por 45 a 60 minutos para permitir a polimerização.Pipete suavemente cinco actina micromolar polimerizada com uma ponta de pipeta de extremidade romba e adicione-a a um tubo de PCR autoclavado limpo. Adicione um XKMEH ao tubo para tornar o volume final superior a 20 microlitros e misture suavemente para evitar o cisalhamento da actina F. Da câmara de amostra montada, remova um volume igual do buffer.Adicione a solução de actina polimerizada à câmara e pipete suavemente para cima e para baixo três vezes sem tocar na bicamada no fundo. Monte a amostra no microscópio TIRF e deixe descansar por 20 a 30 minutos. Grave algumas imagens de diferentes campos de visão após a adição de actina F ter atingido um estado estacionário.Após 30 minutos de incubação da actina, monte a amostra de volta ao microscópio. Verifique o sinal na proteína ligadora e nos canais de actina F. Ajuste as condições de imagem, se necessário.Selecione uma boa região para uma gravação de longo lapso de tempo. Grave de 10 a 15 quadros a 0,1 a 0,2 hertz antes da adição de miosina e pause a gravação. Pipetar o volume necessário de miosina muscular reciclada dois do frasco para injetáveis de estoque com uma ponta de pipeta de extremidade romba e adicionar a um tubo de PCR autoclavado limpo.Adicione imediatamente um XKMEH ao tubo para tornar o volume superior a 20 microlitros e misture suavemente. Remova cuidadosamente um volume igual do tampão KMEH da câmara de amostra montada sem perturbá-la e adicione suavemente a solução de miosina à câmara de amostra. Não pipete para cima e para baixo, pois isso perturbará os filamentos ligados à superfície.Retome imediatamente a gravação de lapso de tempo e salve todas as imagens e, em seguida, tire imagens de fundo para todos os canais usando apenas uma amostra de buffer. Salve todas as imagens como arquivos TIF. O valor ajustado do coeficiente de difusão foi de 1,34 micrômetros quadrados por segundo, o que concordou estreitamente com o valor calculado baseado em fórmula de 1,39 micrômetros quadrados por segundo.O perfil da linha após o fotobranqueamento e o perfil de recuperação da região branqueada se ajustam às equações quatro e cinco, respectivamente. A fração móvel da bicamada lipídica representando a fração da população branqueada que se recupera foi maior que 0,9, indicando uma boa bicamada lipídica. A atividade da miosina induziu fluxos contráteis de actomiosina que emergiram em estruturas astro-like no estado estacionário, conduzindo o agrupamento local do componente da membrana acoplada.Pode-se usar uma variedade de técnicas de microscopia, como a microscopia de espalhamento interferométrico para estudar a dinâmica de redes de actomiosina não marcadas sem induzir qualquer dano fotográfico, ou usar microscopia de fluorescência de super resolução. Esta técnica abre o caminho para os pesquisadores interessados em entender como os complexos proteicos de membrana interagem com uma rede dinâmica de actomiosina para modular sua arquitetura e composição.

reconstitution-membrane-tethered-minimal-actin-cortices-on-supported

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrevemos um protocolo para preparação de bicamadas lipídicas suportadas e sua caracterização usando microscopia de força atômica e espectroscopia de força.

Projeção de imagem atômica e força Espectroscopia de Bicamadas Lipídicas suportados

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar eventos individuais, mediada por SNARE fusão entre lipossomas e bicamadas suportados em canais microfluídicos usando TIRFM polarizada, com sensibilidade única molécula e ~ 15 resolução de tempo ms. Lipídico e liberação de cargas solúveis podem ser detectados simultaneamente. o tamanho do lipossoma, de difusividade lípido, e propriedades de fusão dos poros são medidos.

Fusão SNARE mediada por uma única proteolipossomos com Bicamadas suportados Tethered em uma célula Microfluidic fluxo monitorado por polarizada TIRF microscopia

Este artigo descreve um método para avaliar as interações e montagens de proteínas integrais de membrana in vitro com vários fatores parceiros em um ambiente lipídico-proximal.

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal In Vitro

Nós fornecemos um protocolo para in vitro ensaios de auto-organização da mente e da minha em uma bicamada lipídica suportados numa câmara aberta. Além disso, descrevemos como delimitar o ensaio em lipídios-folheados microcompartments PDMS para imitar as condições na vivo por confinamento de reação.

In Vitro Reconstituição de auto-organização padrões de proteína na Bilayers do Lipid suportados

A fusão mitocondrial é uma importante reação homeostática subjacente à dinâmica mitocondrial. Descrito aqui é um sistema de reconstituição in vitro para estudar a fusão mitocondrial de membrana interna que pode resolver amarração de membrana, acoplamento, hemifusão e abertura de poros. Discute-se a versatilidade dessa abordagem na exploração de sistemas de membrana celular.

Uma plataforma de membrana modelo para reconstituir a dinâmica da membrana mitocondrial

Este protocolo descreve a formação de células imitando vesículas uni-lipídicas e multi-lipídicas, bicamadas lipídicas suportadas e bicamadas lipídicas suspensas. Estes modelos in vitro podem ser adaptados para incorporar uma variedade de tipos lipídes e podem ser usados para investigar várias interações de moléculas e macromoléculas.

Montagem de Modelos de Bicamadas lipídicas apoiadas e suspensas para o estudo de interações moleculares

Este artigo introduz um método simples para a produção rápida de vesículas unilamellar gigantes com proteínas citoesqueletal encapsuladas. O método se mostra útil para a reconstituição de estruturas citoesqueletal em interações de confinamento e citoesqueleto-membrana.

Encapsulamento rápido do Citoesqueleto Reconstituído Dentro de Vesículos Unilamellar Gigantes

Neste manuscrito, demonstramos as técnicas experimentais para encapsular o citoesqueleto F-actin em vesículas lipídicas unilamellar gigantes (também chamadas lipossomos), e o método para formar uma camada de F-actin de córtex biomimicing no folheto interno da membrana lipossosome.

In vitro Reconstituição do Actin Cytoskeleton Dentro de Vesículos Gigantes Unilamellar

Este protocolo é um guia para visualizar actina dinâmica e microtúbulos usando um ensaio de microscopia de fluorescência interna total in vitro (TIRF).

Visualizando a dinâmica de acoplamento de actina e microtúbula in vitro por microscopia de fluorescência interna total (TIRF)

A reconstituição livre de células tem sido uma ferramenta fundamental para entender a montagem do citoesqueleto, e o trabalho na última década estabeleceu abordagens para estudar a dinâmica dos septins em sistemas mínimos. Aqui apresentados estão três métodos complementares para observar a montagem de septina em diferentes contextos de membrana: bicamadas planares, suportes esféricos e suportes de hastes.

Reconstituição da Assembleia septina em membranas para estudar propriedades e funções biofísicas

Aqui, apresentamos métodos para preparar conjuntos de actina emaranhados, reticulados e de cristal líquido quase bidimensionais (2D) a partir de proteínas purificadas.

Ajustando os modos de contratilidade e deformação de conjuntos ativos baseados em actina in vitro: de redes ativas bidimensionais a gotas de cristal líquido

Aprenda a montar redes de actomiosina ligadas à membrana em bicamadas lipídicas suportadas para estudar dinâmica citoesquelética. Este método permite adição sequencial de proteínas sem perturbar a rede.

Reconstituição de Córtices de Actina Mínima Amarrados à Membrana em Bicamadas Lipídicas Suportadas

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