Name: In vivo Detecção de Permeabilidade Vascular em Glândula Submandibular de Camundongo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda a detectar permeabilidade vascular em glândulas submandibulares de camundongo usando microscopia confocal de varredura a laser de dois fótons. Este método avalia a função das junções endoteliais em modelos animais.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (bolsas 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 e 81974151) e pela Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7202082 de subsídios).

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Pequim e cumpriram o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publication No. 85-23, revisado em 1996). Camundongos machos do tipo selvagem (WT) na faixa etária de 8-10 semanas foram utilizados para o presente estudo. Os animais experimentais foram cuidadosamente tratados para minimizar sua dor e desconforto.
1. Procedimentos para animais
<ol><li>Preparar e administrar os anestésicos e traçadores.<ol><li>Manter condições estéreis durante todo o estudo e esterilizar os instrumentos por autoclavagem. Divida os ratos em dois grupos. NOTA: O grupo controle não foi tratado, e o outro grupo com ligadura unilateral do ducto SMG por 1 dia serviu como grupo experimental. Ao agrupar, camundongos com peso corporal e idade semelhantes precisam ser selecionados para reduzir a influência do peso e da idade na permeabilidade vascular.</li>
		<li>Escolha traçadores apropriados, como o dextrano marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (peso molecular: 4 kDa; FD4) e dextrano marcado com rodamina B (peso molecular: 70 kDa; RD70) (ver Tabela de Materiais) com espectros distintos de excitação/emissão para minimizar a interferência entre os sinais de fluorescência (usando o filtro FITC ou rodamina B, respectivamente) para o ensaio de permeabilidade. NOTA: Os comprimentos de onda de excitação de FD4 e RD70 são de 488 nm e 594 nm, respectivamente, e os comprimentos de onda de emissão selecionados são 511-564 nm e 617-669 nm, respectivamente.</li>
		<li>Diluir os marcadores em solução salina estéril tamponada com fosfato (1x PBS) em reservas de 100 mg/ml e armazenar as alíquotas protegidas da luz a -20 °C. NOTA: Dextran com um peso molecular como 4 kDa vazará rapidamente do sangue em SMGs de camundongos, mesmo sem condições patológicas10.</li>
		<li>Por via intraperitoneal, injete o tribromoetanol (a dose para um rato de 25 g foi de cerca de 600 μL) para anestesiar os ratinhos. Fornecer analgesia conforme recomendado pelo comitê de ética animal local. NOTA: Após a indução da anestesia, use pomada veterinária nos olhos para evitar a secura. Cuide bem dos animais11. Aguarde até que o rato tolere a estimulação mecânica, por exemplo, beliscar o dedo do pé sem resposta motora.</li>
		<li>Injetar uma mistura de dois traçadores de permeabilidade paracelular com diferentes pesos moleculares (FD4 e RD70) na veia angular (0,5 mg/g de peso corporal). Injectar cada rato com uma mistura de solução traçadora de 100 μL, com 50 μL de cada corante misturado numa proporção de 1:1.<ol><li>Após a anestesia, segure suavemente a cabeça e o pescoço do rato para fazer com que um lado do globo ocular se projete ligeiramente. Insira uma seringa de insulina contendo marcadores fluorescentes (tenha cuidado para não introduzir ar na seringa) ao longo do canto do olho em ângulo reto com o olho. NOTA: Se a veia angular for inserida corretamente, a solução de corante será facilmente injetada na veia e não haverá resistência durante a injeção. Além disso, a injeção de veia caudal em camundongos também pode ser candidata a moléculas traçadoras intravenosas.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Execute o isolamento SMG seguindo as etapas abaixo. NOTA: Use ferramentas estéreis, incluindo tesouras de tecido e níquel de separação, para a cirurgia.<ol><li>Separe uma glândula unilateral cuidadosamente para não danificar os vasos sanguíneos e nervos circundantes sob um microscópio estereoscópico.<ol><li>Após a injeção de traçadores de permeabilidade paracelular, coloque rapidamente os ratos no papelão e coloque-os em decúbito dorsal com seus membros e cabeças adesivados. Aplique creme de depilação na pele do pescoço para remover o pelo do rato. Use etanol a 75% para desinfetar a pele antes da cirurgia.</li>
			<li>Em seguida, sob um estereomicroscópio, corte a epiderme do pescoço com tesoura de tecido geral para expor ambos os lados dos SMGs (a glândula direita foi tratada neste experimento). Em seguida, use um níquel de separação de tecido contundente (consulte Tabela de Materiais) para separar suavemente a cápsula da superfície da glândula, tomando cuidado para não danificar o tecido da glândula e os vasos sanguíneos.</li>
			<li>Separe a cápsula da superfície da glândula sem danificar a estrutura glandular. Além disso, certifique-se de que todo o processo de contenção do rato e separação da glândula seja realizado dentro de 10 minutos.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Configuração do microscópio de dois fótons
<ol><li>Conecte o suporte personalizado ao dispositivo de pressão negativa e verifique se o efeito de pressão negativa é adequadamente alcançado com antecedência. NOTA: O suporte tem a forma de uma lupa em miniatura com um pedaço plano de vidro redondo no centro (diâmetro: 4,32 mm, Figura 1). O dispositivo de pressão negativa foi projetado internamente de tal forma que o suporte é conectado a um tubo de borracha, que é ligado a uma garrafa de drenagem, e a garrafa é anexada ao controlador de pressão negativa através de um tubo de borracha curto. Desta forma, o controlador de pressão negativa pode ajustar a pressão para garantir que o tecido seja sugado para dentro do suporte.<ol><li>Ligue um lado do suporte ao dispositivo de pressão negativa. Para testar se o dispositivo de pressão negativa está intacto e apropriado, vire o suporte de cabeça para baixo, adicione uma gota de água e defina o valor de pressão negativa para 20 unidades. Se a água for completa e rapidamente sugada, o dispositivo de pressão negativa é instalado com sucesso com o suporte.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque suavemente o SMG exposto do rato no suporte personalizado e sugue o tecido por sucção por pressão negativa o mais longe possível do corpo do rato para reduzir os artefatos de movimento causados pela respiração e outras condições.</li>
	<li>Fotografe o material de suporte anexado à glândula sob uma objetiva de imersão em água 25x/NA 1.0 (especial para NIR). NOTA: Use um microscópio vertical de dois fótons (consulte Tabela de Materiais) neste experimento. Os vasos sanguíneos devem ser visíveis imediatamente com fluorescência óbvia após a injeção do traçador.</li>
</ol>3. Imagem do vaso e detecção de permeabilidade
<ol><li>Iniciar a imagem logo após a visão da glândula foi escolhida. NOTA: Normalmente, séries temporais de 45-50 imagens em 20 s ou mais são geralmente capturadas dependendo do desenho experimental.</li>
	<li>Adquira imagens sequenciais ao longo do eixo Z, separados por 2 μm, da superfície da glândula até 70-140 μm no tecido para gerar uma construção tridimensional (3D).</li>
	<li>Adquira imagens de lapso de tempo dos vasos para medir a permeabilidade vascular no SMG. NOTA: Defina as condições do menu do programa da seguinte forma depois de executar o software do microscópio (consulte Tabela de materiais).<ol><li>Na caixa de diálogo Explorer, clique em Adicionar Nova Pasta e altere o nome do arquivo.</li>
		<li>Volte para a coluna Aquisição . Em XY, o formato é 512 x 512 e a velocidade é 400 Hz. Ative o X bidirecional .</li>
		<li>Defina o fator Zoom como 0,75 e 1,5 para Zoom.</li>
		<li>Para adquirir imagens de lapso de tempo, selecione xyt em Modo de aquisição. Defina a duração para 20 s, 30 min ou mais, de acordo com a necessidade experimental.</li>
		<li>Para fazer a construção 3D, defina o Modo de Aquisição como xyz. O tamanho do Z-Step pode ser definido de acordo com a situação real.</li>
		<li>Depois de definir as condições, clique em Live para observar a imagem vascular de dois canais e canais sobrepostos no quadro de formação de fotos e escolha as áreas de interesse.</li>
		<li>Clique em Iniciar para iniciar a geração de imagens. NOTA: O rato não deve ser deixado sem supervisão durante o processo de imagem durante a anestesia.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise dos dados
<ol><li>Para avaliar a permeabilidade dos vasos, utilizar o software Image J para calcular a razão de intensidade de fluorescência de FD4 e RD70 entre os vasos externos e internos e denotá-los como intensidade extra e intravascular4. NOTA: A alteração da permeabilidade vascular através do rastreamento do transporte de dextrans reflete a mudança na função da barreira endotelial. Além disso, observe a morfologia vascular e a densidade calculando o diâmetro e o número de alterações dos vasos.<ol><li>Execute o software Image J (consulte Tabela de materiais).</li>
		<li>Clique em Arquivo e selecione Abrir para abrir as imagens dos vasos sanguíneos capturadas sob o microscópio de dois fótons.</li>
		<li>Selecione Imagem e defina Tipo como 16 bits para converter o formato da imagem.</li>
		<li>Selecione Analisar e selecione Área, Média, IntDen em Definir Medidas. Clique em OK para confirmar.</li>
		<li>Em Analisar, selecione Ferramentas, abra o Gerenciador de ROI e selecione Mostrar Tudo e Rótulos.</li>
		<li>Meça o valor da intensidade da fluorescência intravascular: clique na ferramenta de laço na interface principal para esboçar o contorno do vaso sanguíneo. Clique em Adicionar no Gerenciador de ROI. Siga esta etapa para continuar a selecionar vários vasos. Selecione todos os objetos do ROI Manager e clique em Medir.</li>
		<li>Meça o valor da intensidade total de fluorescência: contorne a imagem inteira, clique em Medir e o resultado é o valor da intensidade de fluorescência total da imagem.</li>
		<li>Calcule o valor da intensidade de fluorescência extravascular. Copie os dados para o Excel para cálculo. A razão de intensidade de fluorescência extravascular = (1 − valor de intensidade de fluorescência intravascular/valor de intensidade de fluorescência total) × 100%.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Aplicações a jusante
<ol><li>Durante o experimento, calcule a taxa de fluxo sanguíneo medindo a distância que um glóbulo vermelho (mostrado como um ponto preto sob o microscópio de dois fótons)4 sofre em um período de tempo.</li>
	<li>Para visualizar o movimento das células sanguíneas através das células endoteliais, rotule as células sanguíneas por fluorescência. Em seguida, injete as células marcadas com fluorescência com FD4 ou RD70 através da veia da cauda do rato. Depois de circular por 5 min, rastreie as células interessadas por um período. NOTA: Um total de 2 x 106 CFSE (carboxifluoresceína succinimidil éster, um corante fluorescente permeável à membrana) linfócitos marcados derivados do baço de camundongos doadores foram transferidos para receptores por injeção na veia da cauda, e a infiltração de linfócitos em SMGs foi investigada em modelos animais experimentais4.</li>
</ol>6. Cuidados e recuperação dos animais
<ol><li>Cuide bem dos animais durante todo o experimento. NOTA: Certifique-se de que o animal que foi submetido à cirurgia não seja devolvido à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado durante o experimento.</li>
	<li>Não deixe o animal sozinho até que ele recupere a consciência suficiente. NOTA: Observe o estado respiratório dos ratos continuamente e mantenha-os aquecidos, colocando-os na almofada de aquecimento do animal. Fornecer alojamento de recuperação da dor pós-cirúrgica e analgesia, conforme recomendado pelo comitê de ética animal local.</li>
</ol>

<ol><li>Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretion%2C+components%2C+and+properties+of+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Food+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The secretion, components, and properties of saliva.</a> Annual Review of Food Science and Technology. 4, 267-276 (2013).</li>
<li>Garrett, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proper+role+of+nerves+in+salivary+secretion%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">The proper role of nerves in salivary secretion: A review.</a> Journal of Dental Research. 66 (2), 387-397 (1987).</li>
<li>Berndt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+proteins+at+the+blood-brain+barrier%3A+Far+more+than+claudin-5%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tight junction proteins at the blood-brain barrier: Far more than claudin-5.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (10), 1987-2002 (2019).</li>
<li>Cong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+endothelial+barrier+function+is+linked+with+hyposecretion+and+lymphocytic+infiltration+in+salivary+glands+of+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Disruption of endothelial barrier function is linked with hyposecretion and lymphocytic infiltration in salivary glands of Sjögren's syndrome.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1864 (10), 3154-3163 (2018).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+Multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis+of+the+apical+plasma+membrane+during+regulated+exocytosis+in+the+salivary+glands+of+live+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Bioarchitecture%22%5BJournal%5D)">Homeostasis of the apical plasma membrane during regulated exocytosis in the salivary glands of live rodents.</a> Bioarchitecture. 1 (5), 225-229 (2011).</li>
<li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li>
<li>Balda, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissociation+of+paracellular+permeability+and+transepithelial+electrical+resistance+and+disruption+of+the+apical-basolateral+intramembrane+diffusion+barrier+by+expression+of+a+mutant+tight+junction+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein.</a> The Journal of Cell Biology. 134 (4), 1031-1049 (1996).</li>
<li>Enis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction%2C+differentiation%2C+and+remodeling+of+blood+vessels+after+transplantation+of+Bcl-2-transduced+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction, differentiation, and remodeling of blood vessels after transplantation of Bcl-2-transduced endothelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (2), 425-430 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+digital+subtraction+angiography+in+canine+hindlimb+arteriography%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular%22%5BJournal%5D)">Application of digital subtraction angiography in canine hindlimb arteriography.</a> Vascular. 30 (3), 474-480 (2022).</li>
<li>Trani, M., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+in+the+control+of+vascular+permeability%3A+vascular+endothelial-cadherin+and+other+players%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">New insights in the control of vascular permeability: vascular endothelial-cadherin and other players.</a> Current Opinion in Hematology. 22 (3), 267-272 (2015).</li>
<li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability%2C+blood+pressure%2C+and+organ+damage+in+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension+Research%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertension Research. 31 (5), 873-879 (2008).</li>
<li>Scheppke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2%2FSrc+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2337-2346 (2008).</li>
<li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CD34+leads+to+exacerbated+autoimmune+arthritis+through+increased+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Loss of CD34 leads to exacerbated autoimmune arthritis through increased vascular permeability.</a> Journal of Immunology. 184 (3), 1292-1299 (2010).</li>
<li>Egawa, G., Ono, S., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging+of+vascular+permeability+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging of vascular permeability by two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 2223, 151-157 (2021).</li>
<li>Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+in+the+regulation+of+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).</li>
<li>Schulte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> The EMBO Journal. 30 (20), 4157-4170 (2011).</li>
<li>Uhl, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+experimental+approach+for+in+vivo+analyses+of+the+salivary+gland+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A novel experimental approach for in vivo analyses of the salivary gland microvasculature.</a> Frontiers in Immunology. 11, 604470(2020).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A manutenção e regulação da função de barreira endotelial são essenciais para a homeostase vascular. As células endoteliais e suas junções intercelulares desempenham um papel crítico na manutenção e controle da integridade vascular12. A força de cisalhamento do fluxo sanguíneo, fatores de crescimento e fatores inflamatórios podem causar alterações na permeabilidade vascular e, assim, participar da ocorrência e desenvolvimento de doenças sistêmicas como hipertensão, diabetes e doenças autoimunes<su...

Várias glândulas salivares produzem saliva, que atua principalmente como a primeira linha de defesa contra infecções e ajuda a digestão, desempenhando assim um papel essencial na saúde bucal e geral1. O suprimento de sangue é crucial para a secreção das glândulas salivares, uma vez que fornece constantemente água, eletrólitos e moléculas que formam a saliva primária. A função de barreira endotelial, regulada pelo complexo de junção apertada (TJ), limita estrita e delicadamente a permeação dos capilares, que são altamente permeáveis à água, solutos, proteínas e até mesmo células que se deslocam dos vasos sanguíneos circulantes para os tecidos das glândulas salivares 2,3. Descobrimos anteriormente que a abertura dos TJs endoteliais em resposta a um estímulo colinérgico facilita a secreção salivar, enquanto o comprometimento da função da barreira endotelial está interligado com hipossecreção e infiltração linfocítica nas glândulas submandibulares (SMGs) na síndrome de Sjögren4. Esses dados sugerem que a contribuição da função de barreira endotelial precisa ser prestada atenção suficiente em relação a uma variedade de doenças das glândulas salivares.
Um microscópio de varredura a laser de dois fótons é uma ferramenta poderosa para observar a dinâmica das células no tecido intacto in vivo. Uma das vantagens dessa técnica é que a luz infravermelha próxima (NIR) tem penetração tecidual mais profunda do que a luz visível ou ultravioleta quando os espécimes são excitados pelo NIR e não causa danos evidentes à luz dos tecidos sob condições apropriadas 5,6. De fato, as glândulas salivares são um tecido muito homogêneo e superficial, no qual as células acinares superficiais estão a apenas cerca de 30 μm de distância da superfície da glândula 7,8. Demonstrou-se que a microscopia confocal intravital pode estudar a secreção exócrina e o citoesqueleto de actina em glândulas salivares vivas de camundongos em resolução subcelular8. A microscopia de varredura a laser de dois fótons, no entanto, não só tem a vantagem da microscopia confocal convencional, mas também pode ser usada para detectar tecidos e imagens mais profundos com mais clareza. Aqui, o dextrans marcado por fluorescência, que é frequentemente usado como traçador de permeabilidade paracelular e tem a vantagem de diferentes tamanhos, pode ser usado para testar a magnitude do poro TJ9. No presente estudo, uma técnica intravital de microscopia a laser de dois fótons em tempo real é estabelecida para avaliação in situ da função da barreira endotelial em SMGs de camundongos. Cada etapa de trabalho para detecção de permeabilidade vascular in vivo em SMGs de camundongos é descrita no protocolo atual. Aqui está um exemplo de detecção da função de barreira endotelial no modelo de ligadura do ducto SMG do rato.

<table><tbody><tr><td>Microscópio de 2 fótons (TCS-SP8 DIVE)</td><td>Leica, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 kDa dextrano marcado com FITC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>70 kDa rodamina B marcado com dextrano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>Separação de tecido rombudo níquel</td><td>Bejinghuabo Company</td><td>NZW28</td><td></td></tr><tr><td>Creme depilatório</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril descartável</td><td>Zhiyu Company</td><td></td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Image J software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>0253316</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtubos</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Tamponamento fosfato solução salina 1x</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de tecido</td><td>Bejinghuabo Company</td><td>M286-05</td><td></td></tr><tr><td>Tribromoetanol</td><td>JITIAN Bio</td><td>JT0781</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo detecção de permeabilidade vascular em glândula submandibular de camundongo

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

A saliva desempenha um papel importante na saúde oral e geral. A função de barreira endotelial intacta dos vasos sanguíneos permite a secreção de saliva, enquanto a disfunção da barreira endotelial está relacionada a muitos distúrbios secretores das glândulas salivares. O presente protocolo descreve um método de detecção de permeabilidade paracelular in vivo para avaliar a função das junções endoteliais apertadas (TJs) em glândulas submandibulares de camundongos (SMG). Primeiro, dextrans marcado com fluorescência com diferentes pesos moleculares (4 kDa, 40 kDa, ou 70 kDa) foram injetados nas veias angulares de camundongos. Posteriormente, o SMG unilateral foi dissecado e fixado no suporte personalizado sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons e, em seguida, as imagens foram capturadas para vasos sanguíneos, ácinos e dutos. Utilizando este método, o vazamento dinâmico em tempo real dos traçadores de diferentes tamanhos dos vasos sanguíneos para os lados basais dos ácinos e até mesmo através do epitélio acinar para os ductos foi monitorado para avaliar a alteração da função de barreira endotelial sob condições fisiológicas ou fisiopatológicas.

Seguindo o protocolo, o SMG unilateral foi anexado a um suporte personalizado, e a glândula foi mantida o mais longe possível do corpo do rato para evitar que a respiração causasse artefatos de movimento. O rápido fluxo dos glóbulos vermelhos (pontos pretos) nos vasos sanguíneos foi observado ao microscópio. Depois de encontrar o campo de tecido sob uma lente ocular, deve-se mudar para manipular o software do microscópio. No grupo controle, ambos os marcadores existiam nos vasos sanguíneos do camundongo SMG. Em particula...

No presente protocolo, a função de barreira endotelial da glândula submandibular (SMG) foi avaliada por meio da injeção de diferentes marcadores fluorescentes de peso molecular nas veias angulares de modelos animais de teste in vivo sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons.

In vivo Detecção de Permeabilidade Vascular em Glândula Submandibular de Camundongo

Saliva plays an important role in oral and overall health. The intact endothelial barrier function of blood vessels enables saliva secretion, whereas the ...

O presente protocolo descreve uma medida de detecção de permeabilidade paracelular in vivo para avaliar a função de junções endoteliais apertadas em glândulas submandibulares de camundongos. A microscopia de varredura a laser de dois fótons, no entanto, não só tem a vantagem da microscopia confocal convencional, mas também pode ser usada para detectar tecidos e imagens mais profundos com mais clareza. Este experimento fornece uma boa medida de método para avaliar a permeabilidade vascular de diferentes tecidos, especialmente os tecidos superficiais e órgãos de animais.Comece escolhendo marcadores apropriados, como fluoresceína, isotiocianato, dextrano marcado e rodamina B, dextran marcado com espectros distintos de emissões de excitação, para minimizar a interferência entre os sinais de fluorescência para o ensaio de permeabilidade. Diluir os vestígios em solução salina tamponada com fosfato estéril em estoques de 100 miligramas por mililitro e armazenar as alíquotas protegidas da luz a menos 20 graus Celsius. Depois de anestesiar o rato macho do tipo selvagem de 8 a 10 semanas de idade, segure suavemente a cabeça e o pescoço do rato para fazer com que um lado do globo ocular se projete ligeiramente.Insira uma seringa de insulina contendo 100 microlitros de mistura de solução de marcador fluorescente ao longo do canto do olho em ângulo reto com o olho. Após a injeção, coloque rapidamente o rato sobre o cartão em decúbito dorsal com os membros e a cabeça adesivados. Para isolamento da glândula submandibular ou SMG, sob um microscópio estereoscópico, corte a epiderme do pescoço com tesouras de tecido geral para expor ambos os lados dos SMGs.Em seguida, use uma agulha de separação de tecido contundente para separar suavemente a cápsula da superfície da glândula sem danificar o tecido da glândula, os vasos sanguíneos e a estrutura glandular. Conecte o suporte personalizado ao dispositivo de pressão negativa e verifique se o efeito de pressão negativa é adequadamente alcançado com antecedência. Coloque suavemente o SMG exposto no suporte personalizado e sugue o tecido por sucção por pressão negativa, o mais longe possível do corpo do rato, para reduzir os artefactos de movimento causados pela respiração e outras condições.Comece a imagem logo após o local da glândula ser escolhido. Adquira imagens sequenciais ao longo do eixo Z a dois mícrons de distância da superfície da glândula até 70 a 140 mícrons no tecido para gerar uma construção tridimensional. Em seguida, adquira imagens de lapso de tempo dos vasos para medir a permeabilidade vascular no SMG.Na caixa de diálogo Explorer, clique em Adicionar Nova Pasta" e altere o nome do arquivo. Em seguida, volte para a coluna de aquisição. Em XY, o formato é de 512 por 512, e a velocidade é de 400 hertz.Ative o X"R bidirecional, defina o fator de zoom como 0,75 e 1,5 para zoom. Em seguida, selecione XYT em Modo de Aquisição "para adquirir imagens de lapso de tempo. Defina a duração para 20 segundos, 30 minutos ou mais, de acordo com a necessidade experimental.Depois de definir as condições, clique em Live"para observar a imagem vascular de dois canais e canais sobrepostos no quadro de formação de fotos e escolha as áreas de interesse. Clique em Iniciar" para iniciar a geração de imagens. Ensaio de permeabilidade vascular in vivo e imagens tridimensionais de vasos sanguíneos em camundongos.As glândulas submandibulares são mostradas aqui. No grupo controle, ambos os marcadores existiam nos vasos sanguíneos do SMG. Devido ao seu pequeno peso molecular, o FD4 foi capaz de vazar dos vasos sanguíneos para os lados basais dos ácinos e ductos, descrevendo assim claramente a forma dos ácinos e ductos.O RD70 foi distribuído em vasos sanguíneos de grande porte e microvasos. No grupo ligadura do ducto, tanto o FD4 quanto o RD70 foram extravasados para os lados basais dos ácinos, o que indicou que a ligadura do ducto poderia interromper a função de barreira endotelial e aumentar a permeabilidade a moléculas grandes. Além disso, os resultados semiquantitativos de intensidade de fluorescência FD4 e RD70 confirmaram essas observações.As imagens tridimensionais mostraram fluorescência muito mais obscurecida de FD4 e RD70 ao redor dos vasos sanguíneos no grupo ligadura em comparação com o grupo controle. O isolamento cuidadoso do SMG e a colocação apropriada e o microscópio são pré-requisitos essenciais para uma detecção bem-sucedida. Após os procedimentos, a taxa de fluxo sanguíneo pode ser calculada casando o movimento dos glóbulos vermelhos e a infiltração das células sanguíneas marcadas com fluorescência pode ser perseguida.

in-vivo-vascular-permeability-detection-in-mouse-submandibular-gland

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos

A camada de superfície endotelial glicocálice / endotelial está idealmente estudada por microscopia intravital. Microscopia intravital é tecnicamente desafiante em um órgão em movimento, tais como o pulmão. Demonstramos como brightfield simultânea e microscopia de fluorescência pode ser utilizado para estimar a espessura da camada endotelial da superfície em um movimento...

Na medição in vivo da camada superficial do rato pulmonar endotelial

Microscopia intravital é uma ferramenta poderosa que permite a imagem latente vários processos biológicos em animais vivos. Neste artigo, é apresentado um método detalhado para a imagem dinâmica das estruturas subcelulares, tais como os grânulos secretores, nas glândulas salivares de ratos vivos.

Microscopia intravital para Estruturas de imagem Subcelulares em ratos vivos Expressando fluorescentes Proteínas

Este documento explica a aplicação de imagem fluorescente usando uma sonda de imagiologia óptica activável para visualizar a actividade in vivo de metaloproteinases de matriz chave em dois modelos experimentais diferentes de inflamação.

Non-invasive<em&gt; In Vivo</em&gt; Fluorescência de imagem óptico de Inflamatória MMP Atividade Usando um Agente de Imaging Activatable fluorescente

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Descreveremos um protocolo para cirurgicamente expor e estabilizar a glândula salivar submandibular murino para intravital imagem usando microscopia intravital vertical. Este protocolo é facilmente adaptável a outras glândulas exócrinas da cabeça e região do pescoço dos ratos e outros pequenos roedores.

Preparação de murino das glândulas salivares Submandibular para microscopia Intravital vertical

Entrega de drogas local para as glândulas submandibulares é de interesse em biologia de glândula salivar de entendimento e para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Apresentamos um protocolo de injeção retroductal atualizadas e detalhadas, destinado a melhorar a precisão de entrega e reprodutibilidade experimental. O aplicativo aqui apresentado é a entrega de nanopartículas poliméricas.

Injeção de Retroductal de nanopartículas para a glândula Submandibular murino

Aqui, apresentamos um protocolo para medir o vazamento vascular induzido pela administração intradérmica de agentes de promoção de permeabilidade na pele murino. Esta técnica pode ser usada para determinar a capacidade das moléculas de promover ou inibir vazamento vascular ou para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular.

Avaliação de agentes de indução Hyperpermeability vasculares na pele com o ensaio de milhas

O presente protocolo descreve uma técnica fácil para a imagem intravital da glândula mamária de camundongos lactantes por microscopia confocal e multifotônica de varredura a laser.

Microscopia Subcelular Intravital da Glândula Mamária

A imagem por imunofluorescência é limitada pela capacidade de observar processos biológicos complexos e dependentes do tempo em apenas um único instantâneo no tempo. Este estudo descreve uma abordagem de imagem ao vivo conduzida em cortes de glândula submandibular de camundongos com corte preciso. Esta abordagem permite a observação em tempo real das interações célula-célula durante a homeostase e os processos de regeneração e reparo.

Interrogando interações célula-célula na glândula salivar via imagem de células vivas ex vivo

O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem padronizada para avaliar quantitativamente a integridade da barreira epitelial gengival murina, aplicando topicamente dextranos marcados com fluorescência de diferentes tamanhos moleculares na superfície gengival in vivo, seguido por imagens ex vivo usando um sistema de microscopia de fóton único.

Avaliação funcional da barreira epitelial gengival de camundongos usando traçadores fluorescentes

Aprenda a detectar permeabilidade vascular em glândulas submandibulares de camundongo usando microscopia confocal de varredura a laser de dois fótons. Este método avalia a função das junções endoteliais em modelos animais.

In vivo Detecção de Permeabilidade Vascular em Glândula Submandibular de Camundongo

Explorar mais vídeos