Name: Isolamento de Células Epiteliais Pigmentares da Retina de Olhos de Cobaia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 6 s
Description: Aprenda a isolar células do epitélio pigmentar da retina de olhos de cobaia usando microscopia e ferramentas de dissecação. Este método simples produz amostras de alta qualidade adequadas para estudos de biologia molecular e análise de expressão gênica.

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Este estudo é apoiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência Bolsas de Pesquisa no Exterior (S.G.), um bolsista de pós-doutorado de Loris e David Rich (S.G.), e uma bolsa do Instituto Nacional de Olhos dos Institutos Nacionais de Saúde (R01EY012392; C.F.W.).

Todos os cuidados e tratamentos com animais utilizados neste estudo estão em conformidade com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmológica e da Visão. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia, Berkeley.
1. Enucleação do olho da cobaia
<ol><li>Eutanásia de uma cobaia com uma injeção intracardíaca de pentobarbital sódico administrada sob anestesia (isoflurano a 5% em oxigênio).</li>
	<li>Enuclear os olhos com o auxílio de pinça e tesoura e transferi-los imediatamente para uma placa de Petri de 10 cm com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) para lavagem. Transfira os olhos para uma solução de PBS fresca. NOTA: Recomenda-se uma placa de 6 poços contendo 4 mL de solução por poço.</li>
</ol>2. Isolamento da taça ocular posterior e do complexo PSE/coroide/esclera
<ol><li>Com o auxílio de um microscópio dissecante, utilizar uma agulha 18G para fazer uma pequena incisão inicial na esclera, aproximadamente 1,0 mm atrás do limite limbal (isto é, entre a córnea e a esclera) (Figura 1A); Em seguida, use tesoura para remover o segmento anterior, incluindo córnea, íris, corpo ciliar e cristalino.</li>
	<li>Em seguida, trabalhando com a taça do segmento ocular posterior restante, desprenda a retina do complexo PSE/coroide/esclera; usar pinça para primeiro agarrar e, em seguida, puxar suavemente a zônula de Zinn e, em seguida, descascar progressivamente a retina sem fragmentação (Figura 1B). NOTA: A retina não deve ser captada diretamente para evitar fragmentação retiniana e isolamento incompleto do tecido retiniano. O uso de um microscópio é essencial para esta etapa de dissecção.</li>
</ol>3. Isolamento da PSE da coroide
<ol><li>Após a remoção completa da retina, mergulhe o copo ocular posterior restante, que inclui o EPR, a coroide e a esclera, no reagente de armazenamento de tecido por 5 min (consulte a Tabela de Materiais). OBS: Utilizar uma placa de 12 poços com poços identificados, cada um preenchido com 2 mL do reagente de armazenamento de tecido.</li>
	<li>Transfira o copo para outro poço preenchido com 4 mL de PBS por 10 s antes de movê-lo para um terceiro poço preenchido com 2 mL de PBS.</li>
	<li>Anexe uma agulha de 30 G a uma seringa de 1 mL preenchida com PBS para a etapa final de isolamento do EPR. Empurre suavemente a seringa para criar uma corrente de jato de PBS; primeiro, direcione essa corrente para o EPR para fazer um pequeno rasgo ou furo nele e, em seguida, direcione o fluxo de PBS para a abertura criada para separar o EPR como uma folha da coroide (Figura 1C). Observação : O descolamento do RPE como uma folha produz a maior amostra de RPE. Novamente, o uso de um microscópio é essencial para essa etapa.</li>
	<li>Após o descolamento do EPR da coroide (Figura 1D), colete o tecido do EPR em uma seringa de 1 mL sem agulha e, em seguida, transfira a amostra coletada para um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar o tubo de 1,5 mL com o EPR coletado a 8.000 × g por 1 min para obter um pellet de EPR (Figura 2A).</li>
	<li>Eliminar a solução PBS e substituí-la por 350 ml de tampão de lise, conforme incluído nos kits de isolamento de ARN (ver Tabela de Materiais); pipeta 20x para misturar e, assim, preservar a qualidade da amostra. Para armazenamento e conservação a longo prazo, transfira as amostras para um congelador de -80 °C. NOTA: O tampão de lise é um componente proprietário do kit de isolamento de RNA para lise de células e tecidos antes do isolamento de RNA e isolamento simultâneo de RNA/DNA/proteína. Para inativar as RNAses no lisado, certifique-se de adicionar β-mercaptoetanol ao tampão de lise (10 μL de β-mercaptoetanol por 1 mL de tampão de lise).</li>
</ol>4. Extração de RPE-RNA
<ol><li>Use um kit de isolamento de RNA (consulte a Tabela de Materiais) para isolar e coletar o RNA das amostras de EPR seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Avaliar a qualidade da amostra por eletroforese. NOTA: O protocolo descrito produziu um produto de boa qualidade (ou seja, número de integridade de RNA [RIN] acima de 8,0).</li>
</ol>

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigmented+epithelium+-+from+basic+developmental+biology+research+to+translational+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches.</a> The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).</li>
<li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retina-specific+Aldh1a1+controls+dorsal+choroidal+vascular+development+via+Sox9+expression+in+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells.</a> Elife. 7, 32358(2018).</li>
<li>Rymer, J., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+retinal+pigment+epithelium+in+eye+growth+regulation+and+myopia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review.</a> Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).</li>
<li>Wallman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+the+retina%3A+Choroidal+modulation+of+refractive+state%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state.</a> Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scleral+hypoxia+is+a+target+for+myopia+control%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Scleral hypoxia is a target for myopia control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).</li>
<li>Troilo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imi+-+Report+on+experimental+models+of+emmetropization+and+myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Violet+light+suppresses+lens-induced+myopia+via+neuropsin+%28OPN5%29+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118(2021).</li>
<li>Zhang, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPE+and+choroid+mechanisms+underlying+ocular+growth+and+myopia%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).</li>
<li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li>
<li>McLeod, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+RPE+and+choriocapillaris+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982(2009).</li>
<li>Bhutto, I., Lutty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+age-related+macular+degeneration+%28AMD%29%3A+Relationships+between+the+photoreceptor%2Fretinal+pigment+epithelium%2FBruch%27s+membrane%2Fchoriocapillaris+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex.</a> Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).</li>
<li>Shelton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+choroid%2FRPE+gene+expression+in+marmoset+eyes+undergoing+changes+in+ocular+growth+and+refraction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction.</a> Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).</li>
<li>Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+retinoic+acid+on+the+tight+junctions+of+the+retinal+pigment+epithelium-choroid+complex+of+guinea+pigs+with+lens-induced+myopia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).</li>
<li>He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+gene+expression+in+tree+shrew+retina+and+retinal+pigment+epithelium+produced+by+short+periods+of+minus-lens+wear%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear.</a> Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).</li>
<li>Nickla, D. L., Wallman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifunctional+choroid%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The multifunctional choroid.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional%2C+optical+sign-dependent+regulation+of+BMP2+gene+expression+in+chick+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).</li>
<li>Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+rapid+isolation+of+RPE+cells+specifically+for+RNA+extraction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis.</a> Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Goto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+signatures+of+contact+lens-induced+myopia+in+guinea+pig+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Opthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium.</a> Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25(2022).</li>
<li>De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+patterns+in+domestic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular patterns in domestic animals.</a> Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).</li>
<li>Araki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-resolution+methylome+of+retinal+pigment+epithelial+cells+used+in+the+first+trial+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-based+autologous+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).</li>
<li>Sonoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+differentiation+of+highly+polarized+human+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells.</a> Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Neste artigo, descrevemos um método de isolamento do EPR, apropriado para análises da expressão do gene do EPR, dos olhos de cobaias jovens e pigmentadas. O mérito deste protocolo é que ele produz amostras de EPR de alta qualidade que são relativamente livres de contaminação, com RNA adequadamente preservado para análises específicas de RNA e, ainda assim, é relativamente simples e eficiente. Enquanto no exemplo fornecido aqui, as amostras de EPR foram coletadas dos olhos de uma cobaia jovem (2 semanas de idade), o proto...

O EPR compreende uma única monocamada de células pigmentadas localizada entre a retina neural e a coroide vascular, e o EPR tem papéis bem reconhecidos no desenvolvimento e manutenção da função normal da retina, incluindo a fototransdução 1,2. Mais recentemente, foi atribuído à PSE um papel fundamental adicional na regulação do crescimento ocular3 e, portanto, no desenvolvimento da miopia4. Essa atribuição baseia-se na localização crítica da PSE, interposta entre a retina e a coroide, e na aceitação agora ampla de que o crescimento ocular e, portanto, os erros refrativos são reguladoslocalmente5. Acredita-se que a PSE desempenhe um papel fundamental como relé de sinal, ligando a retina, fonte presumida de sinais modulatórios de crescimento, à coroide e esclera, os dois alvos dos sinais retransmitidos 6,7,8.
O aumento do comprimento axial que caracteriza a maioria das miopias não pode ser considerado benigno, com alterações fisiopatológicas envolvendo retina, coroide e/ou esclera representando consequências inevitáveis e agora bem reconhecidas doalongamento ocular excessivo7,9. Nesse contexto, o EPR talvez seja o mais vulnerável, pois, sendo um tecido não mitótico, só é capaz de acomodar a câmara vítrea em expansão pelo estiramento e afinamento de células individuais. Embora seu papel em patologias relacionadas à miopia, como a degeneração macular míope, ainda não seja totalmente compreendido, o EPR tem sido implicado na patogênese de uma série de outras doenças retinianas, incluindo a atrofia geográfica, uma das principais causas de cegueira, que está associada a anormalidades documentadas na retina, PSE e coroide10,11, 12º.
O isolamento bem-sucedido de células de EPR, livres de contaminação de tecidos oculares adjacentes, potencialmente abre muitas oportunidades de pesquisa para obter novos insights sobre os mecanismos subjacentes a uma variedade de doenças oculares/retinianas. Entretanto, o isolamento da PSE tem se mostrado desafiador, com muitos estudos publicados fazendo uso da combinação retina/PSE ou PSE/coroide por esse motivo13,14,15. Estudos envolvendo o sucesso do isolamento do EPR de qualidade adequada para estudos de biologia molecular têm sido limitados a olhos de pintinhos e camundongos16,17. Por exemplo, o método simultâneo de isolamento de PSE e estabilização de RNA (SRIRS) descrito por Wang et al.18. Isolar células RPE em camundongos não parece funcionar bem em olhos de cobaias. O protocolo aqui descrito representa um refinamento de uma abordagem que foi inicialmente prototipada com olhos de musaranho por um dos autores (M.F.) e provou produzir amostras de EPR de alta qualidade, apropriadas para análises de RNA e outras análises de biologia molecular, a partir de olhos de cobaias pigmentadasjovens19.

<table><tbody><tr><td>Seringa de 1 mL com Ponta Deslizante</td><td>Bd Vacutainer Labware Medical</td><td>22-253-260</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos de 6 Poços com Tampa, Fundo Plano, Peitoral Estéril</td><td>Chemical Mfg. Corp</td><td>970-95008</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos de 12 Poços com Tampa, Individual, Estéril</td><td>Thomas Scientific LLC</td><td>1198D72</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td></td><td></td><td>eletroforese automatizada para verificar a qualidade do RNA</td></tr><tr><td>Soluções Salinas Balanceadas</td><td>Micro</td> Fórceps <td>Gibco 10010031</td><td></td></tr><tr><td>Bonn, Reta Lisa, Ponta de 0,3 mm, 7 cm</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11083-07</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumont nº 5</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas descartáveis hipodérmicas</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26419</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas descartáveis hipodérmicas</td><td>Exelint International, Co.</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>MiniSpin Microcentrífugas</td><td>Eppendorf</td><td>540108</td><td>Max. Velocidade: 8.000 g</td></tr><tr><td>Solução de estabilização de RNAlater</td><td>Reagente de armazenamento de tecidos</td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kits</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Kit de isolamento de RNA</td></tr><tr><td>Student Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>Rolamento 91500-09</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células epiteliais pigmentares da retina de olhos de cobaia

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

Este protocolo descreve o isolamento de células do epitélio pigmentado da retina (EPR) dos olhos de cobaias pigmentadas jovens para potencial aplicação em estudos de biologia molecular, incluindo análises de expressão gênica. No contexto da regulação do crescimento ocular e miopia, o EPR provavelmente desempenha um papel como um relé celular para sinais modulatórios de crescimento, uma vez que está localizado entre a retina e as duas paredes do olho, como a coroide e a esclera. Embora protocolos para isolar o PSE tenham sido desenvolvidos tanto para pintos quanto para camundongos, esses protocolos provaram não ser diretamente traduzíveis para a cobaia, que se tornou um modelo importante e amplamente utilizado de miopia em mamíferos. Neste estudo, ferramentas de biologia molecular foram usadas para examinar a expressão de genes específicos para confirmar que as amostras estavam livres de contaminação dos tecidos adjacentes. O valor desse protocolo já foi demonstrado em um estudo de RNA-Seq de PSE de cobaias pigmentadas jovens expostas ao desfoco óptico indutor de miopia. Além da regulação do crescimento ocular, esse protocolo tem outras aplicações potenciais em estudos de doenças retinianas, incluindo maculopatia míope, uma das principais causas de cegueira em miopes, na qual o EPR tem sido implicado. A principal vantagem desta técnica é que é relativamente simples e, uma vez aperfeiçoada, produz amostras de EPR de alta qualidade adequadas para estudos de biologia molecular, incluindo análise de RNA.

A análise das amostras de EPR coletadas pelo protocolo acima mostrou RNA bem preservado (RIN &gt;8,0, Figura 2B), com 240,2 ng ± 35,1 ng por olho (n = 8, NanoDrop, Figura 2B). Para avaliar melhor a qualidade das amostras isoladas de EPR, particularmente a ausência de contaminantes coroidais e esclerais, examinamos a expressão de genes representativos para cada um destes últimos tecidos nas amostras deEPR19. As amostras de EPR demonstrara...

Descrevemos um método simples e eficiente para isolar células do epitélio pigmentado da retina (EPR) de olhos de cobaias pigmentadas jovens. Este procedimento permite o acompanhamento de estudos de biologia molecular do EPR isolado, incluindo análises de expressão gênica.

Isolamento de Células Epiteliais Pigmentares da Retina de Olhos de Cobaia

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

O epitélio pigmentado da retina ou EPR é crítico para a saúde da retina. E estudar o EPR isolado é crucial para a doença retiniana. Este método de isolamento de EPR da cobaia, um modelo popular de miopia, ajuda a resolver o problema desafiador.A principal vantagem desta técnica é que é relativamente simples e produz amostra de EPR de alta qualidade adequada para os estudos moleculares biológicos, incluindo a análise de EPR. Seguindo perfeitamente a técnica demonstrada e observando como manipular as ferramentas dissecadoras, pode-se dominar esse procedimento rapidamente com alguma prática. Depois de sacrificar humanamente a cobaia e enuclear os olhos do animal, lave imediatamente os olhos transferindo-os para uma placa de Petri de 10 centímetros contendo solução salina tamponada com fosfato estéril ou PBS.Após a lavagem, transfira os olhos para a solução de PBS fresca. Agora trabalhando sob um microscópio dissecante, use uma agulha de calibre 18 para fazer uma pequena abertura inicial na esclera de um olho, aproximadamente um milímetro atrás do limite limbal entre a córnea e a esclera. Com tesoura, remova o segmento anterior, incluindo córnea, íris, corpo ciliar e cristalino.Em seguida, trabalhando com um segmento ocular posterior remanescente, use uma pinça para agarrar e puxar suavemente a zônula de Zinn, seguido de desprender a retina do complexo PSE/coroide/esclera e descascar a retina sem fragmentação. Após a remoção completa da retina, mergulhe o copo ocular posterior restante, que inclui o EPR, a coroide e a esclera, em um dos poços de uma placa de 12 poços contendo dois mililitros de reagente de armazenamento de tecido e mantenha-o imerso por cinco minutos. Para enxaguar o reagente de armazenamento, transfira o copo para outro bem preenchido com quatro mililitros de PBS por 10 segundos antes de movê-lo para um terceiro poço preenchido com dois mililitros de PBS.Antes de prosseguir para a etapa final de isolamento do EPR, prepare uma seringa de um mililitro preenchida com PBS e conecte uma agulha de calibre 30. Empurre suavemente o êmbolo da seringa para criar um fluxo de jato de PBS. Trabalhando sob um microscópio, primeiro, aponte esse fluxo de PBS para o EPR para fazer um pequeno rasgo ou buraco nele.Em seguida, direcione o fluxo de PBS para a abertura criada para separar o EPR como uma folha da coroide. Após desprender o EPR da coroide, colete as células do EPR em uma seringa de um mililitro sem agulha e transfira a amostra coletada para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo com o EPR coletado a 8.000 x g por um minuto para obter um pellet de EPR.Para amostras a serem usadas em análises de RNA, descarte o sobrenadante, que é a solução PBS, e substitua-o por 350 mililitros de tampão de lise, conforme incluído nos kits de isolamento de RNA. Pipete o conteúdo para cima e para baixo 20 vezes para misturar bem e preservar a qualidade da amostra. Para armazenamento e preservação a longo prazo, transfira as amostras para um congelador de 80 graus Celsius negativos.Use um kit de isolamento de RNA e siga as instruções do fabricante para isolar e coletar o RNA das amostras de EPR antes de avaliar a qualidade da amostra por eletroforese. Em nosso estudo, as amostras de EPR coletadas apresentaram RNA bem preservado com um número de integridade de RNA ou NIR maior que oito. A contagem total de RNA é de cerca de 240 nanogramas por olho.O nível de expressão do gene específico do EPR, Rpe65, foi significativamente maior nas amostras de EPR do que na coroide e esclera. Em contraste, as amostras de EPR apresentaram expressão mínima do gene específico da esclera coroide selecionada, colágeno tipo alfa-ona, indicando a ausência de contaminantes coroidais e esclerais nas amostras isoladas de EPR. O passo mais importante do procedimento é a remoção suave da retina sem deixar nenhum fragmento de retina.Este procedimento de isolamento de EPR justifica estudos in vitro em cultura de células com algumas diferenças importantes, incluindo a escolha do meio de imersão das células de EPR após o isolamento.

isolation-of-retinal-pigment-epithelial-cells-from-guinea-pig-eyes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, mostramos um procedimento para obter células epiteliais pigmentares oculares de um modelo de coelho. As células são úteis no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para doenças degenerativas da retina.

Isolando células IPE e RPE: uma técnica para obter células epiteliais pigmentares oculares do olho de coelho

Neste vídeo, descrevemos uma técnica para isolar células epiteliais pigmentares da íris e da retina de olhos suínos para obter suas culturas primárias para estudos in vivo e ex vivo. Essas células pigmentares podem ser geneticamente modificadas para estudar abordagens regenerativas para tratar distúrbios oculares.

Isolamento de células IPE e RPE: uma técnica para obter células epiteliais pigmentadas de olho suíno isolado

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar as células epiteliais pigmentares da retina, ou EPR, e as células epiteliais pigmentares da íris, ou EIP, de olhos bovinos colhidos. As células isoladas podem ser cultivadas para estudar seu papel no tratamento de doenças oculares.

Isolando células RPE e IPE do olho bovino: um procedimento para colher e cultivar células epiteliais de pigmento primário bovino

Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e transfetar células epiteliais de íris primária e pigmento da retina de vários mamíferos (ratos, ratos, coelhos, suínos e bovinos). O método é ideal para estudar abordagens de terapia genética ocular em várias configurações para análises ex vivo e estudos in vivo transferíveis para humanos.

Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

Este protocolo descreve o procedimento para obtenção e cultivo de células epiteliais pigmentares primárias da retina (EPR) a partir de olhos suínos de origem local. Essas células servem como uma alternativa de alta qualidade às células-tronco e são adequadas para pesquisas in vitro da retina.

Isolamento de células epiteliais pigmentares primárias da retina suína para modelagem in vitro

O epitélio pigmentar da retina (EPR) atua como uma barreira crucial entre a coróide e a retina, promovendo a saúde e a função dos tipos de células da retina, como os fotorreceptores. Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficaz para isolar e cultivar EPR murino adulto.

Um método simplificado para isolamento e cultura de células epiteliais pigmentares da retina de camundongos adultos

Neste vídeo, vamos demonstrar como isolar células-tronco na retina do epitélio ciliar do olho do rato e cultivá-las em cultura para dar forma clonal esferas da retina. As esferas que estão isolados possuem as propriedades cardeal de células-tronco: a auto-renovação e multipotencialidade.

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

Uma maneira rápida e robusta de isolar células-tronco adultas viável epiteliais da pele humana é descrito. O método utiliza a digestão enzimática da matriz de colágeno da pele, seguido por arrancar dos folículos pilosos e isolamento de células em suspensão simples ou fragmentos de tecido para cultura de células.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

CHIRP é uma técnica recente e rápida de mapa genômico sítios de ligação de RNAs não-codificantes longos (lncRNAs). O método tira partido da especificidade dos oligonucleótidos anti-sentido ladrilhos para permitir que a enumeração de sítios lncRNA-bound genómicos.

Isolamento de cromatina por purificação de RNA (CHIRP)

Aprenda a isolar células do epitélio pigmentar da retina de olhos de cobaia usando microscopia e ferramentas de dissecação. Este método simples produz amostras de alta qualidade adequadas para estudos de biologia molecular e análise de expressão gênica.

Isolamento de Células Epiteliais Pigmentares da Retina de Olhos de Cobaia

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