Name: DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas baseadas para reconhecimento de ácidos nucleicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprenda a projetar nanomáquinas baseadas em DNAzyme para detecção de ácidos nucleicos usando software livre. Este método demonstra aplicação na identificação de fragmentos do vírus Epstein-Barr com alta seletividade.

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<meta charset="utf8"></head><body>Nanomáquinas DNAzyme de precisão para análise discriminativa de RNA e DNA

<ol><li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+hybridization+probes+to+DNA+machines+and+robots%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots.</a> Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).</li>
<li>Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+hybridization+probes+for+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection.</a> Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).</li>
<li>Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+sides+of+the+coin%3A+affinity+and+specificity+of+nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Tr+Bioche+Sc%22%5BJournal%5D)">Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions.</a> Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).</li>
<li>Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+probes+for+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Binary probes for nucleic acid analysis.</a> Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).</li>
<li>Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+hybridization+probes+for+sensitive+and+selective+DNA+and+RNA+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection.</a> Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bacterial+16S+rRNA+using+a+molecular+beacon-based+X+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor.</a> Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).</li>
<li>Dark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+LightCycler+Septi+Fast+for+the+detection+and+identification+of+pathogens+in+the+blood+of+patients+with+suspected+sepsis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis.</a> Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).</li>
<li>Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Detection+of+Stem-Loop+Primer+Amplification+%28SPA%29+products+without+denaturation+using+peroxidase-like+DNA+machines+%28PxDM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sc%22%5BJournal%5D)">Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM).</a> Int J Mol Sc. 24 (9), 7812(2023).</li>
<li>Gorbenko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+nanomachine+for+visual+detection+of+structured+RNA+and+double+stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Comm%22%5BJournal%5D)">DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA.</a> Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).</li>
<li>Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+using+G-quadruplex+amplification+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies.</a> Methods. 64 (3), 185-198 (2013).</li>
<li>Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MNAzymes%2C+a+versatile+new+class+of+nucleic+acid+enzymes+that+can+function+as+biosensors+and+molecular+switches%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches.</a> JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+cleaving+deoxyribozyme+sensor+for+nucleic+acid+analysis%3A+the+limit+of+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection.</a> Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+16S+RNA+in+a+signal-producing+structure+for+detection+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria.</a> Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).</li>
<li>Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+M+%22Chin.+Chem+Let%22">Chin. Chem Let</a>. , 109232(2023).</li>
<li>Peeters, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+PCR-amplified+DNAzyme+activity+for+real-time+FO-SPR+detection+of+the+MCR-2+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene.</a> Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).</li>
<li>Wood, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+typing+of+nontuberculous+Mycobacteria+by+use+of+deoxyribozyme+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors.</a> Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).</li>
<li>Yan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralow+background+one-pot+detection+of+Lead+%28II%29+using+a+non-enzymatic+double-cycle+system+mediated+by+a+hairpin-involved+DNAzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme.</a> Biosen Bioelectron. 237, 115534(2023).</li>
<li>Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subzymes%3A+Regulating+DNAzymes+for+point+of+care+nucleic+acid+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sens.+Act.+B%3A+Chem%22%5BJournal%5D)">Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing.</a> Sens. Act. B: Chem. 297, 126704(2019).</li>
<li>Safdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-only%2C+microwell-based+bioassay+for+multiplex+nucleic+acid+detection+with+single+base-pair+resolution+using+MNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes.</a> Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).</li>
<li>Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+antenna+tile-associated+deoxyribozyme+sensor+with+improved+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity.</a> Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).</li>
<li>Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+minimachine+for+selective+and+sensitive+detection+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA.</a> Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).</li>
<li>Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Nanomachine+%28DNM%29+Biplex+Assay+for+Differentiating+Bacillus+cereus+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sc%22%5BJournal%5D)">DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species.</a> Int J Mol Sc. 24 (5), 4473(2023).</li>
<li>El-Deeb, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+home+test+for+COVID-19+diagnosis%3A+DNA+machine+for+amplification-free+SARS-CoV-2+detection+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples.</a> Chem Med Chem. 17 (20), 202200382(2022).</li>
<li>Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+DNAzyme-based+fluorescent+biosensor+for+detection+of+RNA-containing+Nipah+henipavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus.</a> Biosensors. 13 (2), 252(2023).</li>
<li>Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barley+haplotyping+using+biplex+deoxyribozyme+nanomachine%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Act+Rep%22%5BJournal%5D)">Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine.</a> Sens Act Rep. 4, 100132(2022).</li>
<li>Okonechnikov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unipro+UGENE%3A+a+unified+bioinformatics+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit.</a> Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).</li>
<li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li>
<li>Markham, N. R., Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DINAMelt+web+server+for+nucleic+acid+melting+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction.</a> Nucleic Acids Res. 33, Web Server issue W577-W581 (2005).</li>
<li>Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonequilibrium+hybridization+enables+discrimination+of+a+point+mutation+within+5-40+C%5BTitle%5D)+AND+%22JACS%22%5BJournal%5D)">Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C.</a> JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).</li>
<li>Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+dynamic+gated+and+cascaded+transient+DNAzyme+networks%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks.</a> ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).</li>
<li>Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+kinetics+of+the+10-23+RNA-cleaving+DNAzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sc%22%5BJournal%5D)">Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme.</a> Int J Mol Sc. 24 (18), 13686(2023).</li>
<li>Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular-beacon-based+tricomponent+probe+for+SNP+analysis+in+folded+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Chem-eur+J%22%5BJournal%5D)">Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids.</a> Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).</li>
<li>MacDougall, D., Crummett, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+data+acquisition+and+data+quality+evaluation+in+environmental+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry.</a> Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expedited+quantification+of+genetically+modified+ribosomal+RNA+by+binary+deoxyribozyme+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors.</a> RNA. 10, 1834-1843 (2015).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+16S+RNA+in+a+signal-producing+structure+for+detection+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria.</a> Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).</li>
<li>GC Content Calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU">https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU</a> (2023).</li>
<li>Hussein, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAzyme+nanomachine+with+fluorogenic+substrate+delivery+function%3A+advancing+sensitivity+in+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection.</a> Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).</li>
<li>Safdar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-only%2C+microwell-based+bioassay+for+multiplex+nucleic+acid+detection+with+single+base-pair+resolution+using+MNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes.</a> Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).</li>
<li>Gerasimova, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxyribozyme+cascade+for+visual+detection+of+bacterial+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA.</a> Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).</li>
<li>Eckert, K. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+fidelity+and+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Res%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction.</a> Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).</li>
<li>Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems%3A+Programmable+nuclease+revolutionizing+the+molecular+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis.</a> Mol Biotech. , (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo de 1,5 mL</td><td></td><td>Biofil CFT011015</td><td></td></tr><tr><td>100 bp+ DNA Ladder</td><td>Evrogen</td><td>NL002</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 &micro; Pipeta L</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro1000</td><td></td></tr><tr><td>10-100 &micro; Pipeta L</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro100</td><td></td></tr><tr><td>1-10 &micro; Pipeta L</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro10</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &micro; Pipeta L</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro200</td><td></td></tr><tr><td>2-20 &micro; L pipeta</td><td>Kirgen</td><td>KG-Pro20</td><td></td></tr><tr><td>4x Gel Loading Dye</td><td>Evrogen</td><td>PB020</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida 4K</td><td>AppliChem</td><td>A1090,0500</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Carl Roth</td><td>2809447</td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>Biorender</td><td></td><td>https://www.biorender.com</td></tr><tr><td>Bisacrilamida</td><td>Molekula</td><td>22797959</td><td></td></tr>Sistema de imagem <tr><td>Boric Acid</td><td>TechSnab</td><td>H-0202</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc</td><td>BioRad</td><td>12003153</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96-Well Black Polystyrene Plate</td><td>Corning</td><td>COS3915</td><td></td></tr><tr><td>DinaMelt</td><td>RNA Institute</td><td></td><td>http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>Am-O105</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>BioLabMix</td><td>EtBr-10</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td>Amresco Am-O485</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>AppliChem</td><td>131396</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658001EDU</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 10 &micro; Ponteiras L</td><td>Kirgen</td><td>KG1111-L</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 1000 &micro; Ponteiras L</td><td>Kirgen</td><td>KG1636</td><td></td></tr><tr><td>pipeta 200 &micro; Pontas L</td><td>Kirgen</td><td>KG1212-L</td><td></td></tr><tr><td>Pixelmator Pro</td><td>Pixelmator Team</td><td></td><td>https://www.pixelmator.com/pro/</td></tr> <tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Carl Roth</td><td>1782751</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Fonte de alimentação básica</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>RNAse/DNAse água livre</td><td>Invitrogen</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>Filme de vedação para placas de PCR</td><td>Sovtech</td><td>P-502</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Vekton</td><td>HCh (0,1)</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas multimodo Spark</td><td>Tecan</td><td>Spark- 10M</td><td></td></tr><tr><td>T100 amplificador</td><td>BioRad</td><td>10014822</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Molekula</td><td>68604730</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano</td><td>Amresco</td><td>Am-O497</td><td></td></tr><tr><td>UNAFold</td><td>Instituto</td><td></td> de RNA <td>http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>LOIP</td><td>LB-140</td><td></td></tr><tr><td>Oligos usados</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analyte:</td><td>Evrogen</td><td></td><td>ordem direta, purificação</td></tr> <tr><td>de dessalinização padrãoGAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tile-Arm3:</td><td>Evrogen</td><td></td><td>pedido direto, purificação de dessalinização padrão</td></tr><tr><td>CCG GGCTGCTGTGCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT</td><td>Evrogen</td><td></td><td>pedido direto, purificação de dessalinização padrão</td></tr><tr><td>Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGCCTGACCA</td><td>Evrogen</td><td></td><td>pedido direto, purificação</td></tr> <tr><td>de dessalinização padrão<forte>sub-oligonucleotídeo F:</forte> AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1</td><td>DNA-Syntez</td><td></td><td>ordem direta, purificação por HPLC</td></tr></tbody></table>

dnazyme 10-23 - nanomáquinas baseadas para reconhecimento de ácidos nucleicos

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

O objetivo do primeiro experimento foi mostrar a montagem do DNM antes do fragmento sintético do analito. Todas as fitas DNM constituintes foram adicionadas ao tampão de reação e montadas no béquer. O complexo DNM montado foi avaliado quanto ao seu tamanho correto e homogeneidade por PAGE nativo. A PÁGINA nativa mostra o DNM montado com o analito na pista 1 e duas fitas DNM nas pistas 2 e 4. Se a nanomáquina de DNA não fosse montada, 2 ou 3 bandas separadas seriam visíveis em vez de uma única banda de baixa mobilidade (pista 2 na Figura 2A).
A segunda parte do Protocolo implica a caracterização funcional do desempenho do DNM e a detecção de ácidos nucleicos alvo. Neste estudo, foi utilizado o fragmento sintético do EBV 13972-14154. Para isso, os fragmentos de DNMs pré-montados, juntamente com o Dza, foram incubados com várias concentrações do analito por 1 h a 55 °C. Dois valores de sinal fluorescente de controle foram medidos: o dos fragmentos de DNMs pré-montados e Dzb sem o analito (branco) e o do fundo de F-sub (básico). Foram realizadas três medidas técnicas. Para estatísticas, três ensaios independentes também foram realizados. Ressalta-se que a concentração de magnésio neste estudo é maior do que a encontrada na literatura30. Altos níveis de íons magnésio aumentam o sinal em todos os tubos de teste, pois promovem uma clivagem espontânea do sub-F31. Otimizamos a composição do tampão de reação durante os estágios preliminares de desenvolvimento da tecnologia e não repetimos esse processo em todos os estudos realizados.
Após 1 h de incubação, a fluorescência da amostra foi medida usando um espectrofluorômetro (ver Tabela de Materiais). Para confirmar a detecção do DNA analisado pelo DNM, comparamos o sinal fluorescente do sensor montado com o DNA analisado e o do controle negativo, que não contém nenhum analito adicionado. A relação sinal-branco (uma razão entre as unidades de fluorescência relativas médias dos alvéolos que contêm a substância a analisar e dos alvéolos sem substância a analisar) não deve ser inferior a 1,5 para confirmar a detecção bem-sucedida32. A razão entre o branco e o básico (fluorescência da resposta do sensor na ausência de analito dividida pela do controlo apenas F-sub) deve situar-se no intervalo de 1,1-1,5; esta proporção pode ser ajustada alterando as concentrações de DNM e Dzb (a faixa de concentração típica para cada uma é de 5-20 nM). Em nossa prática, o LOD é quantificado como a interseção da linha de tendência e três desvios padrão acima do branco médio (Figura 2B). O DNM é eficaz se o LOD for &lt;100 pM33. O DNM deve ser reprojetado se o LOD for superior a 100 pM.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66461/66461fig01.jpg"> Figura 1: Os três braços DNM usados neste estudo. Três oligonucleotídeos, Dza, Dzb-Tile e Tile-Arm3, são marcados como verde, azul e roxo, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66461/66461fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66461/66461fig02.jpg"> Figura 2: Caracterização do DNM. (A) Montagem do DNM por eletroforese nativa em gel de poliacrilamida a 12%, 80 V, 1 h, usando uma escada de DNA de 50 pb +. (B) O limite de detecção de DNA sintético após 60 minutos de incubação a 55 °C. A linha horizontal representa o limiar e a linha vertical é o LOD. Os valores médios de três medidas independentes são apresentados com um desvio padrão. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66461/66461fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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