Name: Análise Metabolômica de Cevada por Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda análise metabolômica de cevada por cromatografia gasosa/espectrometria de massas para estudar os efeitos da seca na agricultura. Este método melhora a identificação de compostos e contribui para a segurança alimentar.

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O financiamento foi fornecido pela USDA ARS Pulse Crop Health Initiative e pela Idaho Barley Commission.

1. Preparação dos padrões (Figura 2)
<img alt="diagrama de estrutura química da heptacosano, 5α-colestan-3β-ol, fenil-β-D-glucopiranosídeo, 4-cloro-L-fenilalanina" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67175/67175fig02.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2: Estruturas químicas dos quatro padrões internos utilizados neste método. Esses quatro padrões são usados para a semiquantificação de metabólitos nas diferentes frações de cevada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67175/67175fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
<ol>
	<li>Prepare o Padrão 1 dissolvendo n-heptacosano (50 mg, pureza ≥97%) em n-hexano (100 mL, pureza ≥95%).</li>
	<li>Prepare o Padrão 2 dissolvendo 5α-cholestan-3β-ol (60 mg, pureza ≥95%) em diclorometano (CH2Cl2, 100 mL, pureza ≥99%).</li>
	<li>Prepare o Padrão 3 dissolvendo fenil-β-D-glucopiranosídeo (80 mg, pureza ≥95%) em água desionizada (H2O DI, 100 mL).</li>
	<li>Prepare o Padrão 4 dissolvendo 4-cloro-L-fenilalanina (40 mg, pureza ≥97%) em H2O DI (100 mL).</li>
</ol>
2. Fracionamento inicial
<ol>
	<li>Coloque farinha de cevada (200 mg) em um reservatório de extração em fase sólida (SPE). Embeba a farinha com metanol (200 µL, grau ACS ou pureza superior) por 20 min para macerar. Remova o metanol por evaporação sob vácuo por 30 min (Figura 3).</li>
	<li>Após secagem, conecte a coluna a um manifold de vácuo. Extraia os componentes não polares (Fração A) com CH2Cl2 (4 mL) em um frasco de 10 mL e mantenha o vácuo até que a farinha fique seca.</li>
	<li>Extraia os componentes polares (Fração B) adicionando uma mistura de metanol e H2O DI (10 mL, 8:2 v/v). Colete em um frasco de 10 mL e mantenha o vácuo até que a farinha fique seca.</li>
</ol>
<img alt="Configuração do sistema de manifold a vácuo para SPE, purificação de amostras, análise cromatográfica em laboratório." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67175/67175fig03.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3: Configuração do manifold a vácuo. Esta configuração é usada para secar a farinha de cevada embebida em metanol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67175/67175fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
3. Processamento da Fração A para produzir as Frações 1 e 2
<ol>
	<li>Adicione o padrão 1 e o padrão 2 (100 µL cada) à Fração A e homogeneíze por pipetagem repetida. Evapore completamente o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.</li>
	<li>Redissolva a amostra em metil tert-butil éter (MTBE, 500 µL, grau ACS ou pureza superior). Adicione metanol (300 µL) e metóxido de sódio (14,6 mg, 97%). Deixe a transesterificação prosseguir por 90 min à temperatura ambiente sob agitação magnética.</li>
	<li>Adicione ácido clorídrico aquoso (2 mL, 0,35 M, grau ACS ou pureza superior). Misture a solução acidificada com CH2Cl2 (1 mL). Colete o conteúdo do vial com uma pipeta Pasteur longa e deixe as fases separarem na pipeta.</li>
	<li>Transfira a fase inferior (orgânica) para um novo vial. Lave a fase orgânica adicionando ácido clorídrico aquoso (2 mL, 0,35 M). Colete o conteúdo do vial com uma pipeta Pasteur longa e deixe as fases separarem na pipeta.</li>
	<li>Transfira a fase inferior (orgânica) para um novo vial. Evapore a fase inferior (orgânica) até secura em um evaporador rotativo.</li>
	<li>Adicione sulfato de sódio anidro (200 mg, grau ACS ou pureza superior) a uma coluna de SPE. Dissolva a amostra do passo 3.5 em CH2Cl2 (250 µL) e aplique na coluna de SPE.</li>
	<li>Elua a Fração 1 da coluna de SPE com três porções de n-hexano e MTBE (2,04 mL, 50:1 v/v) em um vial de 10 mL. Evapore a solução contendo a Fração 1 (FAMEs e hidrocarbonetos) até secura em um evaporador rotativo. Redissolva a amostra em n-hexano (300 µL) e transfira para um vial de amostragem automática para uso em CG/EM.</li>
	<li>Elua a pré-fração 2 da coluna de SPE (após a eluição da Fração 1 no passo 3.7) com três porções subsequentes de n-hexano e MTBE (2 mL, 7:3 v/v) em um vial de 10 mL. Evapore a pré-fração 2 até secura em um evaporador rotativo.</li>
	<li>No mesmo vial, redissolva a pré-Fração 2 em piridina anidra (250 µL, 99,8%) (transfira a piridina utilizando o método do balão de argônio — veja abaixo) e adicione N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida (MSTFA, 50 µL, grau reagente). 
	NOTA: Todos os solventes anidros são transferidos utilizando o método do balão de argônio.
	<ol>
		<li>Utilizando abraçadeiras plásticas, fixe uma luva de nitrila na extremidade de uma seringa com o êmbolo removido. Encha o balão com argônio anidro e acople uma agulha descartável à seringa.</li>
		<li>Insira a seringa com balão através da septa do frasco contendo o reagente anidro e insira uma segunda seringa com agulha longa para aspirar o solvente (Figura 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Encha o vial da amostra com um fluxo suave de argônio anidro, tampe, feche com parafilm e coloque em banho-maria de óleo a 70 °C sob agitação magnética por 15 min.</li>
	<li>Após a siliilação, deixe esfriar a Fração 2 (derivatizada com TMS: ácidos graxos, álcoois graxos, FAMEs hidroxilados, ácidos graxos hidroxilados, fenóis e esteróis) à temperatura ambiente por 5 min. Carregue a Fração 2 em um vial de amostragem automática.</li>
</ol>
<img alt="Configuração de cilindro de gás de laboratório com luvas para segurança, demonstrando experimento ou aparelho de fluxo de gás." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67175/67175fig04.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: A montagem com balão de argônio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67175/67175fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>
4. Processamento da Fração B para produzir as Frações 3 e 4
<ol>
	<li>Adicione os Padrões 3 e 4 (300 µL cada) à Fração B e homogeneíze por pipetagem repetida. Transfira 2 mL desta solução para um novo frasco para ser processado na Fração 3 e, em seguida, transfira 4 mL desta solução para um frasco separado para ser processado na Fração 4, iniciando a partir da evaporação da pré-fração 4 na etapa 4.4. Evapore a pré-fração 3 até secagem em evaporador rotativo, seguido de coevaporação com piridina anidra (2 x 1,5 mL). 
	NOTA: A coevaporação é utilizada para remover traços de água, pois a piridina anidra forma um azeótropo.</li>
	<li>Redissolva a pré-fração 3 em piridina anidra (200 µL) e adicione N-trimetilsililimidazol (TMSIM, 100 µL, 97%). Passe um fluxo suave de argônio anidro no frasco da amostra, tampe, feche com parafilm e aqueça por 20 min em banho-maria a 70 °C sob agitação magnética. 
	NOTA: O TMSIM é um agente de siliilação suave e siliilará preferencialmente grupos -OH em vez de grupos amina8.</li>
	<li>Após a siliilação, deixe a solução esfriar à temperatura ambiente por 5 min, adicione n-hexano (200 µL) e H2O DI (400 µL) e agite. Transfira a fase superior, orgânica, ou seja, a Fração 3 (açúcares e polióis derivatizados com TMS), para um frasco de amostragem automática usando uma pipeta Pasteur longa.</li>
	<li>Evapore a pré-fração 4, da etapa 4.1, até secagem em evaporador rotativo, seguido de coevaporação com piridina anidra (2 x 1,5 mL). Redissolva a amostra em piridina anidra (250 µL) e adicione cloridrato de metoxiamina (5 mg, 98%). Passe argônio no frasco da amostra, tampe, feche com parafilm e realize a oximação por 30 min em banho-maria a 70 °C sob agitação magnética.</li>
	<li>Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente por 5 min, adicione MSTFA (100 µL), passe suavemente argônio anidro no frasco da amostra, tampe, feche com parafilm e siliile por 20 min em banho-maria a 70 °C sob agitação magnética.</li>
	<li>Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente por 5 min, em seguida adicione n-hexano e H2O DI (800 µL, 5:3 v/v). Colete a fase inferior (aquosa) usando uma pipeta Pasteur longa e lave com 4 x 500 µL de n-hexano, coletando sempre a fase inferior e descartando a fase superior. Evapore a fase aquosa até secagem em evaporador rotativo e coevapore o material remanescente com acetonitrila anidra (2 x 1,5 mL, grau ACS ou pureza superior).</li>
	<li>Redissolva a amostra em acetonitrila anidra (250 µL) e adicione MSTFA (50 µL). Passe suavemente argônio anidro no frasco da amostra, tampe, feche com parafilm e aqueça por 60 min em banho-maria a 70 °C sob agitação magnética.</li>
	<li>Deixe a solução esfriar à temperatura ambiente por 5 min, em seguida transfira a Fração 4 (ácidos carboxílicos, aminoácidos e aminas derivatizados com TMS) para um frasco de amostragem automática.</li>
</ol>
5. Métodos de GC/MS
<ol>
	<li>Carregue as amostras em um GC/MS com as seguintes características da coluna: 15 m x 0,25 mm de diâmetro interno, revestida com filme não polar de 0,25 µm.</li>
	<li>Utilize os seguintes volumes de injeção para frações 1-4, respectivamente: 1,0, 1,0, 0,5 e 0,5 µL. Execute as amostras injetadas com fluxo dividido (razão de divisão 1:10) de 14 mL/min de hélio a uma temperatura de injeção de 250 °C.</li>
	<li>Para frações 1 e 2, aumente a temperatura da coluna de 100 °C a 300 °C a 4 °C/min com patamar de 10 min. 
	NOTA: O tempo total de corrida é de 65 min.</li>
	<li>Para a fração 3, aqueça e mantenha a coluna a 300 °C durante toda a corrida. 
	NOTA: O tempo total de corrida é de 70 min.</li>
	<li>Para a fração 4, aqueça a coluna de 70 °C a 142 °C a 2,5 °C/min com patamar de 10 min, seguido por aquecimento de 142 °C a 235 °C a 4 °C/min com patamar de 10 min. Por fim, aqueça a coluna a 320 °C por 8 min. 
	NOTA: O tempo total de corrida é de 102 min.</li>
</ol>
6. Identificação de metabólitos
<ol>
	<li>Realize a identificação de metabólitos comparando o espectro de massa de cada composto com as bibliotecas espectrais de massa do NIST, utilizando um software cromatográfico com correspondência de índice de busca. Selecione um pico candidato usando o cursor do computador; em seguida, visualize os espectros. Clique com o botão direito nos espectros para iniciar a busca na biblioteca. 
	NOTA: Esta etapa pode ser automatizada dependendo do software do instrumento.</li>
	<li>Semiquantifique cada amostra normalizando as áreas dos picos ao padrão, dividindo a área do pico da amostra pela área do pico do padrão para cada fração. 
	NOTA: Isso permite a comparação dos níveis de metabólitos entre frações e amostras, mesmo quando o processamento das amostras varia.</li>
</ol>

Derivatization and Separation of Barley Flour Metabolites into Four Fractions

<ol><li>Verstegen, H., Köneke, O., Korzun, V., von Broock, R. The world importance of barley and challenges to further improvements. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVerstegen%2C+H+%22Biotechnological+approaches+to+barley+improvement.+Biotechnology+in+Agriculture+and+Forestry%22">Biotechnological approaches to barley improvement. Biotechnology in Agriculture and Forestry</a>. Kumlehn, J., Stein, N. 69, Springer. Berlin, Heidelberg. 3-19 (2014).</li>
<li>Agribusiness handbook: Barley malt beer. , Agriculture Organization of the United Nations. Rome. 
 <a target="_blank" href="https://www.fao.org/4/i1003e/i1003e00.htm">https://www.fao.org/4/i1003e/i1003e00.htm</a> (2009).</li>
<li>Jena, J., et al. Role of legumes in cropping system for soil ecosystem improvement. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJena%2C+J+%22Ecosystem+services%3A+types%2C+management+and+benefits%22">Ecosystem services: types, management and benefits</a>. , Nova Science Publishers, Inc. New York. 1-21 (2022).</li>
<li>Ahmed, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+changes+in+grain+ultrastructure%2C+amylase%2C+protein+and+amino+acid+profiles+between+Tibetan+wild+and+cultivated+barleys+under+drought+and+salinity+alone+and+combined+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential changes in grain ultrastructure, amylase, protein and amino acid profiles between Tibetan wild and cultivated barleys under drought and salinity alone and combined stress.</a> Food Chem. 141 (3), 2743-2750 (2013).</li>
<li>Marchev, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+and+health%3A+from+nutritional+crops+and+plant-based+pharmaceuticals+to+profiling+of+human+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Metabolomics and health: from nutritional crops and plant-based pharmaceuticals to profiling of human biofluids.</a> Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6487-6503 (2021).</li>
<li>Kusch, P. Gas chromatography: Derivatization, sample preparation, application. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKusch%2C+P+%22IntechOpen%22">IntechOpen</a>. , (2019).</li>
<li>Haas, M., Lamour, S., Trapp, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+advanced+derivatization+protocol+for+the+unambiguous+identification+of+monosaccharides+in+complex+mixtures+by+gas+and+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Development of an advanced derivatization protocol for the unambiguous identification of monosaccharides in complex mixtures by gas and liquid chromatography.</a> J Chromatogr A. 1568, 160-167 (2018).</li>
<li>Moldoveanu, S. C., David, V. Derivatization methods in GC and GC/MS. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoldoveanu%2C+SC+%22Gas+chromatography-derivatization%2C+sample+preparation%2C+application%22">Gas chromatography-derivatization, sample preparation, application</a>. , IntechOpen. (2018).</li>
<li>Kim, B. R., Sung, G. H., Kim, J. -J., Yoon, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+development+of+rapid%2C+practical+and+selective+process+for+preparation+of+z-oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Korean+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A development of rapid, practical and selective process for preparation of z-oximes.</a> Journal of the Korean Chemical Society. 57 (2), 295-299 (2013).</li>
<li>Miyagawa, H., Bamba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+sequential+derivatization+with+concurrent+methods+for+GC%2FMS-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparison of sequential derivatization with concurrent methods for GC/MS-based metabolomics.</a> J Biosci Bioeng. 127 (2), 160-168 (2019).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeOx-TMS+derivatization+for+GC-MS+metabolic+profiling+of+urine+and+application+in+the+discrimination+between+normal+C57BL%2F6J+and+type+2+diabetic+KK-Ay+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">MeOx-TMS derivatization for GC-MS metabolic profiling of urine and application in the discrimination between normal C57BL/6J and type 2 diabetic KK-Ay mice.</a> Analytical Methods. 6 (12), 4380-4387 (2014).</li>
<li>Röhlig, R. M., Eder, J., Engel, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiling+of+maize+grain%3A+differentiation+due+to+genetics+and+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiling of maize grain: differentiation due to genetics and environment.</a> Metabolomics. 5, 459-477 (2009).</li>
<li>Cook, B. I., Mankin, J. S., Anchukaitis, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Climate+change+and+drought%3A+From+past+to+future%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Climate+Change+Reports%22%5BJournal%5D)">Climate change and drought: From past to future.</a> Current Climate Change Reports. 4, 164-179 (2018).</li>
<li>Samarah, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+drought+stress+on+growth+and+yield+of+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy+for+Sustainable+Development%22%5BJournal%5D)">Effects of drought stress on growth and yield of barley.</a> Agronomy for Sustainable Development. 25 (1), 145-149 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Divulgamos um método bem-sucedido para a extração de metabólitos do grão de cevada para análise metabólica. Várias etapas deste protocolo de extração requerem atenção especial para alcançar resultados satisfatórios. Além disso, também é preciso ter cuidado durante a etapa de análise, especialmente devido ao número e às diferentes propriedades dos produtos derivatizados.
Para que as derivatizações de metabólitos sejam eficazes, é necessário excluir a umidade dos solventes e vasos de reação. Por...

A cevada é o quarto grão mais produzido no mundo1. Com as mudanças climáticas aumentando a frequência e intensidade de secas, espera-se que a produtividade dessa cultura caia significativamente, já que o estresse hídrico severo pode reduzir o rendimento do grão em quase uma ordem de magnitude2. Acredita-se que práticas agronômicas que diversifiquem a paisagem aumentem a resiliência — a tendência de manter os rendimentos e as propriedades do solo das terras cultivadas. O cultivo consorciado, ou seja, o cultivo simultâneo de duas espécies na mesma área, é uma dessas práticas, especialmente quando inclui leguminosas fixadoras de nitrogênio, como lentilhas ou ervilhas3.
Os metabólitos vegetais são moléculas pequenas encontradas nos tecidos e células das plantas, como açúcares, aminoácidos e lipídios, que podem ser utilizados para compreender as respostas das plantas ao estresse físico e ambiental. Estudos anteriores demonstraram que certos metabólitos na cevada, como a prolina e certos açúcares, estão presentes em níveis mais elevados em condições de seca, mas ainda não foi realizado um estudo metabolômico completo tanto para estresse hídrico quanto para condições de consórcio agrícola4. O que permanece obscuro é como o metaboloma do grão muda devido ao estresse biótico do consórcio e ao estresse ambiental decorrente da seca. O metaboloma — o perfil metabólico total do grão — é importante tanto para as aplicações finais da cevada quanto para identificar as respostas bioquímicas que permitem às plantas adaptar-se a mudanças em seu ambiente5.
Este estudo descreve o desenvolvimento do método e os resultados preliminares da análise metabolômica de cevada cultivada sob condições de estresse hídrico e consorciação, utilizando cromatografia gasosa/espectrometria de massas (GC/MS). Para análise, os metabólitos da cevada foram fracionados e derivatizados de acordo com a polaridade em quatro frações (Figura 1). Os principais constituintes das frações são os seguintes: Fração 1: ésteres metílicos de ácidos graxos (FAMEs) e hidrocarbonetos; Fração 2: ácidos graxos livres, álcoois graxos, FAMEs hidroxilados, fenóis e esteróis, todos sililados; Fração 3: açúcares e polióis sililados; e Fração 4: ácidos hidrofílicos, aminoácidos e aminas, todos sililados. Assim, Frações 1 e 2 contêm predominantemente metabólitos não polares, enquanto Frações 3 e 4 contêm predominantemente metabólitos polares.
Primeiro, os metabólitos são extraídos do grão de cevada moído em solventes polares e apolares. É realizada uma fração adicional para permitir uma melhor separação dos metabólitos nos espectros de massa. Além disso, os pontos de ebulição de muitos dos metabólitos são muito elevados para permitir a volatilização por CG, exigindo uma derivatização adicional. Assim, os metabólitos que contêm grupos hidroxila foram sililados em éteres de trimetilsilila (TMS) correspondentes6, enquanto os ésteres de ácidos graxos foram convertidos em ésteres metílicos de ácidos graxos. Adicionalmente, os açúcares foram oximados em sua forma de cadeia linear, reduzindo o número de isômeros possíveis presentes para cada açúcar7. Figura 1 mostra um fluxograma para a fracionamento e derivatização dos metabólitos na farinha de cevada. O protocolo abaixo fornece mais detalhes sobre as etapas específicas mostradas nesta figura.
<img alt="Diagrama de extração de farinha de cevada, detalhando os processos de extração de lipídios e compostos polares." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67175/67175fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Um diagrama de fluxo para a fracionamento e derivatização de metabólitos de cevada. Abreviações: MeOH = metanol; NaOMe = metóxido de sódio; TMSIM = N-trimetilsililimidazol; MeONH2 = cloreto de metoxiamina; MSTFA = N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida; DI H2O = água desionizada; MTBE = éter metil-terc-butilo; SPE = extração em fase sólida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67175/67175fig01largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>4-cloro-L-fenilalanina</td><td>Alfa Aesar</td><td>15470329</td><td>97%</td></tr> <tr><td>5&alfa;-colestan-3&beta;-ol</td><td>Sigma</td><td>D6128-10G</td><td>95%</td></tr> <tr><td>acetonitrila anidra</td><td>Sigma</td><td>360457</td><td>ACS (seco sobre peneiras moleculares 3 e Aring)</td></tr> <tr><td>Piridina anidra</td><td>Sigma</td><td>PX2012</td><td>99,8%</td></tr> <tr><td>sulfato de sódio anidro</td><td>EMD</td><td>SX0760-1</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Argônio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Farinha de Cevada</td><td></td><td></td><td>Cultivado no Centro de Pesquisa e Extensão de Aberdeen, Universidade de Idaho</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>de</td> Água <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Deionizada</td></tr> TCI D3478 99% <tr><td>Ácido clorídrico</td><td>EMD</td><td>HX0603-3</td><td>ACS</td></tr><tr><td>ISQ 7000 espectrômetro de massa</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Long Pastuer pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Macron</td><td>3016-16</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Cloridrato de metoxilamina</td><td>Thermo</td><td>A19188.06</td><td>98%</td></tr> <tr><td>éter metil terc-butílico</td><td>VWR</td><td>BDH1139-4LG</td><td>ACS</td></tr><tr><td>n-Heptacosane</td><td>Thermo</td><td>L07796.MD</td><td>97%</td></tr> <tr><td>n-hexano</td><td>Sigma</td><td>HX0295-6</td><td>95%</td></tr> <tr><td>N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida</td><td>Restek</td><td>35600</td><td>Solvente</td></tr> <tr><td>Agilent</td><td>12113010</td> SPE da coluna Agilent da <td></td><td>coluna</td></tr> de <tr><td></td><td>Merck</td><td>8,06538,0005</td><td>97%</td></tr>SPE do reagente <tr><td>N-trimethylsilyimidazole</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12512</td><td>97</td></tr>%<tr><td>phenyl-&beta;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>292710-5G</td><td>95%</td></tr><tr><td>Rotary Evaporador</td><td></td><td></td><td></td></tr> Merck 8,06538,0005 97% SPE <tr><td> Cartucho Reservatório</td><td>Agilent</td><td>12131014</td><td></td></tr><tr><td>TG-SQC coluna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trace 1300 cromatógrafo gasoso</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coletor</td><td></td><td></td><td></td> de vácuo</tr></tbody></table>

análise metabolômica de cevada por cromatografia gasosa/espectrometria de massas

Metabolomic Analysis of Barley by Gas Chromatography/Mass Spectrometry

As mudanças climáticas aumentam o risco de seca para a agricultura e afetam o conteúdo de nutrientes dos alimentos e a segurança alimentar geral. A metabolômica é uma forma de observar e quantificar os impactos da seca nos grãos e outros produtos agrícolas. Os metabólitos identificados podem permitir a identificação da resposta bioquímica que permite à planta tolerar ambientes estressantes. A metodologia aqui apresentada permitiu a análise metabolômica total da farinha de cevada por cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM). 
Os extratos de metabólitos da farinha de cevada foram fracionados em quatro frações com base na polaridade. Para permitir a análise por GC/MS, os metabólitos foram derivatizados para aumentar a volatilidade e a separação dos metabólitos: os ésteres de ácidos graxos foram derivatizados em ésteres metílicos de ácidos graxos; os açúcares foram oximatados em sua forma de cadeia linear; e metabólitos com grupos hidroxila foram convertidos em seus éteres silílicos correspondentes. As amostras derivatizadas foram injetadas no GC/MS e os espectros de massa gerados foram usados para identificação de metabólitos, comparando os espectros gerados com a biblioteca de espectros de massa em tandem do National Institute of Standards and Technology (NIST). O método descrito aqui também pode ser usado para examinar o metaboloma total de outras plantas, aprofundando nossa compreensão das respostas bioquímicas de plantas estressadas.

O protocolo desenvolvido realiza com sucesso a derivatização e a separação dos diversos metabólitos presentes na farinha de cevada. Cada pico no cromatograma está associado a um composto identificado a partir de seus espectros de massa. Os três picos mais proeminentes no Fração 1 dos componentes da amostra foram o éster metílico do ácido octadecadienóico, o éster metílico do ácido hexadecanóico e o ácido octadecenóico. Os três picos mais proeminentes em Fração 2 dos amostras foram ácido ...

Um método para análise metabolômica de cevada é apresentado. O método envolve fracionamento e derivatização de metabólitos e sua análise por cromatografia gasosa/espectrometria de massa (GC/MS). A análise metabolômica pode ser usada para determinar o efeito do consórcio e do estresse hídrico no grão.

Análise Metabolômica de Cevada por Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas

Climate change increases drought risk to agriculture and impacts both food nutrient content and overall food security. Metabolomics is one way to observe ...

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O método da urease de preparação de amostra para análise GC / MS de metabólitos intermediários é apresentado por seu inventor. O método permite uma etapa de acompanhamento da triagem neonatal para erros inatos por espectrometria de massa em tandem por carboidratos quantificar, orgânicos e aminoácidos tudo em um único processo.

Um passo-metabolômica: carboidratos, ácidos orgânicos e aminoácidos quantificados em um procedimento único

O perfil de metabólitos não direcionados por cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massa (UPLC-MS) é uma técnica poderosa para investigar o metabolismo.  Este artigo descreve um fluxo de trabalho típico utilizado para o perfil de metabólitos não direcionados do soro, incluindo organização e preparação de amostras, aquisição de dados, análise de dados, controle de qualidade e identificação de metabólitos.

Grande Escala Profiling não-alvo metabolômica de soro por cromatografia líquida de ultra-espectrometria de massa (UPLC-MS)

Este artigo descreve a aplicação de metabolômica irrelevantes, transcriptomics e análise estatística multivariada para transcrições baga da uva e metabolitos, a fim de ter uma visão sobre o conceito terroir, ou seja, o impacto do meio ambiente sobre características de qualidade de baga.

O Conceito Terroir Interpretado através da baga da uva Metabolomics e transcriptómica

Um protocolo melhorado é apresentado para a medição transitória da expressão do gene do repórter construções nas células de aleurona de cevada após o bombardeio de partículas. A combinação de grãos automatizado moagem com ensaios enzimáticos de placa de 96 poços fornece alto throughput para o procedimento.

Expressão gênica em camadas de aleurona cevada bombardeado com maior Throughput de medição

Este protocolo descreve como preparar larvas de Drosophila para análise da metabolómica baseados em GC-MS.

Preparação de amostras de larvas de Drosophila por cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS)-com base em metabolómica

A análise em todo o sistema de múltiplas biomoléculas é crucial para obter insights funcionais e mecanísticos em processos biológicos. Por este meio, um extenso protocolo é descrito para extração de alto débito de lipídios, metabólitos, proteínas e amido de uma única amostra colhida da cultura de Chlamydomonas sincronizada.

Um método de extração multi-Omics para a análise aprofundada de culturas sincronizadas da alga verde Chlamydomonas reinhardtii

Apresenta-se um método para a análise não direcionada de metabólitos e lipídios de grãos de trigo. O protocolo inclui um método de extração metabólica acetonitrila e metodologia de espectrometria de cromatografia líquida de fase invertida, com aquisição em modos positivos e negativos de ionização eletrospray.

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Apresentamos um protocolo para identificação e quantitação das principais classes de metabólitos solúveis em água no levedura Saccharomyces cerevisiae. O método descrito é versátil, robusto e sensível. Permite a separação de isômeros estruturais e formas estereogômicas de metabólitos solúveis em água uns dos outros.

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Os protocolos descrevem métodos de cromatografia líquida de alto desempenho acoplados ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para estudar reações metabólicas em sistemas complexos de isenta de células baseadas em lysato.

Cromatografia líquida acoplada ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para perfil metabólito em sistemas livres de células baseadas em lysato

De gases de combustão das usinas é um barato CO 2 fonte para o crescimento de algas. Nós construímos "gás de combustão para cultivo de algas" protótipo sistemas e descreveu como para ampliar o processo de cultivo de algas. Demonstrámos a utilização de um modelo bio-reacção de transferência de massa para simular e conceber o funcionamento óptimo do gás de combustão para o crescimento de Chlorella sp. em algas foto-biorreatores.

Otimizar Configurações de gases de combustão para promover o crescimento de microalgas em fotobiorreatores via simulações de computador

Aprenda análise metabolômica de cevada por cromatografia gasosa/espectrometria de massas para estudar os efeitos da seca na agricultura. Este método melhora a identificação de compostos e contribui para a segurança alimentar.

Análise Metabolômica de Cevada por Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas

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