Análise Metabolômica de Cevada por Cromatografia Gasosa/Espectrometria de Massas

O objetivo desta pesquisa é abordar os efeitos da seca na agricultura. À medida que o clima continua a mudar, há um aumento da seca, e a seca afeta a segurança alimentar. A metabolômica é importante para identificar e quantificar o impacto que a seca tem em nossos alimentos.

Um grande desafio na metabolômica é atingir um alto nível de certeza dos compostos identificados. Ao usar metoxiamina em vez de hidroxilamina na etapa de oximação, melhoramos a eficiência da etapa de sililação subsequente, pois o grupo metoxi não reagirá com o MSTFA. Os métodos atuais para observar as respostas das plantas ao estresse ambiental concentram-se em processos ou tecidos específicos.

Enquanto este método é mais integrativo ao detectar sinais químicos no produto final do grão. No futuro, gostaríamos de usar esse método para entender como a seca e o consórcio afetam a cevada. A cevada é um grão importante para a segurança alimentar e queremos entender como as mudanças climáticas a afetarão.

Para começar, coloque 200 miligramas de farinha de cevada em um reservatório de solvente de extração em fase sólida, ou SPE. Mergulhe a farinha com 200 microlitros de metanol por 20 minutos para macerar. Remover o metanol por evaporação sob vácuo durante 30 minutos.

Após a secagem, conecte a coluna a um coletor de vácuo. Extrair componentes não polares da fracção A com diclorometano para um frasco de 10 ml e colocar o colector de vácuo até a farinha secar. Em seguida, adicione uma mistura de metanol e água deionizada para extrair a fração B dos componentes polares em um frasco de 10 mililitros.

Ligue o coletor de vácuo até que a farinha esteja seca. Adicione o padrão 1 e o padrão 2 à fração A e misture por pipetagem repetida. Evaporar totalmente o solvente sob pressão reduzida usando um evaporador rotativo.

Em seguida, dissolva novamente a amostra em éter metil terc-butílico, ou MTBE, antes de adicionar metanol e metóxido de sódio ao frasco. Deixar a transesterificação prosseguir durante 90 minutos à temperatura ambiente sob agitação magnética. Adicione ácido clorídrico aquoso à solução.

Misturar a solução acidificada com diclorometano. Recolha o conteúdo do frasco com uma pipeta Pasteur longa e deixe as fases separarem-se na pipeta. Lave a fase orgânica adicionando ácido clorídrico aquoso.

Novamente, colete o conteúdo do frasco com uma pipeta Pasteur longa e deixe as fases se separarem na pipeta. Transferir a fase orgânica inferior para um novo frasco e evaporar até à secura utilizando um evaporador rotativo. Em seguida, adicione sulfato de sódio anidro a uma coluna SPE.

Dissolver a amostra evaporada em diclorometano e colocá-la na coluna SPE. Eluir a fração 1 com três porções de n-hexano e MTBE em um frasco de 10 mililitros. Evaporar a solução contendo a fração 1 até a secura em um evaporador rotativo.

Dissolva novamente a amostra em n-hexano e transfira-a para um frasco de amostrador automático para GC/MS. Em seguida, eluir a pré-fração 2 da coluna SPE com três porções subsequentes de n-hexano e MTBE em um frasco de 10 mililitros. Depois de evaporar a pré-fração 2 até a secura, dissolva-a novamente em piridina anidra e adicione MSTFA.

Usando braçadeiras, prenda uma luva nitro sobre a ponta de uma seringa com o êmbolo removido. Encha o balão com argônio anidro e coloque uma agulha descartável na seringa. Empurrar a seringa em balão através do septo do frasco que contém o reagente anidro e inserir uma segunda seringa com uma agulha longa para aspirar o solvente.

Lave o frasco de amostra com um jato suave de argônio anidro. Depois de selar o frasco com parafilme, coloque-o em um banho de óleo a 70 graus Celsius por 15 minutos. Após a sililação, arrefecer a fração 2 à temperatura ambiente durante cinco minutos e colocá-la num frasco para injetáveis com amostrador automático.

Adicionar os padrões 3 e 4 à fração B e misturar por pipetagem repetida. Transfira dois e quatro mililitros da mistura da fração B para um novo frasco para processar na fração 3 e na fração 4, respectivamente. Evaporar a pré-fracção 3 até à secura num evaporador rotativo, seguida de coevaporação com piridina anidra.

Dissolver novamente a pré-fracção 3 em piridina anidra e adicionar trimetilsililimidazol. Lave o frasco de amostra com um jato suave de argônio anidro. Depois de selar o frasco de amostra com parafilme, aqueça por 20 minutos em um banho de óleo a 70 graus Celsius.

Depois de resfriar a solução à temperatura ambiente, adicione n-hexano e água deionizada. Agitar a mistura e transferir a fase orgânica superior para um frasco para injetáveis com um amostrador automático utilizando uma pipeta Pasteur longa. Evaporar a pré-fracção 4 até à secura num evaporador rotativo, seguido de coevaporação com piridina anidra.

Dissolver novamente a amostra em piridina anidra e adicionar cloridrato de metoxilamina. Depois de lavar o frasco com argônio anidro, oxamato o frasco selado com parafilme por 30 minutos em um banho de óleo a 70 graus Celsius. Assim que o frasco for resfriado à temperatura ambiente, adicione MSTFA e sililato por 20 minutos em banho de óleo.

Em seguida, adicione n-hexano e água deionizada no frasco e colete a fase aquosa inferior usando uma pipeta Pasteur longa. Após a última lavagem, evaporar a fase aquosa até à secura utilizando um evaporador rotativo e, em seguida, coevaporar o material restante com acetonitrilo anidro. Dissolver novamente a amostra em acetonitrilo anidro e em ácido monocloromantilo.

Depois de lavar o frasco com argônio anidro, aqueça o frasco selado por 60 minutos em um banho de óleo a 70 graus Celsius. Carregue as amostras no GC/MS usando os volumes de injeção especificados. Execute as amostras com um fluxo dividido de 14 mililitros por minuto de hélio a uma temperatura de injeção de 250 graus Celsius.

Para as frações 1 e 2, aumente a temperatura da coluna de 100 para 300 graus Celsius a uma taxa de 4 graus Celsius por minuto. Depois de atingir 300 graus Celsius, mantenha a temperatura por 10 minutos. Para a fração 3, aqueça e mantenha a coluna a 300 graus Celsius durante toda a corrida.

Para a fração 4, aumente a temperatura da coluna de 70 para 142 graus Celsius a 2,5 graus Celsius por minuto. Mantenha a temperatura em 142 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, aumente a temperatura de 142 para 235 graus Celsius a 4 graus Celsius por minuto, mantendo por 10 minutos.

Por fim, asse a coluna a 320 graus Celsius por 8 minutos.