Name: Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Aprenda um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores em matriz de colágeno 3D usando células H1299 e macrófagos humanos primários. Este método permite investigar a interação entre células imunes e câncer.

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<meta charset="utf8"></head><body>Examinando as interações esferoides macrófagos-tumor em uma configuração de matriz de colágeno 3D

<ol><li>Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+shapes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemTexts%22%5BJournal%5D)">Macrophages: shapes and functions.</a> ChemTexts. 8 (2), 12(2022).</li>
<li>Dallavalasa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor+associated+macrophages+%28TAMs%29+in+cancer+progression%2C+chemoresistance%2C+angiogenesis+and+metastasis+-+Current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status.</a> Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).</li>
<li>Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages in tumor immunity.</a> Front Immunol. 11, 583084(2020).</li>
<li>Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization+States+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).</li>
<li>Wenzel, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+transfer+of+cancer+cell+invasiveness+via+endosome-mediated+protease+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding.</a> Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).</li>
<li>Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).</li>
<li>Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF16B+drives+MT1-MMP+recycling+in+macrophages+and+promotes+co-invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells.</a> Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+insights+and+therapeutic+intervention+of+tumor+metastasis%3A+latest+developments+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).</li>
<li>Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+morphological+changes+of+neuroblastoma+cells+in+response+to+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices.</a> Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. 160, e61392(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>15 &micro;-Angiogênese de lâminas&nbsp;</td><td>ibidi</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Faloidina&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>CD14 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagen I Rat Tail&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Anprotec</td><td>MS01Y71003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Bio& Célula</td><td>FBS. S 0613</td><td></td></tr><tr><td>Fiji&nbsp;</td><td>NIH</td><td>ImageJ 2 Versão: 2.3.0/1.53s</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído 37%&nbsp;</td><td>252549-500ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>H1299-GFP linha</td><td></td><td></td><td></td>celular</tr><tr><td>Albumina sérica humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5843</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 X</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>l-glutamina&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Meio de Separação de Linfócitos (LSM) 1077</td><td>Colunas PromoCell</td><td>C-44010</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>aminoácidos não essenciais&nbsp;</td>Caneta <td>11140050</td><td></td> <td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>81275-034</td><td></td></tr><tr><td>TC-Platte 96 Well, BIOFLOAT, R&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>83,39,25,400</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENE 2&nbsp;</td><td>Indústrias Científicas</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

A Figura 1 mostra um esferóide H1299-GFP fotografado nos respectivos dias de incubação em uma matriz de colágeno I. Uma respectiva imagem de campo claro, tirada no dia 0, também mostra os macrófagos humanos primários cocultivados com o esferóide. A imagem representativa registrada no dia 3 do experimento é ampliada após o processamento. Diferentes parâmetros que podem ser analisados são indicados, incluindo o número de células invasoras, locais de invasão coletiva e perímetro esferóide. A tabela incluída mostra os resultados obtidos com esta imagem. O número de sinais detectados corresponde à impressão visual. Nenhuma interrupção do esferóide central é visível, indicando invasão real de células cancerígenas individuais, em vez de células derivadas de detritos esferoides. Os resultados de diferentes esferóides e condições agora podem ser comparados por meio de análise estatística.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67374/67374fig01.jpg"> 
Figura 1: Resultados representativos. (Painel superior) Esferóide H1299-GFP fotografado no dia 0, dia 1, dia 2 e dia 3 de incubação em uma matriz de colágeno I. (Painel central esquerdo) Uma imagem de campo claro do esferóide mostrando os macrófagos humanos primários cocultivados. (Painel central direito) Uma imagem representativa adquirida no dia 3 ampliada após o processamento, mostrando os diferentes parâmetros que podem ser analisados (perímetro esferóide em vermelho; traçado manualmente para melhor visualização). (Painel inferior) Os resultados obtidos a partir da imagem no painel central direito. Nota: Os macrófagos não são visíveis, pois apenas o canal GFP foi registrado para elucidar o comportamento das células cancerígenas. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67374/67374fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>

Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Queremos investigar a interação entre câncer e células imunes para entender melhor como elas interagem durante a metástase. Na maioria dos casos, os modelos in vivo são a maneira rotineira de buscar questões de pesquisa sobre a invasão 3D de células cancerígenas no contexto do sistema imunológico, ou componentes isolados do sistema estão em foco. Um método que permite a análise do comportamento celular que imita a complexidade da situação in vivo, mas permite uma manipulação mais direta de características ambientais específicas ao microscópio.Demonstramos que as células cancerígenas inalteradas devem reduzir a invasão na matriz de colágeno I 3D quando são co-cultivadas junto com macrófagos que foram esgotados para a proteína motora KIF16B. Isso aponta para um papel da reciclagem impulsionada por KIF16B de proteínas de superfície de macrófagos no microambiente tumoral. Gostaríamos de continuar a aprimorar nosso método de forma a permitir a visualização da degradação da matriz na interface do contexto das células cancerígenas de macrófagos, obtendo assim uma melhor compreensão dos mecanismos degradativos e adesivos.Para começar, cultive células H1299 GFP com um meio de células cancerígenas em um frasco de cultura de células de 25 centímetros quadrados a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até atingirem 80% de confluência. Lave as células uma vez com DPBS e adicione um mililitro de tripsina-EDTA por dois a três minutos até que as células estejam separadas. Pare a reação enzimática adicionando dois mililitros de meio de células cancerígenas.Em seguida, centrifugar a suspensão de células destacadas num tubo de 15 mililitros a 245 G durante cinco minutos. Remova o sobrenadante contendo solução de tripsina antes de lavar o pellet com cinco mililitros de DPBS. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de células cancerígenas.Conte as células usando uma câmara de Neubauer. Transfira 8.000 células para uma placa de adesão ultrabaixa de 96 poços em um volume final de 25 microlitros de meio de células cancerígenas. Incube as células por três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Após três dias, verifique a uniformidade dos esferóides ao microscópio. Depois de coletar a amostra de sangue humano, transfira 20 mililitros de sangue de uma bolsa de transfusão para um tubo de reação de 50 mililitros. Adicione 15 mililitros de meio de separação de linfócitos em um novo tubo de 50 mililitros.Transfira cuidadosamente 20 mililitros de sangue para o tubo contendo o meio de separação de linfócitos sem misturar e centrifugue a mistura a 450 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Durante a centrifugação, adicione 10 mililitros de RPMI 1640 Medium frio em um novo tubo de 50 mililitros. Após a centrifugação, transfira a fase branca densa do tubo contendo sangue para o tubo contendo RPMI preparado e encha-o até 50 mililitros com RPMI frio.Centrifugar a suspensão a 450 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de RPMI frio e encha-o até 50 mililitros com RPMI 1640. Centrifugue novamente a mistura e suspenda novamente o pellet em 50 mililitros de RPMI.Novamente, centrifugue a amostra e ressuspenda o pellet celular em 1,5 mililitros de tampão de monócitos frio. Em seguida, adicione 250 microlitros de MicroBeads anti-CD14 na suspensão celular e incube por 15 minutos no gelo. Durante a incubação, prepare uma coluna de separação conectando um filtro a um rack separador magnético.Adicione 900 microlitros de tampão de monócitos na coluna para equilibrar. Após a incubação, despeje a suspensão de células no filtro e deixe-a fluir por gravidade para um tubo de resíduos. Adicione um mililitro de tampão de monócitos para lavar a coluna que contém as células ligadas a esferas magnéticas.Substitua o tubo de resíduos sob a coluna por um novo tubo de 50 mililitros contendo 20 mililitros de RPMI. Adicione três mililitros de tampão de monócitos à coluna. Remova a coluna do suporte magnético e prenda o carimbo.Pressione as células no tubo preparado de 50 mililitros e encha-o até 30 mililitros com RPMI. Conte as células usando uma câmara de contagem de Neubauer sob um microscópio óptico e ajuste o número de células para duas vezes 10 elevado à potência de seis células por mililitro com RPMI. Semeie um mililitro de suspensão celular em cada poço de uma câmara de seis poços e incube por duas a quatro horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Após a incubação, verifique se as células aderiram corretamente e substitua o RPMI por 1,5 mililitros de monomeio. Continue a incubação por até seis dias até que os monócitos se diferenciem em macrófagos. Depois de derivar macrófagos humanos primários das amostras de sangue do doador em uma placa de seis poços, adicione 500 microlitros de Accutase e incube por 40 minutos para separar os macrófagos.Em seguida, adicione 500 microlitros de meio e transfira para um tubo de centrífuga de 15 mililitros para centrifugação. Em seguida, lave as células uma vez com dois mililitros de DPBS e conte-as com uma câmara de Neubauer. Dilua o número desejado de macrófagos em 40 microlitros de colágeno que misturo e faça um vórtice breve no tubo.Para lavar os esferoides, adicione 300 microlitros de DPBS nos poços de uma placa de 96 poços. Use uma ponta de pipeta azul de um mililitro com uma extremidade cortada para coletar o esteróide com DPBS. Assim que o esteróide se acomodar na ponta, empurre brevemente a pipeta para o fundo da câmara de imagem para transferir o esteróide tumoral por tensão superficial.Remova o máximo possível de DPBS residual transferido com o esteróide. Adicione rapidamente 40 microlitros de mistura de macrófagos de colágeno I na câmara de imagem contendo esteróide. Incube a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em condições úmidas para polimerizar totalmente a mistura de colágeno.Após a polimerização, adicione cuidadosamente 25 microlitros de meio de células cancerígenas a cada poço e continue a incubação por três dias. Visualize a amostra viva usando um microscópio de varredura a laser nos pontos de tempo desejados. A área do esferóide H1299 GFP foi medida em 40.307 micrômetros quadrados no terceiro dia de invasão, enquanto o perímetro do esferóide foi de 1700,17 micrômetros, indicando crescimento ao longo do tempo.Foi observada uma invasão coletiva de células cancerígenas do esferóide. 51 partículas isoladas foram identificadas, servindo como um indicador de invasão individual de células cancerígenas. O esferóide manteve uma proporção de 1,10 e uma circularidade de 0,18, mostrando baixa deformação.

a-macrophage-tumor-spheroid-co-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Um ensaio para medir quantitativamente Transforming Growth Factor (TGF)-β induzida por invasão em gel 3-dimensional colágeno é descrito. Este ensaio se aproveita da série MCF10A de linhas de células, que representam diferentes fases de desenvolvimento de câncer de mama. Este método pode ser adotado para ser usado com outras linhagens de células e pode ser usado para investigar outras possíveis ativadores ou inibidores de invasão.

Ensaio esferóide para TGF-β Medida induzida Invasion

Este vídeo demonstra um método para estabelecer uma co-cultura tridimensional de esferóides tumorais e células T. Um molde de agarose com micropoços contendo esferóides tumorais é preparado, seguido pela adição de células T. Após a incubação, essa configuração permite estudar a interação das células T com os esferoides tumorais em um ambiente tridimensional controlado.

Um modelo tridimensional de co-cultura de células T infiltrantes em esferoides tumorais

A invasão dos tecidos normais circundantes é uma característica definidora dos tumores malignos. Fornecemos aqui um ensaio simples e semi-automatizado de microplacas de invasão em uma biomatriz 3D natural que foi exemplificada com vários modelos de cânceres humanos avançados.

Tridimensional (3D) Tumor Esferóide Invasion Assay

Este método avalia a invasão de células cancerígenas de esferóides em uma matriz 3D circundante.  Os esferoides são gerados através do método de cultura de gota suspensa e, em seguida, incorporados em uma matriz composta de materiais de membrana basal e colágeno tipo I.  A invasão dos esferóides é posteriormente monitorada.

A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

Compreender o comportamento maligno do câncer requer a criação de modelos precisos de como as células tumorais interagem com componentes do microambiente tumoral, como macrófagos. Aqui descrevemos dois métodos para estudar a interação das células de glioblastoma com macrófagos associados a tumores e micróglia, onde o efeito na invasão do glioblastoma é avaliado.

Co-cultura Ensaios para estudar macrófagos e Microglia Estimulação do Glioblastoma Invasion

O microambiente tumoral é uma parte essencial do crescimento e invasão do câncer. Para imitar a progressão da carcinoma, uma matriz humana biologicamente relevante é necessária. Este protocolo introduz uma melhoria para in vitro o ensaio tridimensional da invasão do esferóide aplicando uma matriz leiomyoma-baseada humana. O protocolo também introduz uma análise de invasão de células baseada em computador.

Matriz tumor-baseada inteiramente humana no ensaio tridimensional da invasão de spheroid

Este artigo representa um ensaio in vitro útil para avaliar a capacidade do meio condicionado das células tumorais para atrair macrófagos.

Ensaio in vitro para estudo do tumor-interação macrófago

O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro 3D para estudar a diferenciação de fibroblastos Cancer-associados (CAFs) em um tumor a granel-como o ambiente, que pode ser abordado em diferentes sistemas de análise, tais como a imunofluorescência, transcricional análise e imagens de células de vida.

Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Aqui, apresentamos um método usando suportes de membrana permeáveis para facilitar o estudo da sinalização paracrina sem contato usada pelas células tumorais para suprimir a resposta imune. O sistema é passível de estudar o papel dos fatores tumorados no amortecimento da ativação do macrófago.

Estudando os efeitos dos ligantes paracrinos tumorais na ativação do macrófago usando a co-cultura com suportes permeáveis da membrana

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de um dispositivo de imagem esferoide. Este dispositivo permite imagens de fluorescência dinâmica ou longitudinal de esferoides de células cancerosas. O protocolo também oferece um simples procedimento de processamento de imagem para a análise da invasão de células cancerosas.

Imagem e análise de fluorescência resolvidas no modelo 3D spheroid

Aprenda um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores em matriz de colágeno 3D usando células H1299 e macrófagos humanos primários. Este método permite investigar a interação entre células imunes e câncer.

Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

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