Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

Queremos investigar a interação entre câncer e células imunes para entender melhor como elas interagem durante a metástase. Na maioria dos casos, os modelos in vivo são a maneira rotineira de buscar questões de pesquisa sobre a invasão 3D de células cancerígenas no contexto do sistema imunológico, ou componentes isolados do sistema estão em foco. Um método que permite a análise do comportamento celular que imita a complexidade da situação in vivo, mas permite uma manipulação mais direta de características ambientais específicas ao microscópio.

Demonstramos que as células cancerígenas inalteradas devem reduzir a invasão na matriz de colágeno I 3D quando são co-cultivadas junto com macrófagos que foram esgotados para a proteína motora KIF16B. Isso aponta para um papel da reciclagem impulsionada por KIF16B de proteínas de superfície de macrófagos no microambiente tumoral. Gostaríamos de continuar a aprimorar nosso método de forma a permitir a visualização da degradação da matriz na interface do contexto das células cancerígenas de macrófagos, obtendo assim uma melhor compreensão dos mecanismos degradativos e adesivos.

Para começar, cultive células H1299 GFP com um meio de células cancerígenas em um frasco de cultura de células de 25 centímetros quadrados a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até atingirem 80% de confluência. Lave as células uma vez com DPBS e adicione um mililitro de tripsina-EDTA por dois a três minutos até que as células estejam separadas. Pare a reação enzimática adicionando dois mililitros de meio de células cancerígenas.

Em seguida, centrifugar a suspensão de células destacadas num tubo de 15 mililitros a 245 G durante cinco minutos. Remova o sobrenadante contendo solução de tripsina antes de lavar o pellet com cinco mililitros de DPBS. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de células cancerígenas.

Conte as células usando uma câmara de Neubauer. Transfira 8.000 células para uma placa de adesão ultrabaixa de 96 poços em um volume final de 25 microlitros de meio de células cancerígenas. Incube as células por três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após três dias, verifique a uniformidade dos esferóides ao microscópio. Depois de coletar a amostra de sangue humano, transfira 20 mililitros de sangue de uma bolsa de transfusão para um tubo de reação de 50 mililitros. Adicione 15 mililitros de meio de separação de linfócitos em um novo tubo de 50 mililitros.

Transfira cuidadosamente 20 mililitros de sangue para o tubo contendo o meio de separação de linfócitos sem misturar e centrifugue a mistura a 450 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Durante a centrifugação, adicione 10 mililitros de RPMI 1640 Medium frio em um novo tubo de 50 mililitros. Após a centrifugação, transfira a fase branca densa do tubo contendo sangue para o tubo contendo RPMI preparado e encha-o até 50 mililitros com RPMI frio.

Centrifugar a suspensão a 450 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius e rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de RPMI frio e encha-o até 50 mililitros com RPMI 1640. Centrifugue novamente a mistura e suspenda novamente o pellet em 50 mililitros de RPMI.

Novamente, centrifugue a amostra e ressuspenda o pellet celular em 1,5 mililitros de tampão de monócitos frio. Em seguida, adicione 250 microlitros de MicroBeads anti-CD14 na suspensão celular e incube por 15 minutos no gelo. Durante a incubação, prepare uma coluna de separação conectando um filtro a um rack separador magnético.

Adicione 900 microlitros de tampão de monócitos na coluna para equilibrar. Após a incubação, despeje a suspensão de células no filtro e deixe-a fluir por gravidade para um tubo de resíduos. Adicione um mililitro de tampão de monócitos para lavar a coluna que contém as células ligadas a esferas magnéticas.

Substitua o tubo de resíduos sob a coluna por um novo tubo de 50 mililitros contendo 20 mililitros de RPMI. Adicione três mililitros de tampão de monócitos à coluna. Remova a coluna do suporte magnético e prenda o carimbo.

Pressione as células no tubo preparado de 50 mililitros e encha-o até 30 mililitros com RPMI. Conte as células usando uma câmara de contagem de Neubauer sob um microscópio óptico e ajuste o número de células para duas vezes 10 elevado à potência de seis células por mililitro com RPMI. Semeie um mililitro de suspensão celular em cada poço de uma câmara de seis poços e incube por duas a quatro horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.

Após a incubação, verifique se as células aderiram corretamente e substitua o RPMI por 1,5 mililitros de monomeio. Continue a incubação por até seis dias até que os monócitos se diferenciem em macrófagos. Depois de derivar macrófagos humanos primários das amostras de sangue do doador em uma placa de seis poços, adicione 500 microlitros de Accutase e incube por 40 minutos para separar os macrófagos.

Em seguida, adicione 500 microlitros de meio e transfira para um tubo de centrífuga de 15 mililitros para centrifugação. Em seguida, lave as células uma vez com dois mililitros de DPBS e conte-as com uma câmara de Neubauer. Dilua o número desejado de macrófagos em 40 microlitros de colágeno que misturo e faça um vórtice breve no tubo.

Para lavar os esferoides, adicione 300 microlitros de DPBS nos poços de uma placa de 96 poços. Use uma ponta de pipeta azul de um mililitro com uma extremidade cortada para coletar o esteróide com DPBS. Assim que o esteróide se acomodar na ponta, empurre brevemente a pipeta para o fundo da câmara de imagem para transferir o esteróide tumoral por tensão superficial.

Remova o máximo possível de DPBS residual transferido com o esteróide. Adicione rapidamente 40 microlitros de mistura de macrófagos de colágeno I na câmara de imagem contendo esteróide. Incube a placa por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono em condições úmidas para polimerizar totalmente a mistura de colágeno.

Após a polimerização, adicione cuidadosamente 25 microlitros de meio de células cancerígenas a cada poço e continue a incubação por três dias. Visualize a amostra viva usando um microscópio de varredura a laser nos pontos de tempo desejados. A área do esferóide H1299 GFP foi medida em 40.307 micrômetros quadrados no terceiro dia de invasão, enquanto o perímetro do esferóide foi de 1700,17 micrômetros, indicando crescimento ao longo do tempo.

Foi observada uma invasão coletiva de células cancerígenas do esferóide. 51 partículas isoladas foram identificadas, servindo como um indicador de invasão individual de células cancerígenas. O esferóide manteve uma proporção de 1,10 e uma circularidade de 0,18, mostrando baixa deformação.