Name: Imagem de microscopia de epifluorescência de lapso de tempo de fenótipos heterogêneos de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a visualizar células persistentes de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus usando microscopia de epifluorescência em lapso de tempo. Este método revela estratégias de sobrevivência bacteriana ao tratamento antibiótico.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualizando a persistência de antibióticos em patógenos bacterianos

<ol><li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+between+resistance%2C+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nat Rev Microbiol. 14, 320-330 (2016).</li>
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<li>Verstraete, L., Van den Bergh, B., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecology+and+evolution+of+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Ecology and evolution of antibiotic persistence.</a> Trends Microbiol. 30 (5), 466-479 (2021).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nat Commun. 8, 14836(2017).</li>
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<li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oufti%3A+an+integrated+software+package+for+high-accuracy%2C+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Mol Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).</li>
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<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+chemostat%3A+an+agarose-based%2C+microfluidic+device+for+high-throughput%2C+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>BaSiC</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/marrlab/BaSiC</td><td></td></tr><tr><td>Certified Molecular Biology Agarose</td><td>Biorad</td><td>1613101</td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td><td></td></tr><tr><td>Prato de Cobertura de Vidro Intercambiável</td><td>Bioptechs</td><td>190310-35</td><td>CDI de 35 mm para preparação de almofadas de agarose; vem com lamínulas de</td></tr> <tr><td>30 mm (# 1,5)Lumencor Spectra 7 Motor de luz LED</td><td>Lumencor</td><td>https://lumencor.com/products/spectra-light-engine</td><td>Spectra 7 Motor de luz LED</td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>Versão Premier 7.10.5</td><td></td></tr><tr><td>pco.edge 4.2 bi câmera sCMOS</td><td>Excelitas</td><td>https://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camera</td><td>câmera sCMOS</td></tr><tr><td>PeCon câmara de incubação de células vivas</td><td>peCon</td><td>https://www.pecon.biz/</td><td></td></tr> <tr><td>Thomas Scientific Vidro de cobertura redondo, espessura #1.5, 25 mm, pacote de 100</td> lamínulas <td>Fisher Scientific</td><td>NC1272770</td><td>25 mm (#1.5) microscópio</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.html</td><td>Microscópio invertido com objetiva Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27, mecanismo de luz LED Lumencor Spectra 7 e câmera pco.edge 4.2 bi sCMOS (tamanho de pixel de 6,5 mm)</td></tr></tbody></table>

imagem de microscopia de epifluorescência de lapso de tempo de fenótipos heterogêneos de pseudomonas aeruginosa e staphylococcus aureus

Time-Lapse Epifluorescence Microscopy Imaging of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Heterogeneous Phenotypes

A introdução bem-sucedida de plasmídeos repórteres em P. aeruginosa e S. aureus é indicada pelo crescimento nos antibióticos seletivos corretos e pode ser confirmada por PCR e/ou sequenciamento de colônias. As cepas modificadas devem ser verificadas como repórteres fenotípicas, submetendo-as a condições nas quais o gene de interesse é conhecido por ser induzido, e a fluorescência resultante pode ser medida por citometria de fluxo, espectrofotometria ou microscopia de epifluorescência (Figura 1).
Para facilitar a seleção de uma dose de antibiótico que será usada para experimentos subsequentes, realizar ensaios de persistência de antibióticos dependentes da concentração para as cepas de P. aeruginosa ou S. aureus de interesse. Os ensaios dependentes da concentração geralmente resultam em uma curva bifásica com uma inclinação inicial acentuada em concentrações mais baixas de antibióticos e um platô ou inclinação menos acentuada em concentrações mais altas. No entanto, para alguns pares de espécies de antibióticos, uma curva bifásica distinta pode não resultar. Por exemplo, a curva para S. aureus delafloxacino é claramente bifásica (Figura 3A), mas a curva de P. aeruginosa levofloxacino não é (Figura 3B)15. Nesse cenário, escolheríamos uma concentração que fosse pelo menos 10x a CIM (por exemplo, 5 μg/mL, que é cerca de 15x a CIM para P. aeruginosa)15. No entanto, como 15x levofloxacina MIC resulta em apenas ~ 0,001% de sobreviventes de P. aeruginosa , usamos 1 μg / mL de tratamento com levofloxacina se quisermos ver persistentes ao fazer imagens de células à medida que se recuperam em almofadas de agarose sem antibióticos (Vídeo Suplementar 6); caso contrário, o número de campos de visão necessários para criar imagens de vários persistentes se tornará proibitivo.
No início da imagem, a amostra ideal e a preparação da almofada de agarose devem parecer planas em todo o campo de visão, livres de grandes detritos, rugas ou bolhas de ar e com células únicas distribuídas uniformemente. A obtenção de células individuais bem distribuídas pode exigir a otimização da diluição ou ressuspensão da amostra. Para S. aureus, as células tendem a formar pequenos aglomerados e precisam ser completamente reviradas antes de se semearem na almofada de agarose (Figura 4 e Figura 5). Para P. aeruginosa, as células podem formar agregados envoltos em uma matriz extracelular pegajosa em suspensão; É necessário pipetar completamente essas amostras e interromper os agregados para obter imagens de células individuais. 
Após a conclusão de um experimento de imagem, um lapso de tempo bem-sucedido de imagens aparecerá em foco, iluminado de forma estável e com desvio mínimo no plano x-y durante todo o experimento. O Vídeo Suplementar 7 representa uma aquisição de imagem ideal: t é o canal de fase do Vídeo Suplementar 4 antes da correção de sombra ou desvio. A perda de foco pode ocorrer se a condensação (devido à umidificação excessiva ou aquecimento insuficiente da amostra) fizer com que gotículas de água se formem na lamínula superior de 25 mm, distorcendo a luz e empurrando o plano focal para fora da faixa máxima de pesquisa do algoritmo de foco automático (Vídeo Suplementar 8). A variação na iluminação geralmente indica óleo de imersão insuficiente no momento da imagem. Se o estágio se mover muito rapidamente, o óleo na objetiva pode se arrastar para trás e ainda estar alcançando quando as imagens forem adquiridas. Isso pode ser atenuado ajustando os controles de aquisição para diminuir a velocidade do movimento ou adicionando uma pausa entre o movimento para a próxima posição e a aquisição da imagem. A grande deriva da amostra parecerá muitas células cruzando o campo de visão, enquanto algumas permanecem no lugar (Vídeo Suplementar 9). Isso geralmente ocorre mais tarde em experimentos porque a almofada de agarose desidratou devido ao controle insuficiente da umidade. A preparação da almofada de agarose apresentada neste artigo foi projetada para facilitar a estabilidade da amostra, mas aquecer/umidificar adequadamente a amostra e seu ambiente circundante é necessário para a aquisição ideal da imagem.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig1.jpg"> 
Figura 1: Cepas repórteres fluorescentes iluminam a expressão de um gene de interesse. (A) S. aureus foi transduzido com um repórter transcricional GFP para um gene de interesse de acordo com o Protocolo 1. A cepa repórter foi tratada por 24 h com antibiótico, lavada com PBS e, em seguida, semeada em uma almofada de agarose feita de CA-MHB mais iodeto de propídio (1,6 μM) e cloranfenicol (10 μg / mL para manutenção do plasmídeo repórter) para imagens durante a recuperação (Vídeo Suplementar 1). (B) P. aeruginosa foi transformada com um plasmídeo contendo um repórter translacional ligado a mScarlet para uma proteína de interesse26. A cepa repórter foi tratada por 5 h com antibiótico, lavada com PBS e, em seguida, semeada em uma almofada de agarose feita de BSM mais Tet (75 μg / mL; para manutenção do plasmídeo repórter) para imagens durante a recuperação (Vídeo Suplementar 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig2.jpg"> 
Figura 2: Propagação e colheita de bacteriófago. (A) As seis placas mostram seis quantidades diferentes de estoque de fagos diluídos nos gramados de S. aureus RN4220. Os contornos vermelhos indicam as três placas que seriam colhidas, desde a placa com mais clareira (contorno vermelho em negrito; 1 x109 PFU/mL) até as próximas duas diluições (1 x108 e 1 x 107 PFU/mL). As setas pretas apontam para placas individuais. (B) Para colher o fago das placas, raspe a camada de ágar mole (esquerda), transfira a pasta para a próxima placa de diluição (centro) e, depois de agrupar o ágar mole de todas as três placas, misture em um tubo cônico para centrifugação (direita). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig3.jpg"> 
Figura 3: Ensaios de persistência dependentes da concentração representativa. A persistência da fluoroquinolona dependente da concentração foi avaliada na fase estacionária (A) S. aureus (contra delafloxacina) e (B) P. aeruginosa (contra levofloxacina). Experimentos subsequentes utilizaram 5 μg / mL de delafloxacina (círculo vermelho) porque a morte de S. aureus se estabilizou nessa concentração. Uma dosagem de pelo menos 1 μg/mL de levofloxacina (círculo vermelho) seria utilizada para experimentos subsequentes com P. aeruginosa. Observe que a morte bacteriana não se estabiliza para P. aeruginosa, mas ainda há uma "segunda fase" menos íngreme da curva bifásica que indica uma subpopulação persistente. O Painel 3B foi adaptado com permissão de Hare et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig4.jpg"> 
Figura 4: Fenótipos bacterianos de imagem durante o tratamento com antibióticos. Células de fase estacionária (A) de S. aureus e (B) aeruginosa foram semeadas em almofadas de agarose contendo antibióticos fluoroquinolonas e monitoradas durante o tratamento: 5 μg/mL de delafloxacina para S. aureus (Vídeo Suplementar 3) e 5 μg/mL de levofloxacino para P. aeruginosa (Vídeo Suplementar 4)15. O iodeto de propídio (PI; 16 μM para P. aeruginosa, 1,6 μM para S. aureus) foi adicionado às almofadas para marcar células mortas ou moribundas. As células de S. aureus permanecem praticamente intactas e vivas na presença do FQ, enquanto a maioria das células de P. aeruginosa sofre mudanças morfológicas drásticas, incluindo a formação de esferoplastos redondos, antes de se lisar e morrer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig5.jpg"> 
Figura 5: Rastreamento de persistentes durante a recuperação. (A) As populações de S. aureus e (B) P. aeruginosa foram semeadas em almofadas de agarose contendo meio fresco após terem sido tratadas com fluoroquinolonas (5 μg/mL de delafloxacina para S. aureus e 1 μg/mL de levofloxacina para P. aeruginosa) e monitoradas durante a recuperação pós-tratamento (Vídeo Suplementar 5 e Vídeo Suplementar 6). As periirmãs vistas são indicadas com setas verdes nos dois primeiros quadros de cada painel, e permaneceram intactas e viáveis durante o tratamento com antibióticos. Após um período inicial de defasagem, os persistentes começaram a se dividir e deram origem a uma nova progênie (indicada com círculos verdes). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67617/67617fig6.jpg"> 
Figura 6: Preparação da amostra do microscópio. (A) Esquema do fluxo de trabalho de preparação da amostra usando um prato de lamínula intercambiável ("câmara"). (B) Imagem da câmara desmontada e seus componentes individuais. (C) Foto da câmara totalmente montada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/67617fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo Suplementar 1: S. aureus persister. Arquivo de vídeo contendo as imagens na Figura 1A. Em resumo, S. aureus portador de um repórter transcricional GFP para um gene de interesse foi tratado por 24 h com antibiótico, lavado com PBS e, em seguida, semeado em uma almofada de agarose feita com CA-MHB mais iodeto de propídio (1,6 μM) e cloranfenicol (10 μg / mL) para imagem durante a recuperação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS1_S-aureus_persister_video.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo Suplementar 2: P. aeruginosa persister. Arquivo de vídeo contendo imagens na Figura 1B. Em resumo, P. aeruginosa portadora de um repórter translacional ligado a mScarlet para uma proteína de interesse foi tratada por 5 h com antibiótico, lavada com PBS e, em seguida, semeada em uma almofada de agarose feita com BSM mais Tet (75 μg / mL) para imagem durante a recuperação26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS2_Paeru-fluorescent-persister.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo Suplementar 3: S. aureus durante o tratamento com antibióticos. Uma cultura de fase estacionária de S. aureus cultivada em meio quimicamente definido rico foi semeada em almofadas de agarose feitas a partir do meio condicionado livre de células da cultura com iodeto de propídio (1,6 μM) e delafloxacina (5 μg/mL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS3_S-aureus_treatment.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo Suplementar 4: P. aeruginosa durante o tratamento com antibióticos. Uma cultura de fase estacionária de P. aeruginosa cultivada em BSM foi semeada em almofadas de agarose feitas de meio condicionado livre de células de uma cultura de P. aeruginosa cultivada em BSM em paralelo; a almofada de agarose também continha iodeto de propídio (16 μM) e levofloxacina (5 μg/mL). Este vídeo foi adaptado com permissão de Hare et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS4_P-aeruginosa_treatment.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo Suplementar 5: S. aureus durante a recuperação pós-antibiótica. S. aureus foi cultivado até a fase estacionária em meios quimicamente definidos ricos. As culturas em fase estacionária foram tratadas com 5 μg/mL de delafloxacino em tubos de ensaio por 24 h, lavadas com PBS e, em seguida, semeadas em almofadas de agarose CA-MHB livres de antibióticos contendo iodeto de propídio (1,6 μM) para imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS5_S-aureus_recovery.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo Suplementar 6: P. aeruginosa durante a recuperação pós-antibiótica. Uma cultura em fase estacionária de P. aeruginosa cultivada em BSM foi tratada com 1 μg/mL de levofloxacina em tubos de ensaio por 7 h, lavada com PBS e, em seguida, semeada em almofadas de agarose BSM sem antibióticos contendo iodeto de propídio (16 μM) para imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS6_P-aeruginosa_recovery.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo Suplementar 7: Exemplo de aquisição de imagem ideal. Este vídeo é o canal de fase do Vídeo Suplementar 4 antes do processamento da imagem como um exemplo de uma aquisição de lapso de tempo ideal. Observe o desvio mínimo, a iluminação estável e a manutenção do foco durante todo o experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS7_uncorrected-Paeru.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo Suplementar 8: Exemplo de aquisição de imagem abaixo do ideal devido à condensação. Este vídeo mostra parte de um experimento em que a aquisição da imagem foi afetada por foco ruim, provavelmente devido à condensação na câmara devido ao aquecimento inadequado da amostra e/ou umidificação excessiva do ambiente de imagem. A amostra que está sendo fotografada foi P. aeruginosa tratada com levofloxacino durante a recuperação pós-antibiótica em uma almofada de agarose BSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS8_Suboptimal_Imaging_Condensation.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo Suplementar 9: Exemplo de aquisição de imagem abaixo do ideal devido ao desvio. Este vídeo mostra parte de um experimento em que a aquisição da imagem foi afetada pelo desvio da amostra, provavelmente devido à desidratação e ao encolhimento / levantamento da almofada de agarose da lamínula. A amostra que estava sendo fotografada era P. aeruginosa em uma almofada de agarose contendo levofloxacina e iodeto de propídio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/VideoS9_Suboptimal_Drift.avi" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Arquivo Suplementar 1: 25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67617/25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Imagem de microscopia de epifluorescência de lapso de tempo de fenótipos heterogêneos de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus

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time-lapse-epifluorescence-microscopy-imaging-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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