Imagem de microscopia de epifluorescência de lapso de tempo de fenótipos heterogêneos de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus

A pesquisa do nosso laboratório se concentra em por que os antibióticos falham. Em particular, estamos interessados nas poucas células chamadas persistentes nas populações bacterianas que supostamente devem ser mortas pelo antibiótico, mas podem sobreviver ao tratamento com antibióticos. E acredita-se que esses persistentes causem recaídas nas infecções após o término do tratamento com antibióticos.

Portanto, estamos interessados em observar a expressão gênica e o metabolismo desses persistentes para entender melhor suas estratégias de sobrevivência. O desafio atual para o campo persistente é equilibrar a taxa de transferência com a sensibilidade de uma única célula. Precisamos combinar a capacidade de uma única célula de se dividir após o tratamento, o que a qualificará como persistente, com algum fenótipo mensurável que possa nos ajudar a entender o funcionamento interno da célula.

E podemos ter que fazer isso para milhares de células para capturar até mesmo um único persistente. Nosso protocolo foi desenvolvido para ser facilmente implementado em comparação com métodos imprecisos de sanduíche de ágar ou fabricação de dispositivos microfluídicos, que podem ser tecnicamente desafiadores. Descobrimos que nosso protocolo produz imagens reprodutíveis e estáveis ao longo do tempo com materiais mínimos, o que significa que é econômico e um desperdício mínimo para a coleta de dados de qualidade.

Nossa pesquisa futura usará uma combinação de ômicas e abordagens de célula única para estudar como os patógenos respondem e se recuperam do tratamento com diferentes classes de antibióticos. Nosso objetivo final é alavancar esse entendimento para desenvolver novas estratégias para melhorar o tratamento de infecções clínicas. Para começar, coloque uma lamínula estéril de 30 milímetros na parte inferior da base de aço inoxidável de uma lamínula intercambiável.

Rosqueie suavemente a inserção de policarbonato na base, garantindo que a lamínula forme a base da câmara e sele-a no lugar comprimindo o O-ring de silicone anexado. Coloque um divisor impresso em 3D personalizado contra a lamínula de 30 milímetros para evitar que as células modais se contaminem cruzadamente. Prepare 1,5% de agarose em um tubo cônico de 50 mililitros usando o meio de sua escolha e agite suavemente para misturar.

Afrouxe a tampa do tubo cônico e coloque-o em um copo de vidro ou suporte próprio para micro-ondas. Microondas a mistura de agarose em fogo alto, parando a cada três a quatro segundos para girar e misturar para evitar borbulhar. Após um minuto, verifique se alguma agarose não derretida permanece na mistura.

Se estiver uniformemente límpido, deixe a agarose esfriar brevemente até cerca de 60 graus Celsius. Adicione os antibióticos ou matrizes relevantes e gire suavemente para misturar, evitando a formação de bolhas. Pipetar dois mililitros de agarose para a câmara com a lamínula de 30 milímetros.

Coloque delicadamente uma lamínula estéril de 25 milímetros sobre a agarose na abertura superior da câmara. Deixe a almofada solidificar por uma a duas horas. Quando a almofada estiver solidificada, use um marcador permanente de ponta fina para marcar os locais e identidades de cada amostra na lamínula de 25 milímetros.

Inverta a câmara de forma que o anel da base de aço inoxidável fique voltado para cima e segure cuidadosamente a inserção de policarbonato por baixo enquanto desrosqueia a base. Deixe a base de aço inoxidável de lado. Deslize a lamínula de 30 milímetros para fora da almofada de agarose e descarte-a.

Diluir as culturas de células de Pseudomonas aeruginosa ou Staphylococcus aureus em PBS até obter uma densidade esparsa adequada para a visualização de células individuais. Pipete vigorosamente para cima e para baixo para distribuir uniformemente as células. Localize cinco microlitros das suspensões de células diluídas nos locais marcados na almofada de agarose.

Depois que as manchas estiverem secas, coloque uma nova lamínula estéril de 30 milímetros sobre a almofada. Em seguida, segure a inserção de policarbonato com uma mão e repasse lentamente a base de aço inoxidável sobre a lamínula. Uma vez que a câmara esteja selada, verifique se a agarose está entrando em contato com a superfície da lamínula de 30 milímetros.

Usando a ponta romba da pinça, pressione suavemente contra a lamínula de 25 milímetros até que a agarose toque a lamínula de 30 milímetros uniformemente em sua superfície. Para começar, prepare os controles ambientais do microscópio e da câmara de imagem ajustando as temperaturas da incubadora superior da platina e da incubadora de câmara grande para 37 graus Celsius. Em seguida, ligue o umidificador da câmara.

Coloque uma almofada de agarose na incubadora superior do estágio e feche a câmara para permitir o equilíbrio. Prepare o software MetaMorph para aquisição de imagem configurando o algoritmo de foco automático integrado para usar o canal de fase durante a aquisição multidimensional. Na guia Estágio, defina várias posições de estágio para cada amostra, visando campos de visão com densidade de células distribuída uniformemente.

Em seguida, na guia Time-Lapse, configure a duração e a frequência para aquisição de imagens. Na guia Comprimentos de onda, defina os canais desejados para aquisição e ajuste os tempos de exposição com base na intensidade do sinal da amostra. Assim que a almofada de agarose estiver aquecida na câmara, coloque a tampa umidificadora no stage incubadora superior.

Em seguida, no microscópio, mude do contraste de fase para o modo de contraste de interferência diferencial. Ajuste o condensador e o diafragma de abertura para obter uma iluminação Kohler adequada. Depois de concluir os ajustes, volte para o modo de contraste de fase.

Navegue até cada posição do palco, ajuste o foco e redefina a posição do palco para o novo plano focal. Clique no botão Adquirir para iniciar a aquisição multidimensional. Após a aquisição, para compilar imagens, abra o MetaMorph e use o aplicativo Review Multidimensional Data para selecionar os canais ou comprimentos de onda desejados e incluir todos os pontos de tempo para cada posição do estágio.

Clique em Carregar imagens e salve cada compilação com seu respectivo nome de canal como um arquivo TIFF. A imagem de lapso de tempo das células de Staphylococcus aureus foi realizada mostrando coloração com iodeto de propídio à medida que o tratamento com antibióticos progredia, o que indicava danos à membrana. A imagem de pseudomonas aeruginosa durante o tratamento com antibióticos mostrou células que sofrem formação de esferoplastos, filamentação e condensação citoplasmática, acompanhadas de coloração com iodeto de propídio.

A preparação bem-sucedida da almofada de agarose e as condições de imagem permitiram a observação de Staphylococcus aureus se recuperando do tratamento com antibióticos e Pseudomonas aeruginosa se recuperando do tratamento com antibióticos para formar grandes aglomerados derivados de células únicas.