Infecção in vivo e in vitro de raízes de batata com nematóides parasitas de plantas para avaliação de alterações estruturais induzidas

O protocolo descreve a infecção de raízes de Solanum tuberosum com nematóides parasitas de plantas em condições de casa de vegetação in vivo e raízes transgênicas in vitro de batata para análise histoquímica da estrutura radicular por meio de microscopia óptica.

A pesquisa sobre infecções parasitárias por nematóides em lavouras é influenciada pela variabilidade das condições ambientais, o que pode impactar significativamente os resultados experimentais e a reprodutibilidade dos dados.

Desenvolvemos culturas in vitro de raízes transgênicas de batata com nematóides parasitas de plantas como uma alternativa confiável que ocupa menos espaço, requer menos tempo para obter e é livre de contaminação ou de variabilidade genética do hospedeiro.

Rastrear a progressão temporal da infecção por nematóides nas raízes das culturas continua sendo um desafio. As técnicas de coloração diferencial fornecem um método confiável para identificar locais de infecção e distinguir os estágios de vida do nematóide com precisão.

Em comparação com os testes em estufa, as raízes pesadas da batata suportam um sistema contínuo e de controle para fornecer todos os estágios de desenvolvimento do nematóide, independentemente das variações sazonais ou climáticas.

Portanto, o protocolo descrito oferece várias aplicações futuras promissoras. Por exemplo, permite estudos detalhados sobre os mecanismos moleculares e celulares de fornecer informações sobre como os nematóides parasitas de plantas infectam e manipulam os hospedeiros.

[Narrador] Para começar, lave uma cenoura em água corrente da torneira e depois com uma solução detergente comum para remover os detritos. Depois de seco com papel toalha, insira um espeto de metal esterilizado no topo da cenoura, cerca de um a dois centímetros para dentro. Com um frasco de lavagem equipado com bico, molhe a cenoura com etanol a 96%. Seque a ponta inferior da cenoura em um papel de filtro esterilizado. Em seguida, passe-o cuidadosamente por uma chama. Com um descascador estéril, descasque a cenoura de cima para baixo e repita a queima. Depois de descartar as seções superior e inferior, coloque a seção intermediária em uma placa de Petri estéril. Usando uma lâmina estéril e uma pinça, corte seções de um centímetro de espessura. Transfira as seções para placas de Petri estéreis. Depois de selar o prato, mantenha-o sob luz ultravioleta por 60 minutos de cada lado para esterilizar os discos de cenoura. Incube os discos de cenoura a 25 graus Celsius na escuridão por uma a duas semanas. Em seguida, com uma lâmina estéril, faça uma incisão em forma de X no centro do disco de cenoura, cortando apenas até a metade. Pipete 50 microlitros de suspensão de nematóides de lesão radicular contendo pelo menos 50 estágios de vida mistos na incisão. Depois de selar a placa de Petri, incube-a a 25 graus Celsius na escuridão por até três meses. Para extrair os nematóides da lesão radicular, transferir os discos de cenoura com necrose visível para uma peneira de malha de 75 micrômetros com oito centímetros de diâmetro colocada em uma tigela de vidro estéril. Em seguida, despeje a solução antibiótica sobre a peneira até que os discos estejam cobertos. Após a incubação durante a noite no escuro, use uma pipeta esterilizada para transferir os nematóides do fundo da tigela para um bloco de coloração de vidro esterilizado. Pipete um mililitro de solução antibiótica no bloco de coloração e deixe os nematóides repousarem por 30 a 40 minutos. Pipete a solução antibiótica usada e repita o processo de lavagem quatro a cinco vezes. Use a suspensão de nematóide da lesão radicular imediatamente ou armazene a 11 graus Celsius. Selecione tubérculos de batata do mesmo tamanho e descarte qualquer um com buracos, hematomas ou seções moles. Encha potes de cinco litros com uma mistura de solo de autoclave e areia e misture 22,5 gramas de fertilizante NPK de liberação lenta. Em seguida, semeie as batatas a uma profundidade de nove centímetros abaixo da superfície do solo. Coloque os vasos em uma estufa com 50 a 70% de umidade. Regue com frequência para manter a umidade do solo em 70% da capacidade máxima de retenção de água, evitando temperaturas extremas. Depois que as plantas de batata emergirem, crie quatro a seis buracos uniformemente distribuídos ao redor de cada planta para ver a profundidade. Pipete oito mililitros de suspensão contendo 30.000 nematóides vivos de lesões radiculares em estágio de vida misto nos orifícios. Em seguida, cubra os buracos com a mistura de solo. Para vasos de controle e vasos contendo nematóides de lesões radiculares, reter a rega no dia da inoculação. Após dois meses de cultivo, arranque as plantas de batata e separe os brotos e raízes para pesagem. Lave cuidadosamente o sistema radicular. Examine as raízes em busca de locais de ataque RLN usando técnicas de coloração apropriadas. Coloque os tubérculos de batata lavados e esterilizados em um recipiente. Cubra os tubérculos com uma solução de alvejante comercial a 25%. Feche o recipiente e misture por 15 minutos. Assim que o alvejante for descartado, lave os tubérculos três vezes com água da torneira esterilizada. Em seguida, em uma capela de fluxo, mergulhe os tubérculos em solução de etanol a 80% por 15 minutos com agitação vigorosa. Depois de pipetar o etanol, enxágue três vezes com água da torneira esterilizada. Com um bisturi estéril, remova as porções periféricas dos tubérculos. Divida a peça central interna em segmentos de 0,5 centímetros de espessura. Para inocular as seções, primeiro misture um mililitro de suspensão de Rhizobium rhizogenes com nove mililitros de meio SH. Mergulhe a ponta de um bisturi estéril na suspensão diluída e enrole a superfície dos gomos de batata cinco vezes. Depois que os segmentos estiverem secos, coloque-os em meio SH semi-sólido e incube a 25 graus Celsius por três dias no escuro para facilitar a transfecção do plasmídeo. No final do terceiro dia, transferir os segmentos infectados para placas contendo meio SH semi-sólido suplementado com antibióticos. Após três meses, use uma pinça estéril para coletar um aglomerado de um grama de raízes transgênicas. Transfira as raízes para o centro da placa com meio SH semi-sólido fresco sem antibióticos. Para coletar as massas de ovos de nematóides, obtenha as galhas das raízes. Use uma pinça de ponta ultrafina estéril para extrair cuidadosamente as massas de ovos sob um microscópio estéreo binocular ajustado para ampliação de 20x. Coloque as massas de ovos em uma placa de Petri coberta contendo cinco mililitros de água da torneira estéril e deixe-as eclodir por 48 horas. Em seguida, em uma capela de fluxo, pipetar cinco mililitros da suspensão J2 contendo 100 nematóides por mililitro em uma peneira de malha de 20 micrômetros. Após lavar com água da torneira estéril, mergulhe a metade inferior da peneira contendo os nematóides J2 em uma solução de peróxido de hidrogênio a 20% e misture em movimentos circulares por 15 minutos. Dispense água da torneira estéril pela peneira sobre os nematóides e repita o processo de lavagem duas vezes. Incline a peneira para que os nematóides se acumulem na borda durante a lavagem final. Em seguida, pipete um mililitro de água ultrapura estéril da borda da peneira para recuperar os nematóides. Em uma capela de fluxo, subcultive um aglomerado de um grama de raízes transgênicas de batata em placas SH com 100 nematóides estéreis. Monitore a co-cultura regularmente sob um microscópio invertido com aumento de 100x. Quando as massas de ovos se tornarem visíveis, subcultive as raízes em uma nova placa média SH. O uso de discos de cenoura resultou em um aumento médio de 100 vezes nas populações de nematóides em três meses. As plantas de batata não apresentaram sintomas visíveis sob baixo número populacional de nematóides de lesão radicular. Vários estágios de vida de Pratylenchus penetrans foram observados no córtex radicular após a coloração com fucsina ácida, indicando penetração no tecido e as lesões necróticas associadas eram claramente visíveis nas áreas infectadas. O desenvolvimento das raízes transgênicas da batata mostrou crescimento inicial da massa celular ao longo das feridas induzidas por bisturi na seção do tubérculo da batata, seguido pelo surgimento das raízes transgênicas. O crescimento sustentado das raízes foi observado no meio de cultura e os aglomerados radiculares foram transferidos com sucesso para o meio de cultura fresco para crescimento contínuo. Culturas de raízes transgênicas de batata foram infectadas com sucesso com juvenis de segundo estágio de Meloidogyne chitwoodi para estabelecer co-culturas de nematóides de plantas. Galhas radiculares contendo fêmeas adultas e massas de ovos foram observadas nas culturas infectadas. Os tecidos da galha formados por Meloidogyne chitwoodi foram visíveis após a infecção de raízes transgênicas de batata com estágios distintos de desenvolvimento e reprodução do nematoide identificáveis, incluindo a formação de massas de ovos e ovos.