In vivo Imagem de cálcio de respostas neurais induzidas pelo paladar em Drosophila adulta

Nosso laboratório usa a mosca da fruta como um organismo modelo para estudar como as informações do sabor são processadas por meio de circuitos neurais, desde a detecção de produtos químicos até o impacto no comportamento. Estamos usando este protocolo de imagem para identificar células gustativas que respondem a aminoácidos e determinar se diferentes estados internos modulam como as células gustativas respondem a esses nutrientes essenciais. Uma vantagem dessa abordagem de imagem de cálcio é que ela permite que as respostas neurais induzidas pelo paladar sejam registradas de células específicas em animais acordados, onde os estados internos permanecem intactos.

Agora podemos identificar circuitos gustativos putativos no novo conectoma cerebral completo de Drosophila e verificar a dinâmica neuronal funcional in vivo usando essa abordagem de imagem de cálcio. Para começar, coloque a mosca anestesiada sob um microscópio de dissecação. Usando uma tesoura de dissecção, remova as patas médias e traseiras na articulação tibial femoral e as quatro pernas no trocânter.

Pegue a mosca pelas asas usando uma pinça romba para posicioná-la com a cabeça acima da fenda do colo do útero da câmara de imagem, mantendo o corpo abaixo. Usando o lado cego da tesoura e a pinça romba, empurre suavemente a cabeça e o tórax simultaneamente para dentro da fenda. Quando a mosca estiver segura dentro do slot, empurre-a para trás e reposicione-a suavemente para que fique voltada para a frente da câmara.

Reúna uma pequena gota de esmalte na ponta de um palito e aplique uma camada fina para prender a cabeça da mosca à câmara de imagem. Pegue a cera com uma mão e junte uma pequena gota de cera na ponta. Usando uma pinça semi-afiada, por outro lado, pegue um palpo maxilar e puxe suavemente e segure a tromba em extensão total.

Toque a ponta da cera na câmara perto da base da tromba até que a cera comece a fluir. Mova-se para fazer contato com a base da tromba e cera até a metade da haste, evitando o contato com os sensilli labelares. Em seguida, estenda totalmente a tromba o mais reto possível.

Agora coloque as moscas montadas em uma câmara de umidade por 60 minutos para se recuperar. Remova as moscas da câmara de umidade. Usando uma pinça muito afiada, aperte as duas antenas, aperte a cutícula para criar um orifício e insira um lado da pinça afiada.

Passe a pinça sob a cutícula para removê-la da região que cobre a área de interesse do cérebro. Para lavar o cérebro exposto, adicione aproximadamente 100 microlitros de solução de hemolinfa artificial, ou AHL, na cabeça. Após a lavagem, remova o AHL, deixando uma camada fina para evitar que o cérebro seque.

Usando uma pinça afiada, remova os sacos de ar e quaisquer detritos grandes que cubram o cérebro. Para obter imagens específicas da zona subesofágica, ou SEZ, corte o esôfago na base perto da tromba e no ponto em que passa pelo cérebro, usando uma pinça muito afiada. Remova esta peça para expor a ZEE.

Sob o microscópio de dissecação, posicione a lamínula de 10 por 20 milímetros na ranhura angular da câmara de imagem. Carregue aproximadamente dois microlitros de água, ou outro controle negativo, no tubo capilar. Localize a mosca dissecada e concentre-se no labelo usando uma objetiva de campo claro de imersão em ar de 10x.

Alinhe o capilar com o labelo sob a visão 10x. Deixe a posição capilar diretamente na frente do labelo, certificando-se de que esteja próximo, mas sem se tocar. Mova o palco para centralizar a região do cérebro de interesse.

Mude para uma objetiva de imersão em água com maior ampliação, como a objetiva de 40x. Adicione aproximadamente 200 microlitros de AHL no topo do cérebro para garantir o contato com a objetiva de imersão. Mude para a potência do laser de 488 nanômetros para localizar a expressão de GCaMP na área de interesse.

Depois de coletar pelo menos cinco segundos de fluorescência de linha de base, mova manualmente o estimulador para que o capilar cubra o labelo por cinco segundos. Remova o estímulo e continue capturando o tempo que desejar. Em seguida, remova o AHL e retorne ao campo claro de 10x para confirmar se a lamínula, o estimulador e o labelo permanecem na posição correta.

Em seguida, remova a câmara de imagem e use um pano sem fiapos para remover a primeira solução do capilar. Lave a pipeta com água e pipete aproximadamente dois microlitros do próximo saborizante no tubo capilar. A mudança relativa de fluorescência em moscas Gr64f GCaMP foi significativamente maior para estimulação de sacarose em comparação com a água, demonstrando uma resposta forte e sustentada de neurônios receptores gustativos doces.

O pico relativo de fluorescência para estimulação com sacarose foi significativamente maior do que para a água. A mudança de fluorescência em moscas Gr66a GCaMP foi significativamente maior para a estimulação da cafeína do que para a água, mostrando resposta ao início e remoção da cafeína. O padrão de projeção dos terminais axônicos em moscas Gr66a foi distinto daquele de Gr64f, demonstrando a segregação anatômica dos neurônios receptores gustativos sensíveis ao amargo e ao açúcar.