4.3

Электрофорез ДНК в агарозном геле

99.3K views02:35 min

Электрофорез в агарозном геле — это метод, обычно используемый для разделения молекул ДНК по их размеру.

Агароза — полисахарид, полученный из красных водорослей — добавляется в буфер, такой как трис-ацетат ЭДТА (ТАЕ) или трис-борат ЭДТА (ТБЭ), и растворяется при нагревании.

Как правило, 1 грамм агарозы растворяют в 100 миллилитрах буфера с образованием 1% раствора агарозы, хотя в зависимости от применения можно добавлять различные количества агарозы.

Чтобы окрасить гель, в раствор агарозы часто добавляют флуоресцентный краситель, например, бромид этидия. Краситель интеркалируется между основаниями ДНК и флуоресцирует под действием ультрафиолетового излучения.

Затем раствор можно разлить по горизонтальным формочкам. В гелевую отливку вставляется гребень для создания лунок, в которые можно загрузить образцы ДНК.

Раствор агарозы оставляют в покое, чтобы он застыл в гель.

Гель состоит из связанных водородом молекул агарозы, образующих пористую матрицу, по которой движутся молекулы ДНК.

Образцы ДНК смешиваются с загрузочным буфером и загружаются в гель. Загрузочный буфер содержит глицерин, который увеличивает плотность образцов ДНК и помогает им оседать на дне скважин.

Буфер также содержит красители, такие как ксилоцианол и бромфеноловый синий, которые помогают отслеживать прогресс мигрирующих полос ДНК.

Когда электрический потенциал прикладывается по всей длине геля, отрицательно заряженная ДНК мигрирует к положительному электроду, проходя через слои агарозных пор.

Более крупные молекулы ДНК движутся по порам медленнее, чем более мелкие, что позволяет разделять молекулы в соответствии с их размером.

Размер пор зависит от концентрации агарозы в растворе. Чем выше концентрация агарозы, тем меньше размер пор, что помогает отделить более короткие фрагменты ДНК.

Под воздействием ультрафиолетового излучения окрашенные молекулы ДНК выглядят как флуоресцентные полосы. Положение полос можно сравнить с фрагментами ДНК известных размеров, называемыми лестницей ДНК.

Полосы лестницы служат ориентиром для определения размера интересующих молекул ДНК.

Overview

Loading...

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электрофорез в агарозном геле — это лабораторный метод, обычно используемый для разделения фрагментов ДНК по размеру. Однако его также можно использовать для выделения и очистки фрагментов ДНК с использованием протокола гель-экстракции.

Экстракция геля состоит из пяти основных этапов: проведение гель-электрофореза для разделения фрагментов, выделение отдельных полос, извлечение ДНК из этих полос и удаление красителя и солей из экстрагированной смеси для получения чистой ДНК.

В экспериментах по клонированию фрагменты как вставки, так и векторной ДНК получают после расщепления эндонуклеазами рестрикции. Эти фрагменты ДНК разного размера смешаны с примесями, такими как ферменты, соли и т. д., которые могут ингибировать последующую реакцию лигирования. Поэтому гель-экстракция используется для получения чистых фрагментов ДНК перед лигированием.

Чтобы подготовить гель для экстракции, используется раствор агарозы с более низким процентом (0,7-0,8%), чтобы обеспечить эффективную миграцию полос ДНК. Кроме того, для получения толстых полос ДНК, которые легко выделить, используется гелевый слепок с широкими гребешками. Затем проводят гель-электрофорез при более низком напряжении, чтобы предотвратить нагревание геля и повреждение ДНК.

После завершения гель-электрофореза ДНК, окрашенную бромистым этидием, идентифицируют, подвергая гель воздействию длинноволнового УФ-излучения в течение короткого времени. Кратковременное воздействие УФ-излучения предотвращает повреждение ДНК. Затем чистым лезвием бритвы вырезается нужная полоса.

Выделенный срез геля, содержащий интересующий фрагмент ДНК, затем обрабатывается с помощью одного из коммерчески доступных наборов для экстракции геля. Все эти наборы построены по одному и тому же основному принципу. Сначала агарозный гель растворяют в буферном растворе, содержащем соли, например йодид натрия. Затем ДНК связывают с колонкой, содержащей анионную смолу, и несколько раз промывают разбавленным спиртовым раствором для удаления примесей. Затем колонку сушат путем центрифугирования. Теперь чистую ДНК можно элюировать буфером или деионизированной водой.

Transcript

Loading...

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электрофорез в агарозном геле — это метод, обычно используемый для разделения молекул ДНК по их размеру.

Агароза — полисахарид, полученный из красных водорослей — добавляется в буфер, такой как трис-ацетат ЭДТА (ТАЕ) или трис-борат ЭДТА (ТБЭ), и растворяется при нагревании.

Как правило, 1 грамм агарозы растворяют в 100 миллилитрах буфера с образованием 1% раствора агарозы, хотя в зависимости от применения можно добавлять различные количества агарозы.

Чтобы окрасить гель, в раствор агарозы часто добавляют флуоресцентный краситель, например, бромид этидия. Краситель интеркалируется между основаниями ДНК и флуоресцирует под действием ультрафиолетового излучения.

Затем раствор можно разлить по горизонтальным формочкам. В гелевую отливку вставляется гребень для создания лунок, в которые можно загрузить образцы ДНК.

Раствор агарозы оставляют в покое, чтобы он застыл в гель.

Гель состоит из связанных водородом молекул агарозы, образующих пористую матрицу, по которой движутся молекулы ДНК.

Образцы ДНК смешиваются с загрузочным буфером и загружаются в гель. Загрузочный буфер содержит глицерин, который увеличивает плотность образцов ДНК и помогает им оседать на дне скважин.

Буфер также содержит красители, такие как ксилоцианол и бромфеноловый синий, которые помогают отслеживать прогресс мигрирующих полос ДНК.

Когда электрический потенциал прикладывается по всей длине геля, отрицательно заряженная ДНК мигрирует к положительному электроду, проходя через слои агарозных пор.

Более крупные молекулы ДНК движутся по порам медленнее, чем более мелкие, что позволяет разделять молекулы в соответствии с их размером.

Размер пор зависит от концентрации агарозы в растворе. Чем выше концентрация агарозы, тем меньше размер пор, что помогает отделить более короткие фрагменты ДНК.

Под воздействием ультрафиолетового излучения окрашенные молекулы ДНК выглядят как флуоресцентные полосы. Положение полос можно сравнить с фрагментами ДНК известных размеров, называемыми лестницей ДНК.

Полосы лестницы служат ориентиром для определения размера интересующих молекул ДНК.

Explore More Videos

DNA Agarose Gel Electrophoresis

Size Separation

Cloning Experiments

Restriction Endonucleases

Ligation Reaction

Agarose Solution

Migration Of DNA Bands

Wide combed Gel Cast

Lower Voltage Electrophoresis

Ethidium Bromide Staining

Gel Slice Isolation