16.10: Экспериментальная РНКi

РНК-интерференция (РНКi) — это клеточный механизм, который ингибирует экспрессию гена путем подавления его транскрипции или активации процесса деградации РНК. Механизм был открыт Эндрю Файром и Крейгом Мелло в 1998 году у растений. Сегодня он наблюдается почти у всех эукариот, включая простейших, мух, нематод, насекомых, паразитов и млекопитающих. Этот точный клеточный механизм подавления генов был развит в метод, который обеспечивает эффективный способ идентификации и определения функции нескольких генов без генетической модификации организма.

Применение РНКi

РНКi помогает анализировать функции генов. Например, метод РНКi помог проверить хромосомы I и III почвенной нематоды и привел к идентификации генов, участвующих в делении клеток и эмбриональном развитии. Эта технология также была успешно применена к фруктовой дрозофиле для идентификации генов, играющих важную роль в эмбриональном развитии, биохимических сигнальных каскадах и других фундаментальных клеточных процессах. В растениях кофе ген, ответственный за выработку теоброминсинтазы, был выбит с помощью конструкции РНК, в результате чего были получены растения кофе без кофеина. Исследования показывают, что малые интерферирующие РНК (миРНК) могут ингибировать инфекции, вызванные вирусом иммунодефицита человека, вирусом гепатита В и полиовирусом в культивируемых линиях клеток человека. Исследователи также успешно нейтрализовали гены, экспрессируемые респираторно-синцитиальным вирусом, ответственным за возникновение тяжелых респираторных заболеваний у младенцев и новорожденных.

Преимущества РНКi перед обычным нокаутом генов

Прежде чем открыть технологию РНКi, функцию гена анализировали путем исключения интересующего гена из генома и наблюдения за фенотипическими изменениями. В то время как нокаут генов является необратимым методом, РНКi является обратимым методом, который обеспечивает крупномасштабное подавление генов, кодирующих белки, в геноме. Более того, это точная методика, которая позволяет по-разному заглушать гены даже при наличии одной вариации нуклеотида. Следовательно, это может помочь в борьбе с доминантными мутантами, такими как некоторые онкогены. Более того, метод РНКi очень эффективен, поскольку эффекторные молекулы функционируют при низкой концентрации по сравнению с олигонуклеотидами или рибозимами, используемыми в старом методе.

РНК-интерференция, или РНК-интерференция, — это процесс, который клетки используют для подавления экспрессии генов.

В этом механизме фермент Dicer расщепляет короткую РНК шпильки на короткую интерферирующую РНК, или миРНК, длиной примерно двадцать две пары оснований.

Эта миРНК улавливается ферментным комплексом, называемым РНК-индуцированным сайленсинговым комплексом, или RISC, и преобразуется в одноцепочечную РНК во время рискованной сборки на своей целевой мРНК.

Одноцепочечная РНК может гибридизоваться с комплементарной мРНК. Фермент в комплексе RISC под названием Argonaute расщепляет мРНК-мишень. Деградация мРНК ингибирует процесс трансляции, что приводит к подавлению экспрессии генов.

РНК-интерференция используется исследователями для изучения функции различных генов, таких как APC, ген, который, как считается, участвует в развитии рака. Создается вектор, который кодирует короткую РНК-шпильку, нацеленную на определенный транскрипт мРНК.

Этот вектор может быть добавлен в клетки или организм для подавления гена. Если вектор вводится в эмбриональные стволовые клетки мышей, его последовательность интегрируется в геном хозяина, производя трансгенных мышей.

Эти мыши производят РНК из вставленной последовательности, которая складывается в шпильчатые структуры. Эти структуры распознаются механизмом РНК-интерференции в цитоплазме и расщепляются на двухцепочечную РНК.

Затем РНК встраивается в RISC в виде одноцепочечной РНК. RISC связывается с комплементарной последовательностью на мишенном транскрипте мРНК, что приводит к его деградации.

У мышей с инактивированным геном APC опухоли в толстой кишке развиваются чаще, чем у контрольных мышей с функциональным геном APC. Это указывает на то, что, вероятно, APC отвечает за подавление роста опухоли.