Эксперименты на животных проводились в соответствии с Положением и Общей рекомендацией Китайского законодательства по управлению экспериментальными животными и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Столичного медицинского университета (Ref no. AEEI-2014-052). Использовались самки мышей Balb/c в возрасте от 6 до 8 недель.
1. Подготовка клеток и животных
- За сутки до операции сбрейте волосы вокруг четвертого соска, чтобы обнажить операционную зону.
- Используйте одну руку, чтобы крепко держать мышь сзади, чтобы убедиться, что мышь не будет свободно двигаться, поверните мышь, чтобы обнажить ее брюхо перед оператором, а затем используйте другую руку, чтобы сбрить шерсть вокруг четвертых сосков с помощью электронной бритвы.
- Нанесите тонкий слой крема для эпиляции вокруг сосков на 30 - 60 с, смойте крем дистиллированной водой, а затем высушите мышку мягкой бумагой.
- В день операции соберите клетки рака молочной железы у мышей (4T1-luc2), подсчитайте количество клеток и отрегулируйте плотность клеток до 2 x 105 клеток/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS) в стерильных микроцентрифужных пробирках и держите их на льду. Для каждой мыши готовят 1 х10 4 клетки/50 мкл в шприце объемом 1 мл.
2. Ортотопическая инъекция
- Обезболивание мышей
- Вызвать анестезию. Поместите мышей в закрытый прозрачный контейнер и включите 2% газ изофлуран для обезболивания мышей примерно на 5 минут, пока они все не лягут и не заснут.
- Поддерживайте анестезию. Переложите мышей из контейнера в индивидуальные маски для анестезии, нанесите немного ветеринарной мази на их глаза, чтобы избежать сухости, держите мышей на спине, подставив соски к оператору, и дайте им продолжать вдыхать газ изофлуран в течение нескольких минут, пока не будет выполнена инъекция.
- Подтвердить успешность обезболивания можно отсутствием рефлекса отмены при защемлении пальца ноги.
- Нанесите офтальмологическую мазь на глаза мышей, чтобы предотвратить сухость глаз.
ПРИМЕЧАНИЕ В зависимости от размера контейнера и количества доступных индивидуальных масок для анестезии, группу мышей можно обезболить вместе и вводить по одной под индивидуальной анестезией.
- Эффективность инъекции
- Используйте одну руку, чтобы закрепить кожу вокруг четвертого соска пинцетом, чтобы создать приподнятый «туннель», по которому будет следовать шприц. Другой рукой держите шприц иглой вверх, чтобы ввести в кожу подкожно на расстоянии 5 - 10 мм от соска; Затем следуйте по «туннелю», пока кончик иглы не приблизится к соску, осторожно переместите кончик иглы вверх в жировую подушку молочной железы, пока ушко иглы не войдет под кончик соска, выбросьте пинцет и медленно вводите клетки.
- Немного поверните иглу вокруг иглы и медленно втяните шприц; ватным тампоном прижмите рану иглы в течение 10-20 с, чтобы убедиться в отсутствии просачивания жидкости.
- Посмотрите на четвертый сосок, чтобы убедиться в успешном уколе: можно наблюдать одну белую прозрачную плоскую сферу с соском в центре (Рисунок 1).
- Держите мышей под наркозом еще минуту, чтобы они не пришли в себя и не двигались слишком быстро, что приведет к открытию инъекционной раны и утечке опухолевых клеток.
Рисунок 1: Фотографии до и после ортотопической инъекции в жировую подушку молочной железы самок мышей Balb/c. Операция была выполнена, а снимки были сделаны в то время, когда мыши находились под анестезией изофлураном. А, до инъекции, Б, после инъекции.
