Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Abstract

Источник: Garone, M. G. et al. Преобразование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSCs) в функциональные спинальные и черепные моторные нейроны с использованием векторов PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует процедуру генерации моторных нейронов путем трансфекции человеческих iPSC с помощью транспозонной системы PiggyBac путем эктопической экспрессии факторов транскрипции, специфичных для линии.

Protocol

1. Генерация индуцируемых iPSC линий NIL и NIP

1. Клеточная трансфекция
   1. Промойте клетки PBS (Ca²⁺/Mg²⁺ free).
   2. Добавьте реагент для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) (0,35 мл для чашки диаметром 35 мм) и инкубируйте при 37 °C до тех пор, пока отдельные клетки не станут
   3. отделенный (5-10 мин).
   4. Аккуратно завершите разделение клеток, пипетируя пипеткой вверх и вниз пипеткой P1000 3-4 раза.
   5. Соберите в пробирку объемом 15 мл и добавьте PBS (Ca^2+/Mg²⁺ free) в 10 мл. Посчитайте клетки.
   6. Пеллеты 10⁶ элементов и ресуспендировать в 100 мкл буфера R (входит в комплект электропорации ячеек, см. Таблицу материалов).
   7. Добавить плазмидную ДНК для трансфекции: 4,5 мкг транспонируемого вектора (epB-Bsd-TT-NIL или epB-Bsd-TT-NIP) и 0,5 мкг плазмиды транспозазы piggyBac.
   8. Трансфект с помощью системы электропорации ячеек (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкцией производителя со следующими параметрами: напряжение 1 200 В, ширина 30 мс, 1 импульс. Семена клеток в среду iPSC человека с добавлением 10 μM Y-27632 (ингибитор ROCK, см. Таблицу материалов) в чашке с матричным покрытием толщиной 6 мм.

Materials

B27	Miltenyi Biotec	 130-093-566	Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>	Sigma-Aldrich	C3881	Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA	Biological Industries	05-710-1E	Freezing medium for human iPSCs
Dispase	Gibco	17105-041	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Basal medium for cell culture
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Commercial human iPSC line
GDNF	PreproTech	450-10	Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line	Thermo Fisher Scientific	A18945	Commercial human iPSC line
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	Chemicals for electrophysiological solutions
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 &mu;L Kit	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Cell electroporation kit
Neon Transfection System	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Cell electroporation system
Neurobasal Medium	Thermo Fisher Scientific	21103049	Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the&nbsp; need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Human iPSC culture medium
PBS Ca<sup>2+</sup>/Mg<sup>2+</sup> free	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival