Транспозон-опосредованное редактирование генов PiggyBac в ИПСК человека: процедура интеграции интересующего гена в ИПСК человека с использованием транспозонной системы PiggyBac

Published: April 30, 2023
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Abstract

Источник: Garone, M. G. et al. Преобразование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSCs) в функциональные спинальные и черепные моторные нейроны с использованием векторов PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Это видео демонстрирует процедуру генерации моторных нейронов путем трансфекции человеческих iPSC с помощью транспозонной системы PiggyBac путем эктопической экспрессии факторов транскрипции, специфичных для линии.

Protocol

1. Генерация индуцируемых iPSC линий NIL и NIP

  1. Клеточная трансфекция
    1. Промойте клетки PBS (Ca2+/Mg2+ free).
    2. Добавьте реагент для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) (0,35 мл для чашки диаметром 35 мм) и инкубируйте при 37 °C до тех пор, пока отдельные клетки не станут
    3. отделенный (5-10 мин).
    4. Аккуратно завершите разделение клеток, пипетируя пипеткой вверх и вниз пипеткой P1000 3-4 раза.
    5. Соберите в пробирку объемом 15 мл и добавьте PBS (Ca2+/Mg2+ free) в 10 мл. Посчитайте клетки.
    6. Пеллеты 106 элементов и ресуспендировать в 100 мкл буфера R (входит в комплект электропорации ячеек, см. Таблицу материалов).
    7. Добавить плазмидную ДНК для трансфекции: 4,5 мкг транспонируемого вектора (epB-Bsd-TT-NIL или epB-Bsd-TT-NIP) и 0,5 мкг плазмиды транспозазы piggyBac.
    8. Трансфект с помощью системы электропорации ячеек (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкцией производителя со следующими параметрами: напряжение 1 200 В, ширина 30 мс, 1 импульс. Семена клеток в среду iPSC человека с добавлением 10 μM Y-27632 (ингибитор ROCK, см. Таблицу материалов) в чашке с матричным покрытием толщиной 6 мм.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

B27Miltenyi Biotec 130-093-566Serum free supplement for neuronal cell maintenance
BambankerNippon GeneticsNGE-BB02Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>Sigma-AldrichC3881Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified MatrixCorning354277Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIABiological Industries05-710-1EFreezing medium for human iPSCs
DispaseGibco17105-041Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12Sigma-AldrichD6421-500MLBasal medium for cell culture
DoxycyclineSigma-AldrichD9891-1GUsed to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2UWiCellUWWC1-DS2UCommercial human iPSC line
GDNFPreproTech450-10Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC LineThermo Fisher ScientificA18945Commercial human iPSC line
HepesSigma-AldrichH4034Chemicals for electrophysiological solutions
LamininSigma-Aldrich11243217001Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAAThermo Fisher Scientific11140035Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 &mu;L KitThermo Fisher ScientificMPK10096Cell electroporation kit
Neon Transfection SystemThermo Fisher ScientificMPK5000Cell electroporation system
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the&nbsp; need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FFBiological Industries05-100-1AHuman iPSC culture medium
PBS Ca<sup>2+</sup>/Mg<sup>2+</sup> freeSigma-AldrichD8537-500MLDulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP4333-100MLPenicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
Y-27632 (ROCK inhibitor)Enzo Life SciencesALX-270-333-M005Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival

Tags

PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System

Play Video

Cite This Article
PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20983, doi: (2025).

View Video