Транспозон-опосредованное редактирование генов PiggyBac в ИПСК человека: процедура интеграции интересующего гена в ИПСК человека с использованием транспозонной системы PiggyBac
Это видео демонстрирует процедуру генерации моторных нейронов путем трансфекции человеческих iPSC с помощью транспозонной системы PiggyBac путем эктопической экспрессии факторов транскрипции, специфичных для линии.
Protocol
1. Генерация индуцируемых iPSC линий NIL и NIP
Клеточная трансфекция
Промойте клетки PBS (Ca2+/Mg2+ free).
Добавьте реагент для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) (0,35 мл для чашки диаметром 35 мм) и инкубируйте при 37 °C до тех пор, пока отдельные клетки не станут
отделенный (5-10 мин).
Аккуратно завершите разделение клеток, пипетируя пипеткой вверх и вниз пипеткой P1000 3-4 раза.
Соберите в пробирку объемом 15 мл и добавьте PBS (Ca2+/Mg2+ free) в 10 мл. Посчитайте клетки.
Пеллеты 106 элементов и ресуспендировать в 100 мкл буфера R (входит в комплект электропорации ячеек, см. Таблицу материалов).
Добавить плазмидную ДНК для трансфекции: 4,5 мкг транспонируемого вектора (epB-Bsd-TT-NIL или epB-Bsd-TT-NIP) и 0,5 мкг плазмиды транспозазы piggyBac.
Трансфект с помощью системы электропорации ячеек (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкцией производителя со следующими параметрами: напряжение 1 200 В, ширина 30 мс, 1 импульс. Семена клеток в среду iPSC человека с добавлением 10 μM Y-27632 (ингибитор ROCK, см. Таблицу материалов) в чашке с матричным покрытием толщиной 6 мм.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
B27
Miltenyi Biotec
130-093-566
Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker
Nippon Genetics
NGE-BB02
Cell freezing medium for motor neuron progenitors
CaCl<sub>2</sub>
Sigma-Aldrich
C3881
Chemicals for electrophysiological solutions
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix
Corning
354277
Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA
Biological Industries
05-710-1E
Freezing medium for human iPSCs
Dispase
Gibco
17105-041
Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12
Sigma-Aldrich
D6421-500ML
Basal medium for cell culture
Doxycycline
Sigma-Aldrich
D9891-1G
Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U
WiCell
UWWC1-DS2U
Commercial human iPSC line
GDNF
PreproTech
450-10
Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line
Thermo Fisher Scientific
A18945
Commercial human iPSC line
Hepes
Sigma-Aldrich
H4034
Chemicals for electrophysiological solutions
Laminin
Sigma-Aldrich
11243217001
Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
NEAA
Thermo Fisher Scientific
11140035
Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit
Thermo Fisher Scientific
MPK10096
Cell electroporation kit
Neon Transfection System
Thermo Fisher Scientific
MPK5000
Cell electroporation system
Neurobasal Medium
Thermo Fisher Scientific
21103049
Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
PiggyBac Transposon-Mediated Gene Editing in Human iPSCs: A Procedure to Integrate Gene of Interest in Human iPSCs Using PiggyBac Transposon System. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20983, doi: (2025).